DE3886172T2

DE3886172T2 - Verfahren zur Herstellung von Peptidsynthonen.

Info

Publication number: DE3886172T2
Application number: DE3886172T
Authority: DE
Inventors: Robert Jacquier; Virginie Pevere; Jean Verducci
Original assignee: Rhone Poulenc Chimie SA
Current assignee: Rhodia Chimie SAS
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2008-04-30
Also published as: ATE98255T1; JPH0696593B2; US5138037A; DK224288A; FR2622890B1; JPH01135796A; EP0315494B1; DE3886172D1; EP0315494A1; FR2622890A1; DK224288D0; ES2059548T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Sie betrifft insbesondere eine neue Methode zur Herstellung von nicht racemischen Peptiden.
Aus verschiedener Fachliteratur, wie z. B. "The Peptides", Vol. 1, Academic Press, 1979 oder "Principles of peptides synthesis", Springer, 1984, ist bekannt, Peptide durch Kondensation einer Peptidkette zu synthetisieren, deren Säureterminierung aktiviert ist (E) und deren Aminterminierung mit einer weiteren Peptidkette geschützt ist (P), von der nur die Säureterminierung in Gegenwart einer organischen Base verestert ist, die es erlaubt, die EOH-Gruppe zu neutralisieren, verestert ist; die Gruppe ist in den meisten Fällen sauer, wie in den folgenden Reaktionen gezeigt ist: Aktivierung Base Kopplung
Die verwendete Base, - in welcher Form auch immer - bewirkt eine beträchtliche Racemisierung der Peptideinheiten, entweder während des Aktivierungs- oder Kopplungsvorganges.
Des weiteren ist es hinlänglich in der Peptidsynthese bekannt, daß die meisten Peptide nur in einer einzigen diastereomeren Form aktiv sind. Die Racemisierung bewirkt einen Aktivierungsverlust der nach der Kondensation erhaltenen Produkte, was sehr nachteilig ist, da die verwendeten, chiral aktiven Rohstoffe oft sehr teuer sind. Die in der pharmazeutischen Industrie verwendeten Peptide müssen aufgrund strenger analytischer Normen gereinigt werden, wenn sie während der Synthese in Form einer Diastereomerenmischung erhalten werden. Diese Reinigung ist sehr teuer.
Daher sucht man in der Industrie schon seit langem nach chemischen Verfahren, die mit den Extraktionsverfahren auf Basis von natürlichen Rohstoffen und deren Kosten konkurrieren können und durch die aktive Peptide mit einer genau bestimmten chiralen Reinheit gewonnen werden können.
So ist z. B. bekannt, Peptide zu synthetisieren, indem man die Racemisierung durch Verwendung von Aktivierungsmitteln wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Additive wie
N-Hydroxysuccinimid,
1-Hydroxybenzotriazol,
N-Hydroxynorborn-(5)-en-2,3-dicarboximid
möglichst verhindert.
Es ist im allgemeinen bekannt, Aminosäuren, deren N-Funktionen durch Urethangruppen geschützt sind, ohne beträchtliche Racemisierung mittels einer Synthesetechnik zu kondensieren, die es ermöglicht, zu einem Peptid nach und nach Aminosäuren hinzuzufügen. Wenn jedoch die Aminfunktion durch einen Acylrest substituiert (Miyazawa, Yamada und Kuwata Peptide Chemistry, 1982, 69) oder Bestandteil einer Peptidkette ist, ist der Racemisierungsgrad nicht vernachlässigbar und kann 25% betragen.
Der Racemisierungsgrad schwankt in Abhängigkeit der Aminosäuren, der Schutzgruppe, der Aktivierungsreagenzien und den Reaktionsbedingungen für den Aktivierungsprozeß; die Racemisierung kann sogar vollständig sein, wenn man eine Acylschutzgruppe verwendet.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Lösung der im bisherigen Stand der Technik bekannten Probleme. Sie ermöglicht die chemische Herstellung - ausgehend von preiswerten Rohstoffen - von Peptiden mit einer chiralen Reinheit von ≥ 99%, beispielsweise während der Kopplung von Valin mit einem weiteren Valin, die unter anderen experimentellen Bedingungen (Aktivierung mit DCC und einem Additiv oder Pivaloylchlorid und einem tertiären Amin oder BOP Cl und einem tertiären Amin) zu einer beträchtlichen Racemisierung führt.
Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß man:
- in einer ersten Stufe ein O-silyliertes Derivat (I) einer Aminosäure oder eines Peptids herstellt, deren Stickstoffunktion geschützt ist,
- in einer zweiten Stufe die O-silylierte Aminosäure oder das Peptid durch ein halogeniertes Phosphorderivat (II) (X, PIII oder PV, wobei X für Chlor oder Brom steht) aktiviert,
- in einer dritten Stufe die aktivierte Aminosäure (III) oder das Peptid auf eine Aminosäure oder ein Peptid kondensiert, deren Aminfunktion N-silyliert ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es also, jegliche Intervention von Basen, insbesondere während der Aktivierungsstufe (B) und der Kopplungsstufe (C), zu vermeiden. Sie ist insbesondere dann interessant, wenn das O-silylierte Peptid mehr als eine Aminosäure enthält.
Es ist auch aus dem Europäischen Patent 184 243 bekannt, silylierte Aminosäurederivate oder Peptide mittels Trialkylcyanosilane herzustellen und dann diese silylierten Derivate mit den aktivierten Aminosäuren oder Peptiden zu koppeln. Während der Silylierung wird Blausäure freigesetzt, so daß aufgrund deren Toxizität eine industrielle Verwendung dieses Verfahrens ausgeschlossen wird. Andererseits sind die in diesem Patent verwendeten Aktivierungsmittel nicht auf Peptidfragmente übertragbar, ohne daß eine beträchtliche Racemisierung auftritt.
Die Gesamtreaktion der vorliegenden Erfindung kann durch die folgenden Gleichungen dargestellt werden:
in denen:
- A ein Chloratom oder ein R'R''N- Gruppe darstellt, in der:
- R' ein Wasserstoffatom oder eine CnH2n+1 Alkylgruppe mit n gleich 1 bis 4,
- R'' eine CnH2n+1 Alkylgruppe mit n gleich 1 bis 4 oder eine rialkylsilylgruppe mit C1-C4-Alkylgruppen darstellt,
- und R' und R'' auch eine Alkylsilyloxyalkylidengruppe, insbesondere eine (R)&sub3;C-(OSiMe&sub3;)C=-Gruppe, bilden können, wobei R Methyl oder Trifluormethyl sein kann,
- Q ist eine der Schutzgruppen mit einer N-terminierten Aminfunktion, die nach dem bisherigen Stand der Technik (Gross und Meienhofer, The Peptides, Vol. 3, Academic Press, 1981) verwendet wurden. Als nicht begrenzendes Beispiel kann Q eine t-Butyoxycarbonylgruppe (Boc), Benzyloxycarbonylgruppe (Z), Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc), Benzoyl-, Trifluoracetyl- oder Formylgruppe sein;
- R&sub1; und R&sub7; sind ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,
- R&sub2; und R&sub8; sind einer der folgenden Substituenten: Wasserstoffatom, lineare oder verzweigte CnH2n+1 Alkenyl- oder Alkylgruppe - wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 ist - eine Benzylgruppe oder eine der Gruppen aus der folgenden, nicht einschränkenden Aufzählung:
in der Q&sub1;, Q&sub2;, Q&sub3;, Q&sub4;, Q&sub5;, Q&sub6;, Q&sub7; und Q&sub8; Schutzgruppen der Seitenketten sind, die nach den Methoden des bisherigen Stands der Technik verwendet wurden (Gross und Meienhofer, The Peptides, Vol. 3, Academic Press, 1981). Als nicht begrenzendes Beispiel kann Q&sub1; eine Benzyl-, 2-Brombenzyl- oder 2,6-Dichlorbenzylgruppe, Q&sub2; eine Benzyl- oder t-Butylgruppe, Q&sub3; eine Benzyl-, t-Butyl-, Trityl-, Acetamidomethyl- oder Benzamidomethylgruppe, Q&sub4; eine Trifluoracetyl- t-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe, Q&sub5; eine Nitro-, p-Methoxybenzolsulfonyl- oder Mesitylensulfonylgruppe, Q&sub6; ein Wasserstoffatom oder Q&sub5; und Q&sub6; auch gleichermaßen eine Adamantyloxycarbonylgruppe, Q&sub7; eine Phenacyl- Benzyloxymethyl- oder t-Butoxymethylgruppe, Q&sub8; eine Benzhydryl-, Dimethoxybenzydryl- oder Xanthydrylgruppe sein.
