DE3915557C2

DE3915557C2 -

Info

Publication number: DE3915557C2
Application number: DE19893915557
Authority: DE
Inventors: Toru Shinto; Masakazu Hatakeyama; Yasuhiro Minamata Kumamoto Jp Kurokawa; Jun Yokohama Kanagawa Jp Hiraki; Masahiro Tokio/Tokyo Jp Fujii
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1988-05-13
Filing date: 1989-05-12
Publication date: 1991-10-24
Also published as: JPH01287103A; DE3915557A1; GB2218429B; GB2218429A; JP2587680B2; FR2631344A1; FR2631344B1; GB8910811D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein feines Pulver von Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat [im folgenden Hyaluronsäure (Hyaluronat) abgekürzt] mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 3 bis 20 µm und ein Verfahren zur Herstellung.

Hyaluronsäure wird in tierischem Gewebe, z. B. in Gelenkschmiere, Glaskörperflüssigkeit, Nabelschnur, Knorpel, Haut, Hahnenkamm, gefunden, und sie spielt eine wichtige Rolle im Lebendkörper. Die obengenannte Hyaluronsäure ist eine hochmolekulare Verbindung. Da ihre Lösung eine gesteigerte Viskosität und Elastizität und Wasserretention aufweist, ist sie als kosmetisches Material weit verbreitet.

Bis jetzt wird die Herstellung von Hyaluronsäure (Hyaluronat) industriell durch Extrahieren aus Hahnenkamm oder durch Inkubieren von Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur Hyaluronsäureproduktion (ein Fermentationsverfahren) besitzen, durchgeführt.

Die durch die Verfahren der Extraktion oder Fermentation gewonnene Hyaluronsäure (Hyaluronat) wird durch Ultrafiltration, Dialyse, Ausfällen in einem Lösungsmittel, Behandlung mit Ionenaustauscherharz, fraktionierte Fällung, Behandlung mit Aktivkohle und dergleichen gereinigt, und anschließend wird durch Zugabe eines Lösungsmittels zu einer wäßrigen Lösung von Hyaluronsäure (Hyaluronat) ein pulveriger Niederschlag von Hyaluronsäure (Hyaluronat) gebildet und getrocknet.

Gewöhnlich wird Hyaluronsäure (Hyaluronat), das als kosmetisches Material verwendet wird, als Creme oder Milchlotion in vielen Fällen verwendet. Kürzlich wurde gefunden, daß feine Risse von gepreßten Kosmetika verhindert werden, wenn man eine kleine Menge eines feinen Pulvers von Hyaluronsäure (Hyaluronat), das durch Mahlen von Hyaluronsäure (Hyaluronat) gewonnen wurde, hinzufügt und daß keine Spannung der Haut durch gepreßte Kosmetika, die Hyaluronsäure (Hyaluronat) enthalten, auftritt. Aus dem obigen Grund wurde diese Substanz häufig in feiner Pulverform als pulveriges Kosmetikmaterial verwendet.

Bis jetzt wurde das feine Pulver der Hyaluronsäure (Hyaluronat) durch ein Trockenmahlverfahren hergestellt. natürliche hochmolekulare Substanz und bemerkenswert hygroskopisch ist, ist es jedoch bei Anwendung des Trockenmahlverfahrens sehr schwierig, ein feines Pulver von Hyaluronsäure (Hyaluronat) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 20 µm oder weniger als Pulver-Schönheitsmittel herzustellen.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten Forschungen durch, um die obengenannten Probleme zu lösen und ein feines Pulver von Hyaluronsäure (Hyaluronat) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 3,0 bis 20 µm und ein Verfahren zur Herstellung dafür zu erhalten. Das Ergebnis dieser Untersuchungen ist, daß ein feines Pulver von Hyaluronsäure (Hyaluronat) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 20 µm oder weniger leicht erhalten werden kann, wenn man Hyaluronsäure (Hyaluronat) in einem organischen Lösungsmittel, in dem Hyaluronsäure (Hyaluronat) unlöslich ist, suspendiert, und die Suspension mit einer Naßmahleinrichtung mahlt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein feines Pulver von Hyaluronsäure (Hyaluronat) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 3,0 bis 20 µm, das als pulveriges, kosmetisches Material verwendet werden kann, und ein Verfahren zur Herstellung zu schaffen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines feines Pulvers von Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat, das in jeweils an sich bekannter Weise das Suspendieren von 20 bis 400 g Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat pro Liter organisches Lösungsmittel, welches Ethylalkohol, Methylalkohol, Aceton, n-Propanol, Isopropanol, Acetonitril oder eine Mischung von zwei oder mehreren der organischen Lösungsmittel ist, das Mahlen der Suspension mit einer Naßmahlvorrichtung, die eine Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps, eine Naßmühle mit Hochgeschwindigkeitsrotation oder eine Kombination aus diesen ist, die Entfernung des organischen Lösungsmittels und das Trocknen der gemahlenen Hyaluronsäure oder des gemahlenen Natriumhyaluronats umfaßt.

