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Nouvelle composition ophtalmologique DESCRIPTION
La présente invention concerne une nouvelle composition ophtalmologique dont l'ingrédient actif est l'acide eicosapentaénolque.
L'expression "acide eicosapentaénoïque" (appelé ciaprès en abrégé "EPA") désigne l'acide cis-5, 8. 11, 14, 17-eicosa- pentaenolque répondant ä la formule
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L'EPA est un acide gras polyinsaturé connu provenant de la chaine alimentaire marineet servant de précurseur pour les familles de la prostaglandine-3 et du thromboxane-3. 11 diffère de l'acide arachidonique par l'introduction d'une double liaison supplémentaire entre les atomes de carbone en positions 17 et 18.
L'invention fournit une composition ophtalmologique comprenant une suspension d'EPA dans une alkyl-cellulose et/ou une hydroxyalkylcellulose en solution aqueuse. L'EPA est présent, de préférence, en une quantité de 0, 5 ä 3%, mieux encore, ä raison de 1%. La methyl-cellulose et l'hydroxypropyl-cellulose sont respectivement l'alkylcellulose et l'hydroxyalkyl-cellulose préférées et la solution de cellulose est, de préférence, une solution ä 0, 5%.
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L'intérêt de la composition ophtalmologique suivant la présente invention est illustré par l'expérimentation suivante effectuée en utilisant des compositions ophtalomologiques contenant l'acide eicosapentaenolque sur des yeux de lapins.
EXPERIMENTATION
On a effectué cette expérimentation sur des lapins chinchillas pigmentés mäles pesant 2, 0-2, 5 kg. Initialement, on a examine tous les yeux avec une lampe ä fente. Seuls les animaux ne présentant aucun signe d'inflammation oculaire ont été retenus pour 1'étude. On a procédé ä l'immunisation des lapins pigmentés par injection de 20/nul d'albumine de sérum humain exempte de pyrogènes (HSA, solution ä 20%) dans la cornée des deux yeux, suivant le procédé de Morawiecki, après anesthésie cornéenne avec de l'oxybuprocalne ä 0, 4% et sédation par"Hypnorm" (marque commerciale déposée ; fluanison 10 mg/ml et citrate de phentanyle 0, 2 mg/kg du poids du corps).
Les résultats ont été évalués en mesurant la formation d'oedème cornéen et en déterminant les acides gras présents dans les tissus cornéens. a) Mesure de la formation d'oedème corneen.
On a traité les yeux de lapins avec des suspensions d'acides gras preparées avec de l'hydroxypropyl-cellulose ä 0, 5% comme vehicule. On a préparé ces suspensions immédia- tement avant l'application. Les temoins ont été traités uniquement avec le véhicule. On a commence le traitement avec les préparations d'acides gras (une goutte oculaire de 30/ul trois fois par jour, instillée dans le sac conjonctival) huit jours après l'immunisation et on a poursuivi le traitement pendant la durée des expériences. On a évalué la kératite des yeux de lapins en mesurant la formation d'oedème cornéen, la néovascularisation et l'apparition d'une infiltration leucocytaire annulaire dans la cornée (anneau de Wesseley).
Ces trois paramètres de l'inflammation cornéenne peuvent être
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très bien observes in vivo. L'observation clinique a été organisée suivant un mode ä double masquage et, pour chaque animal, on a établi la moyenne des valeurs obtenues pour les deux yeux. On a évalué l'aspect de la cornée en comptant le nombre de jours au cours desquels des anneaux opaques ou une cornée diffuse complètement opaque étaient visibles, ainsi que le nombre de jours au cours desquels les vaisseaux étaient visibles dans la cornée.
Pour ces mesures, on a utilisé une lampe ä fente"Haag- Streit"avec un pachymètre équipé de lampes ä fixation centrale suivant Mishima et Hedbys. Pour chaque oeil, on a pris la moyenne de trois mesures.
On a mesuré l'épaisseur cornéenne centrale avant et aux 7e, 9e, 11e, 14e, 16e, 18e, 20e, 23e et 27e jours apres l'injection intrastromale de HSA. Pour chaque animal, les différences entre les mesures pachymetriques avant et après l'injection intraoculaire de HSA ont été considérées comme de
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l'oedème (= Z épaisseur cornéenne). b) Détermination des acides gras présents dans les lipides du tissu cornéen après traitement topique avec l'acide eicosa- pentaenolque ou l'acide colombinique.