- R&sub3; und R&sub9; sind ein Wasserstoffatom oder eine CnH2n+1-Alkylgruppe mit n zwischen 1 und 4.
- R&sub1; kann mit R&sub2; oder R&sub7; mit R&sub8; auch eine Cyclopolymethylenkette mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen bilden; die Kohlenstoffatome, an denen sich die R&sub2;- und R&sub8;-Substituenten befinden, haben L- oder D- Konfiguration, sie sind asymetrisch (*), außer wenn R&sub2; = R&sub3; und R&sub8; = R&sub9; sind,
- x und y sind eine ganze Zahl zwischen 1 und 15,
- R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; sind ein Wasserstoffatom oder eine CnH2n+ 1-Alkylgruppe mit n zwischen 1 und 4, vorausgesetzt daß diese drei Reste nicht zugleich Wasserstoffatome darstellen,
- R&sub1;&sub0; ist eine Schutzgruppe der C-terminalen Säurefunktion und der Säurefunktionen der Seitenketten, die nach den Methoden des bisherigen Stands der Technik verwendet wurden (Gross und Meienhofer, The Peptides, Vol. 3, Academic Press, 1981). Als nicht begrenzendes Beispiel können Methyl-, Ethyl-, Phenyl-, Benzyl- oder t- Butylgruppen angeführt werden.
Das Phosphorreagenz XPIII oder V ist ein Phosphoratom aus der Gruppe der Phosphorderivate in der Oxidationsstufe III oder V oder
wobei:
- X ein Chlor- oder Bromatom und
- R eine CnH2n+1-Alkylgruppe ist, in der n einen Wert zwischen 1 und 4 besitzt, oder eine Phenylgruppe, bzw. RN eine 2-Oxo-3-oxazolidinyl-Gruppe ist,
- Z und Y sind Sauerstoff- oder Schwefelatome.
Insbesondere werden Diphenylphosphinylchlorid (Dpp-Cl) (entsprechend Formel IV, in der R = C&sub6;H&sub5;, Y = 0 und X = Cl ist) oder N, N'- bis-2-oxo-3-oxazolidinyl-phosphinylchlorid (BOP-Cl) eingesetzt.
(Formel V in der : RN=
Bei diesen Bedingungen sind die aktivierten Derivate der Formel (III) Mischanhydride der allgemeinen Formel
U entspricht hier R, und -ZR oder -NR, R, Z und Y haben die oben angegebenen Werte.
Die Silylierungsreaktion der Säurefunktion wird vorzugsweise ausgehend von einer Aminosäure oder einem Peptid mit geschützter Endfunktion durch Reaktion mit einem Silylierungsreagenz der Formel ASiR&sub4;R&sub5;R&sub6; durchgeführt, in der die Reste A, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; die gleiche Bedeutung haben wie o.a.
Die Silylierungsreaktion der Aminfunktion wird vorzugsweise ausgehend von einer Aminosäure oder einem Peptid durch Reaktion zwischen einem korrespondierenden Ester und einem Silylierungsreagenz der Formel ASiR&sub4;R&sub5;R&sub6; durchgeführt, in der die Reste A, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; die gleiche Bedeutung haben wie o.a.
Diese Silylierungsreaktionen werden gemäß dem bisher bekannten Stand der Technik durchgeführt.
Die Derivate der Aminosäure oder des Peptids werden mit dem Silylierungsreagenz in ein Lösemittel, beispielsweise ein Ether (Tetrahydrofuran), ein halogeniertes aliphatisches Lösemittel, ein Ester, ein Nitril (Acetonitril) oder ein Amid (DMF), gegeben.
Gemäß einer Ausführungsform verwendet man vorzugsweise Aminosäure- oder Peptidkonzentrationen zwischen 0,1 und 1 Mol pro Liter.
Vorzugsweise verwendet man Silylierungsreagenz-Konzentrationen im Verhältnis zur Aminosäure oder zum Peptid zwischen 1 und 3 Mol.