Weiterhin wird durch die Erfindung ein feines Pulver aus Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat zur Verfügung gestellt, welches nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 erhältlich ist und eine durchschnittliche Teilchengröße von 3,0 bis 20 µm aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps eine Turmmühle, eine Rührtankmühle, eine Fließrohrmühle oder eine Ringmühle. Vorzugsweise ist die Naßmühle mit Hochgeschwindigkeitsrotation eine Kolloidmühle.

Hyaluronsäure (Hyaluronat), das in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird durch Extrahieren aus Hahnenkamm oder durch ein Fermentationsverfahren gewonnen.

Das letztere Verfahren umfaßt, daß ein Mikroorganismus mit der Fähigkeit, Hyaluronsäure herzustellen, wie Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus disgalactiae, Streptococcus zooepidemicus durch Schütteln oder Belüften in einem Kulturmedium, das z. B. 20 bis 30 g Dextrose, 5 g Hefeextrakt, 3 g Kaliumdihydrogenphoshat, 2 g Dikaliumphosphat, 0,1 g Natriumthiosulfat, 0,1 g Magnesiumsulfat × 7 H₂O, 0,02 g Natriumsulfit, 0,01 g Kobaltchlorid, 0,01 g Manganchlorid und 5 g eines Antischaummittels in 1 l des Kulturmediums enthält, bei Inkubationstemperaturen von 25 bis 40°C, und vorzugsweise von 30 bis 35°C, 1 bis 3 Tage bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5, und vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,0, inkubiert und die gewonnene Hyaluronsäure (Hyaluronat) in dem Kulturmedium angesammelt wird, das erhaltene Kulturmedium zentrifugiert oder filtriert wird, um Fungi zu entfernen, und die niedermolekularen Substanzen durch Ultrafiltration oder Dialyse des Filtrates entfernt werden. Anschließend wird das Filtrat, aus dem die niedermolekularen Substanzen entfernt wurden, durch fraktionierte Fällung von Cetyltrimethylammoniumbromid, anschließend mit Ionenaustauschchromatografie und mit Aktivkohle (zur Entfärbung) behandelt. Die erhaltene Lösung wird konzentriert und die konzentrierte wäßrige Lösung der gereinigten Hyaluronsäure (Hyaluronat) wird erhalten. Die pulverige Hyaluronsäure (Hyaluronat) wird durch Sprühtrocknen, Gefriertrocknen usw. erhalten. Bei einer anderen Variante wird ein wasserlösliches, organisches Lösungsmittel, wie Ethylalkohol, Methylalkohol, Aceton, Isopropanol in dem Hyaluronsäure (Hyaluronat) unlöslich ist, zu der obigen konzentrierten, wäßrigen Lösung der gereinigten Hyaluronsäure (Hyaluronat) hinzugegeben, der erhaltene Niederschlag wird abgetrennt, mit dem wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel gewaschen und getrocknet, wobei Hyaluronsäure (Hyaluronat) erhalten wird.

Die Hyaluronsäure (Hyaluronat) der vorliegenden Erfindung ist ein feines Pulver mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 3 bis 20 µm, und sie wird durch Feinmahlung der wie oben beschrieben erhaltenen Hyaluronsäure (Hyaluronat) erhalten. Wenn die durchschnittliche Teilchengröße weniger als 3 µm beträgt, dann eignet sich das Pulver nicht als Pulver-Schönheitsmittel, da die Poren der Haut durch das Pulver geschlossen werden. Wenn die durchschnittliche Teilchengröße mehr als 20 µm beträgt, dann eignet sich das Pulver ebenfalls nicht als Pulver-Schönheitsmittel, da das Pulver nicht gut auf die Haut aufgetragen werden kann.

Eine solche durchschnittliche Teilchengröße des feinen Pulvers von Hyaluronsäure (Hyaluronat) kann durch ein Lichttransmissionsverfahren gemessen werden.

Das organische Lösungsmittel, das in dem Verfahren zur Herstellung des Pulvers aus Hyaluronsäure (Hyaluronat) der vorliegenden Erfindung, in dem die Hyaluronsäure (Hyaluronat) unlöslich ist, verwendet wird, ist Ethylalkohol, Methylalkohol, Aceton, n-Propanol, Isopropanol, Acetonitril oder eine Mischung aus zwei oder mehreren der organischen Lösungsmittel. Zum Suspendieren der Hyaluronsäure (Hyaluronat) in dem organischen Lösungsmittel, in dem die obigen Hyaluronsäure (Hyaluronat) unlöslich ist, kann das getrocknete Pulver aus Hyaluronsäure (Hyaluronat) zu dem organischen Lösungsmittel hinzugegeben werden, oder die Suspension, die erhalten wird, indem man das wasserlösliche organische Lösungsmittel zu dem Niederschlag, der durch Waschen mit dem obigen wasserlöslichen organischen Lösungsmittel erhalten wurde, hinzugibt, kann als solche erfolgreich verwendet werden.