On a donné, ä trois groupes de quatre lapins ayant des yeux non enflammes, trois fois par jour, pendant quatre jours, une goutte oculaire de 30 nul du véhicule (hydroxypropylmethyl cellulose ä 0, 5% dans de l'eau) ou d'une suspension
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d'acide colombinique ä 3% ou d'acide eicosapentaönolque ä 1% dans le véhicule. On a tué les lapins en utilisant une dose excessive de penthothal, le cinquième jour, quatre heures après leur avoir donné une dernière dose (par voie
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topique) d'acide eicosapentaenolque ou d'acide colombinique.
En utilisant un trépan de 14 mm, on a disséqué les cornées de l'oeil énucléé intact. On a lavé quatre fois les cornées dans une solution salée pour empecher la contamination, dans le procédé analytique, avec les acides gras appliques par voie topique. Dans chacun des trois groupes d'animaux, on a
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réuni séparément les yeux droits et gauches en vue de l'analyse des acides gras.
On a ajouté un volume de méthanol aux échantillons réunis et on les a conservés à -60oC jusqu'à l'analyse biochimique. On a extrait les lipides des tissus cornéens avec un mélange 2 : 1 de chloroforme/methanol.
On a concentré la couche de chloroforme avec un courant d'azote et on a transestérifié le résidu avec de l'acide chlorhydrique méthanolique, pendant deux heures ä 65 C.
Après extraction avec un mélange 50/50 d'hexane/éther diéthylique et évaporation du solvant avec un courant d'azote, on a soumis les esters d'acides gras ä une chromatographie sur des colonnes de silice avec un mélange 90 : 10 d'hexane/ éther diéthylique. On a soumis les esters méthyliques d'acides gras ä une analyse par chromatographie gaz/liquide après élimination du solvant avec un courant d'azote.
On a utilise un chromatographe gazeux HP 5880 équipé d'un préleveur automatique (7672 A, Hewlett-Packard) et d'un detecteur FID en utilisant une colonne capillaire en verre WCOT (CP SIL 88, longueur = 25 cm, diamètre intérieur = 0, 22) ; température d'injection 225OC, détection ä 350 C, programmation de 110 ä 186 C ä raison de 2 C/minute et maintien pendant 10 minutes ä la température finale.
Analyse statistique
On a analysé les données par des procédés non paramétriques pour éviter les hypotheses ä propos de la répartition des variables en cause. On a pratique l'essai de. classement par rangs marqués d'un signe de Wilcoxon pour les données pachymétriques moyennes obtenues ä différents moments dans les groupes trai tés et non traites au cours de la période d'inflammation et l'on s'est servi de l'essai U de Mann-Whitney pour l'analyse de la durée de la néovascularisation et de l'opacification cornéenne dans les yeux traités et non traités ä n'importe quel moment donne.
La signification de la différence est indiquée pour deux observations se suivant de près,
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les valeurs P inférieures ä 0, 05 étant considérées comme significatives.
RESULTATS
Yeux non traités
L'aspect de la kératite dans les yeux traités avec le véhicule était le suivant : Une semaine ä dix jours après l'injection intracornéenne de HSA, l'opacification de la cornée a débuté au limbe et environ aux jours 14-17, est apparu un anneau blanc d'opacification connu sous le nom d'anneau de Wesseley.
L'anneau est apparu pendant un ä huit jours. Au cours d'un intervalle de deux ä quatre jours, la vascularisation de la cornée a débuté à partir du limbe, elle s'est poursuivie ä peu près jusqu'aux jours 22-25, puis elle a régressé rapidement pour donner lieu, dans tous les cas, ä une cornée claire, 30 jours après l'injection de HSA.
Tous les animaux ayant reçu une injection de HSA ont répondu par la formation d'un anneau blanc et une néovascula- risation. La formation de l'oedème cornéen enregistrée par pachymétrie a commencé aux environs du jour 7 et a duré jusqu'au jour 30.
Yeux traités avec des acides gras.
Chez des lapins traités avec EPA, l'acide colombinique, l'acide DHGL (= acide dihomo-y-linolénique) et l'acide f- linoléique, la période d'opacification cornéenne a été nettement plus courte comparativement aux témoins. La croissance des vaisseaux a été fortement diminuée après traitement avec 1'EPA, l'acide colombinique et l'acide f-linolénique (tableau I). Ces substances, de même que l'acide DHGL ont également inhibé de façon significative la formation d'oedème cornéen.
L'application topique d'acide arachidonique n'a ni accru, ni réduit la réponse inflammatoire (tableau I).
