DE3815581A1 - Ophthalmologische zusammensetzung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue ophthalmologische Zusammensetzung, bei deren Wirkstoff es sich um Eicosapentaensäure handelt.

Eicosapentaensäure, nachstehend als "EPA" abgekürzt, bedeutet cis-5,8, 11, 14, 17-Eicosapentaensäure der Formel

EPA ist eine bekannte, mehrfach ungesättigte Fettsäure, die in Meerestieren vorkommt und als Vorläufer für die Prostaglandin- 3- und Thromboxan-3-Familien dient. Sie unterscheidet sich von Arachidonsäure durch eine zusätzliche Doppelbindung zwischen den 17- und 18-C-Atomen.

Gegenstand der Erfindung ist eine ophthalmologische Zusammensetzung, die eine Suspension von EPA in einer wässrigen Alkylcellulose- und/oder Hydroxyalkylcelluloselösung enthält. EPA ist vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 3% und insbesondere von 1% vorhanden. Methylcellulose und Hydroxypropylcellulose sind als Alkylcellulose bzw. Hydroxyalkylcellulose bevorzugt. Bei der Celluloselösung handelt es sich vorzugsweise um eine 0,5%ige Lösung.

Die wertvollen Eigenschaften dieser ophthalmologischen Zusammensetzung der Erfindung werden durch die nachstehenden Versuche unter Anwendung von Zusammensetzungen mit einem Gehalt an Eicospentaensäure an Kaninchenaugen erläutert.

Versuche

Die Versuche wurden an männlichen, pigmentierten Chinchilla- Kaninchen mit einem Gewicht von 2,0 bis 2,5 kg durchgeführt. Sämtliche Augen wurden zu Beginn mit einer Spaltlampe untersucht. Nur Tiere ohne Anzeichen von Augenentzündungen wurden für die Untersuchung herangezogen. Die Immunisierung der pigmentierten Kaninchen wurde durch Injektion von 20 µl pyrogenfreiem Humanserumalbumin (HSA, 20%ige Lösung) in die Hornhaut beider Augen gemäß dem Morawiecki-Verfahren nach kornealer Anästhesie mit 0,4% Oxybuprocain und Sedation durch Hypnorm^R (10 mg/ml Fluanison und 0,2 mg/kg Körpergewicht Phentanylcitrat) durchgeführt.

Die Ergebnisse wurden durch Messung der Bildung von kornealen Ödemen und durch Bestimmung der Fettsäuren in kornealen Gewebe bewertet.

a) Messung der Bildung von kornealen Ödemen

Kaninchenaugen wurden mit Fettsäuresuspensionen, die unter Verwendung von 0,5% Hydroxypropylcellulose als Träger hergestellt worden waren, behandelt. Diese Suspensionen wurden unmittelbar vor den Anwendung hergestellt. Kontrollgruppen wurden nur mit dem Träger behandelt. Die Behandlung mit den Fettsäurenpräparaten, d. h. dreimal täglich Einträufeln von einem Augentropfen von 30µl in den Konjunktivalsack, wurde acht Tage nach der Immunisierung begonnen und während der Versuchsdauer fortgesetzt. Die Keratitis des Kaninchenauges wurde durch Messen der Bildung von kornealen Ödemen, von Neovaskularisation und des Auftretens von ringförmigen Leukozyteninfiltraten in die Hornhaut (Wesseley-Ring) bewertet. Diese drei Parameter von kornealer Entzündung lassen sich gut in vivo beobachten. Die klinische Beobachtung wurde in doppelter Maskierung durchgeführt, wobei die Werte von beiden Augen für die einzelnen Tiere gemittelt wurden. Das Erscheinungsbild der Hornhaut wurde durch Ermittlung der Anzahl der Tage, an denen trübe Ringe oder eine diffuse, vollständig trübe Hornhaut sichtbar waren, sowie durch Ermittlung der Anzahl der Tage, an denen die Gefäße in der Hornhaut sichtbar waren, bewertet.

Eine Haag-Streit-Spaltlampe mit einem mit zentralen Fixierungslichtern ausgestatteten Pachymeter gemäß Mishima und Hedbys wurde für diese Messungen verwendet. Für jedes Auge wurde der Mittelwert von drei Messungen genommen.