Die Menge an Hyaluronsäure (Hyaluronat), die in dem organischen Lösungsmittel suspendiert wird, beträgt 20 bis 400 g/l Suspension. Wenn die Menge an Hyaluronsäure (Hyaluronat) in der Suspension zu hoch ist, dann kann der Fall auftreten, bei dem eine durchschnittliche Teilchengröße von 20 µm oder weniger nicht erreicht werden kann. Wenn die obige Menge unzureichend ist, dann sollte festgehalten werden, daß die Gleitteile des Mahlkörpers abgenutzt werden, und die abgenutzte Teilchen in die Hyaluronsäure (Hyaluronat) als Fremdsubstanzen eingemischt werden. Aus diesem Grunde ist die Menge an Hyaluronsäure (Hyaluronat) in dem organischen Lösungsmittel durch das Ergebnis wiederholter Mahltests so festgelegt.

Das Mahlen der Suspension von Hyaluronsäure (Hyaluronat) kann durchgeführt werden, indem man mit der Mahlvorrichtung einmal, und vorzugsweise mehrere Male, drei- bis fünfmal, mahlt, um einheitlich gemahlene Hyaluronsäure (Hyaluronat) zu erhalten. Des weiteren kann das Mahlen der Suspension bei gewöhnlichen Temperaturen, und vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen, durchgeführt werden, um das Mahlen sanft durchzuführen.

Die bei der vorliegender Erfindung verwendete Naßmahlvorrichtung ist eine Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps, eine Naßmühle mit Hochgeschwindigkeitsrotation oder eine Kombination aus diesen.

Nach der Feinmahlbehandlung wird das wasserlösliche organische Lösungsmittel durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Der erhaltene Kuchen wird im Vakuum getrocknet, und ein feines Pulver von Hyaluronsäure (Hyaluronat) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 3 bis 20 µm wird erhalten.

Die Verdienste der vorliegenden Erfindung bestehen darin, daß durch Einsatz der vorliegenden Erfindung ein feines Pulver von Hyaluronsäure (Hyaluronat) mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 3 bis 20 µm leicht hergestellt werden kann.

Die folgenden Beispiele und ein Vergleichsbeispiel verdeutlichen die Erfindung näher, aber diese Beispiele werden nicht immer der praktischen Anwendung entsprechen.

Beispiel 1

Zu 2000 ml Ethylalkohol wurden 400 g eines getrockneten Pulvers (durchschnittliche Teilchengröße: 150 µm) von Natriumhyaluronat, das durch das Fermentationsverfahren hergestellt wurde, hinzugegeben. Die Mischung wurde gut gerührt und es wurde eine einheitlich suspendierte Aufschlämmung erhalten. Die Aufschlämmung wurde mittels einer Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps (Coball Mill®, Typ: MS-18) unter den folgenden Bedingungen gemahlen:

Medium:
Glas
Mediumsdurchmesser:	1 bis 1,5 mm
Umdrehungsgeschwindigkeit des Rotors:	13 m/Sek.
Zufuhrgeschwindigkeit:	500 ml/Min.
Temperatur der Aufschlämmung:	7°C beim Eintritt, 7°C beim Austritt

Die Aufschlämmung wurde fein gemahlen, indem man sie dreimal durch die Mühle zirkulieren ließ. Die feingemahlene Aufschlämmung wurde von Methylalkohol durch Absaugfiltration abgetrennt und im Vakuum getrocknet. Die Menge des erhaltenen Pulvers betrug 388 g. Die Messung der Teilchengröße mit einem Lichttransmissionsverfahren ergab eine durchschnittliche Teilchengröße von 3 µm.

Beispiel 2

In 300 l einer gereinigten, wäßrigen Lösung von Natriumhyaluronat, die durch ein Fermentationsverfahren (900 g an Natriumhyaluronat wurden erhalten) hergestellt wurde, wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,2 Mol/l gelöst. Während die Lösung kräftig gerührt wurde, wurden langsam 900 l Ethylalkohol hinzugegeben, um Natriumhyaluronat zu fällen. Nach Beendigung des Rührens und nach Abtrennung des Niederschlages durch Filtration wurden 900 l Ethylalkohol zu dem erhaltenen Niederschlag hinzugegeben, und die Mischung wurde wiederum gerührt und mit Alkohol gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Niederschlag durch Filtration abgetrennt.