Für eine verbesserte Ausführungsform der Erfindung ist es gemäß der zweiten Verfahrensstufe - die daraus besteht, ein Peptid oder eine Aminosäure, deren Aminfunktion geschützt und deren Säurefunktion O-silyliert ist, mit einem organischen Phosphorderivat in Kontakt zu bringen - angebracht, unter strömender Inertgasatmosphäre, wie z. B. Stickstoff oder Argon, in einem aliphatischen oder aromatischen Lösemittel zu verfahren. Man kann alle Lösemittel verwenden, in denen die aktivierte Aminosäure oder das Peptid gelöst werden können, ohne daß sie mit dem Lösemittel oder dem Phosphorderivat reagieren. Das Lösemittel ist vorzugsweise Methylenchlorid, Chloroform, 1,2- Dichlorethan Chlorbenzol, Acetonnitril oder Tetrahydrofuran.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es ebenfalls möglich, bei der Aktivierung der Peptide oder der Aminosäuren durch das Phosphorderivat Epoxyde aus der Gruppe von 1,2-Epoxyalkanen oder Cycloalkanen zu der Lösung hinzuzugeben. Bevorzugt verwendet man 1,2-Epoxycyclopentan und 1,2-Epoxypropan. In dieser zweiten Ausführungsform der Erfindung werden bevorzugt Chloroform oder Methylenchlorid als Lösemittel verwendet. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen -10 und 30ºC.
Man verwendet vorzugsweise eine solche Menge des Phosphorreagenz, die dem Molverhältnis des genannten Reagenz zu der Aminosäure oder dem Peptid entspricht.
Die Reaktion zwischen dem Phosphorderivat und der Aminosäure oder dem Peptid wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen -15 und 30ºC durchgeführt. Man verwendet vorzugsweise eine molare Konzentration des Phosphorderivats, der Aminosäure oder des Peptids zwischen 0,01 und 0,1 Mol/l.
Gemäß der ersten Ausführungsform der zweiten erfindungsgemäßen Verfahrensstufe beträgt die Dauer der Aktivierungsreaktion vorzugsweise zwischen 30 Min. und 2 Stunden, bzw. zwischen 10 Min. und 1 Stunde gemäß der zweiten Ausführungsform der zweiten Verfahrensstufe.
In bezug auf die Kopplungsreaktion (C) ist es gemäß bisherigem Stand der Technik, z. B. dem europäischen Patent 184 243, bekannt, silylierte Derivate an die Carboxyl- oder Aminfunktion zu koppeln, aber keiner dieser Schritte beschreibt die Kopplung zwischen einem durch eine Phosphorgruppe aktivierten Derivat und einem an einer Stickstoffunktion gebundenen silylierten Derivat. Jedoch liefert diese bestimmte Kopplung ganz unerwartete Ergebnisse in bezug auf den Mangel der Racemisierung.
Die Kopplungsreaktion oder dritte Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch Zugabe vorzugsweise einer silylierten Aminverbindung zu einer Peptid- oder aktivierten Aminosäurelösung unter Schutzgasatmosphäre, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen -10 und 20ºC, durchgeführt. Vorteilhafterweise gibt man einen Metallkatalysator aus der Gruppe der Zink- oder Kupferhalogene hinzu.
Die Dauer der Kopplungsstufe liegt vorzugsweise zwischen 2 und 24 Stunden.
Eine weitere Ausführungsform besteht darin, vor der Hinzugabe der Aminoverbindung ein Additif in das Reaktionsmilieu einzubringen. Dieses Additiv kann beispielsweise, aber nicht ausschließlich aus der Gruppe von N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxynorbom-5-en-2,3-dicarboxyimid, 1-Hydroxybenzotriazol, 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-keto-1,2,3- benzotriazin ausgewählt werden. Die Additive können in Form von Cäsiumsalzen verwendet werden, entweder als Tetraalkylammoniumsalz oder als Tetraalkylphosphoniumsalz.
Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele, die keinesfalls einschränkenden Charakter haben sollen, genauer beschrieben.