Die zentralen Hornhautdicken wurden vor der intrastromalen Injektion von HSA und 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 23 und 27 Tage danach gemessen. Für jedes Tier wurden die Unterschiede zwischen den Dickenmessungen vor und nach der intraokularen Injektion von HSA als Maß für die Ödembildung angesehen (= Hornhautdicke).

b) Bestimmung von Fettsäuren in Lipiden von Hornhautgewebe nach topischer Behandlung mit Eiscospentaensäure oder Columbinsäure

Drei Gruppen von jeweils vier Kaninchen mit nicht-entzündeten Augen erhielten an vier Tagen dreimal eine Behandlung mit einem 30 µl-Augentropen, der entweder aus dem Träger (0,5% Hydroxypropylmethylcellulose in Wasser) oder aus einer Suspension von 3% Kolumbinsäure oder 1% Eicosapentaensäure im Träger bestand. Kaninchen wurden mit einer Überdosis Penthotal am 5. Tag vier Stunden nach der letzten Dosis der topisch angewandten Eicosapentaensäure oder Columbinsäure getötet. Unter Verwendung eines 14 mm-Trepans wurden die Hornhäute aus den intakten, enukleierten Augen präpariert. Die Hornhäute wurden viermal in Kochsalzlösung gewaschen, um im analytischen Verfahren eine Kontamination mit den topisch aufgebrachten Fettsäuren zu verhindern. Bei jeder der drei Versuchstiergruppen wurden die rechten und linken Augen jeweils getrennt für die Fettsäureanalyse vereinigt.

Die vereinigten Proben wurden mit 1 Volumenteil Methanol versetzt und bis zur biochemischen Analyse bei -60°C aufbewahrt. Lipide wurden aus dem Hornhautgewebe mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (2 : 1) extrahiert.

Die Chloroformphase wurde mit einem Stickstoffstrom eingeengt, und der Rückstand wurde mit methanolischer Salzsäure zwei Stunden bei 65°C umgeestert.

Nach Extraktion mit einem Gemisch aus Hexan/Diäthyläther (50 : 50) und Eindampfen des Lösungsmittels mit einem Sickstoffstrom wurden die Fettsäureester an Siliciumdioxidsäulen mit Hexan/Diäthyläther (90 : 10) chromatographiert. Die Fettsäuremethylester wurden nach Entfernen des Lösungsmittels mit einem Stickstoffstrom durch Gas-Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein HP 5880-Gaschromatograph, der mit einem automatischen Probennehmer (7672 A, Hewlett-Packard) und einem FID- Detektor ausgerüstet war, wurden unter Einsatz einer WCOT Glaskapillarsäule (CP SIL 88, l = 25 cm, Innendruckmesser = 0,22) verwendet. Die Injektionstemperatur betrug 225°C. Der Nachweis erfolgte bei 350°C. Die Temperaturerhöhung erfolgte von 110°C bis 186°C mit 2°C/min. Die Endtemperatur wurde 10 min beibehalten.

Statistische Analyse

Die Daten wurden durch nicht-parametrische Methoden analysiert, um Annahmen über die Verteilung der verwendeten Variablen zu vermeiden. Der Vorzeichen-Rangsummen-Test nach Wilcoxon (signed-rank test) wurde auf die Mittelwerte der Dickenmessungen, die zu verschiedenen Zeitpunkten bei den behandelten und unbehandelten Tieren während der Entzündungsdauer, erhalten wurden, angewandt. Der Mann-Whitney U-Test diente zur Analyse der Dauer der Neovaskularisation und der Hornhauttrübung bei den behandelten und unbehandelten Augen zu beliebigen angegebenen Zeitpunkten. Die Signifikanz der Differenz wird für zweiseitige (tailed) Beobachtungen angegeben. p-Werte <0,05 wurden als signifikant angesehen.

Ergebnisse Nicht-behandelte Augen

Es ergab sich folgendes Keratitis-Bild bei mit Träger behandelten Augen. Eine Woche bis 10 Tage nach intrakornealer Injektion von HSA begann die Hornhauttrübung am Limbus, und etwa am 14. bis 17. Tag trat ein weißer Trübungsring, bekannt als Wesseley-Ring, auf.

Der Ring trat 1 bis 8 Tage auf. Innerhalb eines Zeitraums von zwei bis vier Tagen begann die Vaskularisation an der Hornhaut vom Limbus her, schritt etwa 22 bis 25 Tage fort und bildete sich sodann rasch zurück, wobei in sämtlichen Fällen 30 Tage nach Injektion von HSA eine klare Hornhaut gegeben war.

Sämtliche Tiere mit HSA-Injektion reagierten mit Bildung des weißen Rings und Neovaskularisation. Die pachymetrisch festgestellte Bildung von kornealen Ödemen begann etwa am 7. Tag und dauerte bis zum 30. Tag.