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TABLEAU I
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<tb>
<tb> OPACITE <SEP> CORNEENNE, <SEP> CROISSANCE <SEP> DES <SEP> VAISSEAUX <SEP> ET <SEP> FORMATION <SEP> D'OEDEKEAU <SEP> COURS <SEP> DE <SEP> LA <SEP> KERATITE <SEP> IMMUNOGENE
<tb> Durée <SEP> de <SEP> 1'opacité <SEP> Durée <SEP> de <SEP> la <SEP> néovasculari- <SEP> Pachymétrie, <SEP> zone <SEP> sous <SEP> la
<tb> cornéenne <SEP> (jours). <SEP> sation <SEP> cornéenne <SEP> (jours)* <SEP> courbe <SEP> (% <SEP> comparativement
<tb> aux <SEP> témoins)
<tb> Témoins <SEP> (n=16) <SEP> 6,7¯0,5 <SEP> 7,2¯0,8 <SEP> 100 <SEP> + <SEP> 13
<tb> Acide <SEP> colombinique <SEP> 3% <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> *** <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> j <SEP> 0, <SEP> 7'* <SEP> 47 <SEP> + <SEP> 10++
<tb> (18 <SEP> :
<SEP> 2 <SEP> n-6 <SEP> trans) <SEP> (n=8)
<tb> Acide <SEP> eicosapentaénoïque <SEP> 1% <SEP> 3,3¯0,5 <SEP> *** <SEP> 4,3¯0,8* <SEP> 60¯ <SEP> 11++
<tb> (20 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> n-6) <SEP> (n=8)
<tb> Acide <SEP> dihomo-γ-linolénique <SEP> 1% <SEP> 3,9¯ <SEP> 0,5 <SEP> ** <SEP> 4,9¯0,9 <SEP> 70 <SEP> + <SEP> 15 <SEP> +
<tb> (20 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> n-6) <SEP> (n=8)
<tb> Acide <SEP> y-linoléique <SEP> 1% <SEP> 4, <SEP> 6¯0,5* <SEP> 4,8¯0,6** <SEP> 71¯12 <SEP> ++
<tb> (18 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> n-6) <SEP> (n=8)
<tb> Acide <SEP> arachidonique <SEP> 1% <SEP> 5,3¯1,0 <SEP> 6,4¯1,0 <SEP> 97 <SEP> + <SEP> 21
<tb> (20 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> n-6) <SEP> (n=8)
<tb> :
<SEP> moyenne <SEP> + <SEP> erreur <SEP> type <SEP> de <SEP> la <SEP> moyenne
<tb> La <SEP> signification <SEP> de <SEP> la <SEP> différence <SEP> vis-à-vis <SEP> des <SEP> témoins <SEP> pour <SEP> la <SEP> durée <SEP> de <SEP> l'opacité <SEP> cornéenne <SEP> et <SEP> de <SEP> la
<tb> croissance <SEP> des <SEP> vaisseaux <SEP> a <SEP> été <SEP> calculée <SEP> en <SEP> adoptant <SEP> 1'essai <SEP> U <SEP> de <SEP> Mann-Whitney
<tb> p <SEP> (0, <SEP> 05 <SEP> p <SEP> (0, <SEP> 05
<tb> ** <SEP> ++
<tb> p <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> p <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 01
<tb> p <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 002
<tb> Les <SEP> valeurs <SEP> pachymétriques <SEP> moyennes <SEP> des <SEP> témoins <SEP> et <SEP> des <SEP> animaux <SEP> traités <SEP> ä <SEP> différents <SEP> moments <SEP> au <SEP> cours <SEP> de
<tb> l'inflammation <SEP> ont <SEP> été <SEP> évaluées,
<SEP> en <SEP> ce <SEP> qui <SEP> concerne <SEP> leur <SEP> signification, <SEP> en <SEP> adoptant <SEP> l'essai <SEP> de <SEP> classement
<tb> par <SEP> rangs <SEP> marqués <SEP> d'un <SEP> signe <SEP> de <SEP> Wilcoxon.
<tb>
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Acides gras présents dans les lipides du tissu cornéen après traitement topique avec l'acide eicosapentaénolque ou l'acide colombinique.
Après un traitement topique de quatre jours, on a constaté, chez les animaux traités ä l'EPA, l'apparition de 1, 8% d'EPA (20 : 5 n-3) et de 2, 5% de son métabolite 22 : 5 n-3 dans les phospholipides cornéens (voir tableau II).
Chez les animaux traités ä l'acide colombinique, on a constaté l'apparition de 5, 6% de cet acide gras dans les phospholipides cornéens.