BEISPIEL 1

Eine Lösung von 0,43 g (1,94 mM) Benzoyl-L-valin und 0,5 g (3,8 mM) Dimethylsilyldiethylamin in 20 ml durch Amylen stabilisiertes wasserfreies Methylenchlorid wird unter Stickstoffatmosphäre 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung im Vakuum konzentriert, ohne zu erhitzen. Die Trockenausbeute des Benzol- L-valindimethylsilylesters wird durch 70 ml Methylenchlorid wieder aufgenommen. Man gibt 0,46 g (1,81 mM) BOP-Cl hinzu, das in Suspension bleibt. Man legt für 2 Minuten ein leichtes Vakuum an und leitet dann 45 Minuten lang einen starken Stickstoffstrom durch die Reaktionsmischung. Das Dimethylsilylchlorid wird mit einem Teil des Lösungsmittels versetzt, was zu einem Abfall der Temperatur auf bis zu -15ºC führt. Die erhaltene Mischung wird mit dem Lösemittel auf 35 ml aufgefüllt (so erhält man eine 0,05 M-Lösung). Das Aktivierungsreagenz ist somit vollständig gelöst. Man fügt 0,25 g (1,81 mM) Zinkchlorid hinzu und leitet 2 Minuten lang Stickstoff hindurch. Schließlich fügt man 0,36 g (1,81 mM) N-Trimethylsilyl-L-valinmethylester, 0,304 g (3,62 mM) 1,2-Epoxycyclopentan und 73 ul (1,81 mM) Methanol hinzu und rührt 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre.
Anschließend gibt man 0,53 g (1,81 mM) des Bipeptids Bz-Val-Gly- OMe hinzu, um die Ausbeutenbestimmung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zu testen. Man wäscht drei Mal mit einer 1N-Zitronensäurelösung, dann drei Mal mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich ein Mal mit Wasser. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt.
Die Ausbeute an Bz-Val-Val-OMe und der Racemisierungsgrad (ausgedrückt in % DL) werden aus dem trockenen Rückstand der inversen HPLC - mit einer Ultrasphere Altex C18-Säule und einer Mischung von 52% CH&sub3;OH und 48% H&sub2;O als Eluierungsmittel bei einer Durchflußmenge von 1 ml/min (Detektion bei 254 nm) - bestimmt.
Ausbeute 65%, DL = 0%.

BEISPIEL 2

Man verfährt wie im Beispiel 1, aber mit einer Kopplungszeit von 24 Stunden.
Ausbeute 65%, DL = 1%.

BEISPIEL 3

Man verfährt wie im Beispiel 1, aber mit einer 0,2 M-Lösung.
Ausbeute 68%, DL = 2,5%.

BEISPIEL 4

Man verfährt wie im Beispiel 1, aber ohne Zugabe von Zinkchlorid.
Ausbeute 50%, DL = 11,7%.

BEISPIEL 5

0,43 g (1,94 mM) Benzoyl-L-valin und 0,5 g (3,8 mM) Dimethylsilyldiethylamin in 20 ml Methylenchlorid werden unter Stickstoffatmosphäre 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung im Vakuum konzentriert, ohne zu erhitzen. Die Trockenausbeute des Benzol-L-valindimethylsilylesters wird durch 70 ml CH&sub2;Cl&sub2; wieder aufgenommen. Man gibt 0,46 g (1,81 nM) BOP- Cl hinzu, legt für 2 Minuten ein leichtes Vakuum an und leitet dann 45 Minuten lang einen starken Stickstoffstrom durch die Reaktionsmischung. Das Dimethylsilylchlorid wird mit einem Teil des Lösemittels versetzt, was zu einem Abfall der Temperatur auf bis zu -15ºC führt. Die erhaltene Mischung wird mit dem Lösemittel auf 35 ml aufgefüllt (auf eine 0,05 M-Lösung). Man fügt 0,25 g (1,81 mM) wasserfreies Zinkchlorid hinzu und leitet 2 Minuten lang Stickstoff hindurch.
Schließlich gibt man 0,36 g (1,81 mM) N-Trimethylsilyl-L- prolinmethylester, 0,304 g (3,62 mM) 1,2-Epoxycyclopentan und 73-10³ ml (1,81 mM) Methanol hinzu und rührt 16 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre.
Anschließend gibt man 0,53 g (1,81 mM) des Testbipeptids Bz-Val-Gly- OMe hinzu, wäscht drei Mal mit einer 1N-Zitronensäurelösung, dann drei Mal mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich ein Mal mit Wasser. Man trocknet über Magnesiumsulfat und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt.
Die Ausbeute an Bz-Val-Val-Pro-OMe und der Racemisierungsgrad (ausgedrückt in % DL) werden aus dem trockenen Rückstand der inversen HPLC - mit einer Ultrasphere Altex C18-Säule und einer Mischung von 48% MeOH und 52% H&sub2;O als Eluierungsmittel bei einer Durchflußmenge von 1 ml/min (Detektion bei 254 nm) - bestimmt.
Ausbeute 68%, DL = 0,2%.