Zu dem erhaltenen Niederschlag von Natriumhyaluronat wurden 30 l Ethylalkohol unter Rühren gegeben. Eine gleichmäßig gemischte Aufschlämmung wurde erhalten. Die Aufschlämmung wurde mit einer Naßmühle mit Hochgeschwindigkeitsrotation (Bockvolt Homogenizer®, Typ:100) unter den folgenden Bedingungen gemahlen:

Zwischenraum:
0,07 bis 0,08 mm
Zuführgeschwindigkeit:	10 l/Min.

Die Aufschlämmung wurde fein gemahlen, indem man sie 10 Minuten durch die Mühle zirkulieren ließ. Die feingemahlene Aufschlämmung wurde von Ethylalkohol durch Absaugfiltration getrennt und im Vakuum getrocknet. Die Menge des erhaltenen Pulvers lag bei 722 g. Messung der Teilchengröße mit dem Lichttransmissionsverfahren ergab eine durchschnittliche Teilchengröße von 8,5 µm.

Beispiel 3

Zu 300 ml Ethylalkohol wurden 5 g getrocknetes Pulver (durchschnittliche Teilchengröße 150 µm) von Natriumhyaluronat, das durch ein Fermentationsverfahren hergestellt wurde, gegeben. Die Mischung wurde gut gerührt, um eine gleichförmig gequollene Aufschlämmung zu erhalten. Die Aufschlämmung wurde mit einer Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps (HYNO-MILL, Typ: KDL) unter den folgenden Bedingungen gemahlen:

Mahlelement:
Glasperlen
Mahlelement-Durchmesser:	0,5 bis 0,75 mm
Umdrehungsgeschwindigkeit der Rührscheibe:	10 m/Sek.
Zufuhrgeschwindigkeit:	50 ml/Min.
Temperatur der Aufschlämmung:	20°C

Die Aufschlämmung wurde fein gemahlen, indem man sie mit einer perestalischen Pumpe der Mahlvorrichtung zuführte, während die Aufschlämmung mit einem magnetischen Rührer gerührt wurde.

Die feingemahlene Aufschlämmung wurde von Ethylalkohol durch Absaugfiltration getrennt und im Vakuum getrocknet. Die Menge des erhaltenen Pulvers war 4,82 g. Messung der Teilchengröße mit dem Lichttransmissionsverfahren ergab eine durchschnittliche Größe von 4,1 µm.

Beispiel 4

Zu 2000 ml Aceton wurden 400 g an getrocknetem Pulver (durchschnittliche Teilchengröße 150 µm) von Natriumhyaluronat, das durch ein Extraktionsverfahren hergestellt wurde, hinzugegeben. Die Mischung wurde gut gerührt, und es wurde eine gleichmäßig suspendierte Aufschlämmung erhalten. Die Aufschlämmung wurde gemäß der gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gemahlen, und die feingemahlene Aufschlämmung wurde von Aceton durch Absaugfiltration getrennt und im Vakuum getrocknet. Die Menge des erhaltenen Pulvers betrug 390 g. Messung der Teilchengröße durch ein Lichttransmissionsverfahren ergab eine durchschnittliche Teilchengröße von 3,5 µm.

Vergleichsbeispiel 1

20 g des gleichen, wie in Beispiel 1 verwendeten, getrockneten Pulvers (durchschnittliche Teilchengröße: 150 µm) an Natriumhyaluronat wurde in einen Kugelmühlentopf aus Aluminiumoxid mit einem Volumen von 950 ml an Aluminiumoxidkugeln gegeben und 4 Stunden lang bei 100 min^-1 in einer Trockenatmosphäre gemahlen. Messung der Teilchengröße des erhaltenen Pulvers über das Lichttransmissionsverfahren ergab eine durchschnittliche Teilchengröße von 40 µm.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines feines Pulvers von Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat, dadurch gekennzeichnet, daß es in jeweils an sich bekannter Weise das Suspendieren von 20 bis 400 g Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat pro Liter organisches Lösungsmittel, das Ethylalkohol, Methylalkohol, Aceton, n-Propanol, Isopropanol, Acetonitril oder eine Mischung von zwei oder mehreren der organischen Lösungsmittel ist, das Mahlen der Suspension mit einer Naßmahlvorrichtung, die eine Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps, eine Naßmühle mit Hochgeschwindigkeitsrotation oder eine Kombination aus diesen ist, die Entfernung des organischen Lösungsmittels und das Trocknen der gemahlenen Hyaluronsäure oder des gemahlenen Natriumhyaluronats umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mahlvorrichtung des Mediumrührtyps eine Turmmühle, eine Rührtankmühle, eine Fließrohrmühle oder eine Ringmühle ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Naßmühle mit Hochgeschwindigkeitsrotation eine Kolloidmühle ist.

4. Feines Pulver aus Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat, erhältlich nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, das eine durchschnittliche Teilchengröße von 3,0 bis 20 µm aufweist.