Mit Fettsäuren behandelte Augen

Bei mit EPA, Columbinsäure, DHGL und γ-Linolensäure behandelten Kaninchen war die Dauer der Hornhauttrübung im Vergleich zu den Kontrolltieren wesentlich kürzer. Das Gefäßwachstum war nach Behandlung mIt EPA, Columbinsäure und γ-Linolensäure signifikant verringert (Tabelle I). Diese Substanzen und DHGL hemmten auch in signifikanter Weise die korneale Ödembildung.

Die topische Anwendung von Arachidonsäure führte weder zu einer Erhöhung noch zu einer Senkung der entzündlichen Reaktion (Tabelle I).

Tabelle I

Hornhauttrübung, Wachstum von Gefäßen und Ödembildung im Verlauf von immunogener Keratitis.

Fettsäuren in Lipiden von Kornealgewebe nach topischer Behandlung mit Eicosapentaensäure oder Columbinsäure

Nach viertägiger topischer Behandlung ergaben sich bei mit EPA behandelten Tieren 1,8% EPA (20 : 5) n-3) und 2,5% von dessen Metabolit 22 : 5 n-3 in den korenalen Phospholipiden (vgl. Tabelle II).

Bei mit Columbinsäure behandelten Tieren traten 5,6% dieser Fettsäure in den kornealen Phospholipiden auf.

Nach Behandlung mit EPA und Columbinsäure nahm die Konzentration an Arachidonsäure (20 : 4 n-6) ab, und die weitere Metabolisierung von Arachidonsäure zu 22 : 4 n-6 wurde partiell gehemmt, 1,9% bzw. 2,5% 22 : 4 n-6 bei behandelten Tieren im Vergleich zu 3% bei den Kontrolltieren. Ferner gab es eine Abnahme der Konzentration an Ölsäure (18 : 1) und eine Zunahme der Konzentration an Palmitinsäure (16 : 0) in den kornealen Phospholipiden von mit EPA und Columbinsäure behandelten Tieren. Die Gesamtmenge an freien Fettsäuen betrug 4% der Menge an phospholipidgebundenen Fettsäuren. Columbinsäure und EPA traten in der freien Fettsäurefraktion auf, jedoch war die Konzentration dieser Fettsäuren wieder im Vergleich zur phospholipidgebundenen Fraktion.

Erörterung

Die Fettsäuren Columbinsäure, Eicosapentaensäure und γ-Linolensäure bewirkten eine Hemmung der Leukozyteninfiltration, Neovaskularisation und Bildung von kornealen Ödemen. In bezug auf die Neovaskularisation und kornealen Ödeme zeigte Columbinsäure die stärkste Hemmwirkung. Eicosapentaensäure war der wirksamste Inhibitor der Leukozyteninfiltration. DHGL zeigte eine signifikante Hemmung der Leukozyteninfiltration und Ödembildung, jedoch nicht der Neovaskulatisation. Die Behandlung mit Arachidonsäure ergab weder eine hemmende noch eine stimulierende Wirkung auf die Parameter der Immunkomplex-Keratitis. Nur mit Vehikel behandelte Tiere reagierten zu 100% mit Hornhauttrübung, Neovaskulatisation und Ödembildung. Das Auftreten von trüben Ringen und Neovaskularisation in der Hornhaut stimmte mit früheren Beobachtungen unter Verwendung dieses Modells von kornealer Anaphylaxe überein.

Darreichungsformen - Dosierung

Bevorzugte Darreichungsformen sind wässrige Suspensionen in Methylcellulose/Hydroxypropylcellulose mit einem Gehalt an 0,5 bis 1 Gew.-% EPA. Im allgemeinen erfolgt die Behandlung durch dreimaliges tägliches Einträufeln über zehn Tage hinweg.

Indikation

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird in sämtlichen Fällen von Augenentzündungen bei Menschen und Tieren eingesetzt.

Tabelle II

Wirkung der topischen Verabreichung von Columbinsäure (18 : 3 5, 9, 12) oder Eicosapentaensäure (20 : 5 n-3) auf die Zusammensetzung von phospholipidgebundenen und freien Fettsäuren im Hornhautgewebe von Kaninchen.

Claims (6)

1. Opththalmologische Zusammensetzung, enthaltend eine Suspension von Eicosapentaensäure in einer wässigen Alkylcellulose- und/oder Hydroxyalkylcelluloselösung.

2. Opththalmologische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Eicosapentaensäure inn einer Menge von 0,5 bis 3% vorliegt.

3. Opththalmologische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Eicosapentaensäure in einer Menge von 1% vorliegt.

4. Opththalmologische Zusammensetzung, nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Celluloselösung um eine 0,5%ige Lösung handelt.

5. Opththalmologische Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Alkylcellulose um Methylcellulose handelt.

6. Opththalmologische Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hydroxyalkylcellulose um Hydroxypropylcellulose handelt.