BEISPIEL 6

0,43 g (1,94 mM) Benzoyl-L-valin und 1 ml Hexamethyldisilazan werden in 20 ml Methylenchlorid unter Stickstoffatmosphäre 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Man engt die Lösung im Vakuum ohne zu erhitzen ein. Der Rückstand an Benzoyl-L-valintrimethylsilylester wird in 35 ml Methylenchlorid wieder aufgenommen. Man gibt nach und nach 0,304 g (3,62 mM) 1,2-Epoxycyclopentan und 0,46 g (1,81 mM) BOP-Cl hinzu. Nach 20 Minuten Rühren bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre gibt man zu der Lösung 0,25 g (1,81 mM) wasserfreies Zinkchlorid, nach weiteren 5 Minuten Rühren 0,37 g (1,81 mM) N-Trimethylsilyl-L-valinmethylester und 73·10³ ml (1,81 mM) Methanol hinzu. Der Ansatz wird 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Durchführung der bzw. die Analyse mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wird wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Ausbeute = 74% DL = 0%

BEISPIEL 6 (VERGLEICHSBEISPIEL)

Zu in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelösten 40 mg (1,81 mM) Benzoyl-L-valin werden nach und nach 0,46 mg (1,81 mM) BOP-Cl und 0,25 ml (1,81 mM) Triethylamin bei -30ºC hinzugegeben. Nach 15 Minuten Rühren bei dieser Temperatur gibt man 0,37 g (1,81 mM) Benzoyl-L-valilnmethylester und 0,25 ml (1,81 mM) Triethylamin. Der Ansatz wird langsam auf Raumtemperatur gebracht und für weitere 15 Stunden gerührt. Man wäscht 3 Mal mit 1N-Zitronensäure, 3 Mal mit einer gesättigen Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit Wasser. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt.
Ausbeute = 60% und vollständige Racemisierung.

BEISPIEL 7

0,63 g (1,94 mM) N-t-Butyloxycarbonyl-L-asparagin-P-benzylester und ein Überschuß an Hexamethyldisilazan werden in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre 2 Stunden lang gerührt. Man konzentriert die Lösung im Vakuum, ohne zu erhitzten, und nimmt den Rückstand in 36 ml Methylenchlorid wieder auf. Dann gibt man 0,304 g (3,62 mM) 1,2-Epoxycyclopentan, danach 0,46 g (1,81 mM) BOP-Cl dazu. Nach 20 Minuten Rühren bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre fügt man 0,25 g (1,81 mM) Zingchlorid hinzu. Nach 5 Minuten Rühren bei Umgebungstemperatur gibt man 0,46 g (1,81 mM) N-Trimethylsilyl-L-phenylalaninmethylester und 73·10³ ml (1,81 mM) Methanol hinzu und rührt das Ganze 16 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre bei Umgebungstemperatur.
Man wäscht 3 Mal hintereinander mit 1N-Zitronensäure, 3 Mal mit einer gesättigen Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit Wasser. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt.
Die Ausbeute an Boc-Asp(OBzl)-Phe-OMe beträgt 50%. Das Öl wurde durch sein Raman- und Massenspektrum charakterisiert.
Die Entfernung der Schutzgruppe zu Aspartame wird schließlich nach einer Methode des bisherigen Standes der Technik durchgeführt.

BEISPIEL 8

0,43 g (1,94 mM) Benzoyl-L-valin und 1 ml Hexamethyldisilazan werden in 20 ml Methylenchlorid bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre 2 Stunden lang gerührt. Man konzentriert die Lösung im Vakuum, ohne zu erhitzen. Der Rückstand an Benzoyl-L-valintrimethylsilylester wird in 35 ml Methylenchlorin wieder aufgenommen. Dazu gibt man nach und nach 0,304 g (3,62 mM) 1,2-Epoxycyclopentan und 0,43 g (1,81 mM) handelsübliches Dpp-Cl, das 2% Diphenylphosphinsäure enthält. Nach 20 Minuten Rühren bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre fügt man zu der Lösung 0,41 g (1,81 mM) trockenes Kupferbromid, nach weiteren 5 Minuten Rühren 0,36 g (1,81 mM) N-Trimethylsilyl-L-prolinmethylester und 0,304 g (3,62 mM) 1,2-Epoxycyclopentan. Schließlich rührt man 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre.
Ausbeute = 70% DL = 1,3%.

BEISPIEL 9

Man verfährt wie in Beispiel 8, aber man ersetzt das Kupferbromid durch (1,81 mM) Zinkbromid.
Ausbeute = 67% DL = 0,7%

BEISPIEL 10

Man verfährt wie im Beispiel 8, aber man verwendet trockenes Kupferiodid (1,81 mM).
Ausbeute = 82% DL = 0,9%

BEISPIEL 11

Zu einer Lösung von 3 g (18,4 mM) 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-keto- 1,2,3-benzotriazin in 20 ml destilliertem Wasser und 20 ml Ethanol gibt man nach und nach eine wäßrige Lösung von 3 g (9,2 mM) Cäsiumcarbonat. Man konzentriert die Lösung im Vakuum bis zur Trockene und der gelbe Rückstand wird durch azeotropische Behandlung getrocknet.
Ausbeute = 90%
Man verfährt wie in Beispiel 1, ausgehend von 0,43 g (1,94 mM) Benzoyl-L-vlalin und 0,43 g (1,81 mM) Dpp-Cl, aber man ersetzt die Zugabe von Zinkchlorid durch eine Zugabe von dem Cäsiumsalz des 3,4- Dihydro-3-hydroxy4-keto-1,2,3-benzotriazin. Man rührt das Ganze 15 Minuten lang unter Stickstoffatmosphäre und läßt es sich langsam bis auf 0ºC erwärmen. Man fügt danach 0,36 g (1,81 mM) N-Trimethylsilyl-L-valilnmethylester hinzu und rührt 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre.
Ausbeute quantitativ DL = 0,2%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung optisch reiner Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe ein O-silyliertes Derivat eines Peptids oder einer Aminosäure herstellt, deren Stickstoffunktion geschützt ist,

man in einer zweiten Stufe das O-silylierte Peptid oder die O-silylierte Aminosäure durch ein Phosphorderivat aktiviert (X, PIII oder V mit X gleich Chlor oder Brom),

man in einer dritten Stufe das aktivierte Peptid oder die aktivierte Aminosäure an ein Peptid oder eine Aminosäure kondensiert, deren Aminofunktion N-silyliert wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durch das Phosphorderivat aktivierte Peptid mehr als eine Aminosäure enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im Lauf der dreistufigen Synthese in Abwesenheit organischer Basen arbeitet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Phosphorderivat aus den folgenden Derivaten ausgewählt wird:

bei denen

X für Chlor oder Brom steht,

R für eine Alkylgruppe CnH2n+1 mit n zwischen eins und vier steht, eine Phenylgruppe, oder RN für eine 2-oxo-3-oxazolidinylgruppe.

Z und Y sind Sauerstoff- oder Schwefelatome.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Phosphorderivat unter dem Diphenylchlorphosphat (Dpp-Cl) und dem N,N'-Bis-2-oxo-3-oxazolidinchlorphosphat (BOPCl) ausgewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Stufe unter Inertgasfluß durchgeführt wird, in einem aliphatischen oder aromatischen Lösungsmittel.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel gewählt wird unter Methylenchlorid, Chloroform, 1,2-Dichlorethan, Chlorbenzol, Acetonitril, Tetrahydrofuran.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Stufe bevorzugt bei einer Temperatur zwischen -15 und 30ºC abläuft.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der zweiten Stufe mit einem molaren Verhältnis des Phosphorderivats zur Aminosäure oder zum Peptid arbeitet, das zwischen 0,8 und 0,95 liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der zweiten Stufe ein molares Verhältnis der Aminosäure oder des Peptids zum Lösungsmittel benutzt, das zwischen 0,01 und 0,1 Mol/Liter liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der zweiten Stufe in Gegenwart von Epoxiden gearbeitet wird, die unter den 1,2-Epoxyalkanen oder -Cycloalkanen ausgewählt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das gewählte Lösungsmittel Chloroform oder Methylenchlorid ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der dritten Stufe bevorzugt einen Katalysator hinzufügt, der unter den Zink- oder Kupferhalogeniden ausgewählt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der dritten Stufe bevorzugt ein Cäsiumsalz hinzufügt, ein Tetraalkylammoniumsalz oder ein Tetraalkylphosphoniumsalz eines Zusatzes ausgewählt unter N-Hydroxisuccinimid, N-5-Hydroxinorbornen-2,3- dicarboximid, 1-Hydroxibenzoltriazol oder 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-keto-1,2,3-benzotriazin.