Après traitement ä la fois avec l'EPA et l'acide colombinique, la teneur en acide arachidonique (20 : 4 n-6) a diminué et, en outre, la métabolisation de l'acide arachidonique jusqu'à 22 : 4 n-6 a été partiellement inhibée (1, 9%, respectivement 2, 5%, 22 : 4 n-6) chez les animaux traités comparativement ä 3% chez les animaux témoins. De meme, la teneur en acide oléique (18 : 1) a diminue et la teneur en acide palmitique (16 : 0) a augmenté dans les phospholipides cornéens des animaux traites ä l'EPA et ä l'acide'colombinique.
La quantité totale d'acides gras libres était de 4% de la quantité d'acidesgras liés aux phospholipides. L'acide colombinique et l'EPA étaient présents dans la fraction d'acides gras libres, mais la teneur en acides gras de ce type était faible comparativement ä la fraction liée aux phospholipides.
DISCUSSION
Les acides gras que sont l'acide colombinique, l'acide eicosapentaenolque et l'acide y-linolenique, sont efficaces pour inhiber l'infiltration leucocytaire, la neovascularisation et la formation d'oedème cornéen. En ce qui concerne la neovascularisation et l'oedème cornéen, l'acide colombinique assure l'inhibition la plus efficace. L'acide eicosapentaenolque est l'inhibiteur le plus efficace de l'infiltration leucocytaire.
L'acide DHGL assure une importante inhibition de l'infiltration leucocytaire et de la formation d'oedème, mais non de la neovascularisation. Le traitement ä l'acide arachidonique ne
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produit ni une action inhibitrice, ni stimulante sur les paramètres de la kératite par complexes immuns.
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TABLEAU II
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<tb>
<tb> ACTION <SEP> DE <SEP> L'ADMINISTRATION <SEP> TOPIQUE <SEP> D'ACIDE <SEP> COLOMBINIQUE <SEP> (18 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 9, <SEP> 12) <SEP> OU <SEP> D'ACIDE <SEP> EICOSAPENTAENOIQUE
<tb> (20 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> n-3) <SEP> SUR <SEP> LA <SEP> COMPOSITION <SEP> DU <SEP> TISSU <SEP> CORNEEN <SEP> DE <SEP> LAPIN <SEP> EN <SEP> ACIDES <SEP> GRAS <SEP> LIBRES <SEP> ET <SEP> LIES <SEP> AUX <SEP> PHOSPHOLIPIDES
<tb> ACIDES <SEP> GRAS <SEP> COMPOSITION <SEP> DES <SEP> ACIDES <SEP> GRAS <SEP> (POIDS)
<tb> Symbole <SEP> numerique <SEP> Dénomination <SEP> habituelle <SEP> Témoins <SEP> Acide <SEP> colombinique <SEP> Acide <SEP> eicosapentaenoque
<tb> de <SEP> l'acide <SEP> gras <SEP> PL <SEP> FFA <SEP> PL <SEP> FFA <SEP> PL <SEP> FFA
<tb> 16 <SEP> :
<SEP> 0 <SEP> palmitique <SEP> 10, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 13, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 15, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> 18:0 <SEP> stéarique <SEP> 8,9 <SEP> 1,4 <SEP> 10,6 <SEP> 0,9 <SEP> 9,0 <SEP> 1,1
<tb> 18:1 <SEP> n-9 <SEP> oléique <SEP> 42,5 <SEP> 0,8 <SEP> 37,1 <SEP> 1,4 <SEP> 35,7 <SEP> 1,1
<tb> 18 <SEP> : <SEP> 2 <SEP> n-6 <SEP> linoléique <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 0
<tb> 18 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 9, <SEP> 12 <SEP> colombinique <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0
<tb> 20 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> n-6 <SEP> arachidonique <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 0
<tb> 20 <SEP> :
<SEP> 5 <SEP> n-3 <SEP> eicosapentaénolque <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> 22 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> n-6 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 0
<tb> 22 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> n-3 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> 22 <SEP> :
<SEP> 6 <SEP> n-3 <SEP> docosahexanolque <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 0
<tb> Les <SEP> valeurs <SEP> indiquées <SEP> représentent <SEP> la <SEP> moyenne <SEP> de <SEP> deux <SEP> préparations <SEP> réunies <SEP> de <SEP> tissu <SEP> cornéen, <SEP> obtenues
<tb> ä <SEP> partir <SEP> de <SEP> quatre <SEP> animaux <SEP> différents, <SEP> extraites <SEP> et <SEP> analysées <SEP> comme <SEP> décrit <SEP> dans <SEP> le <SEP> paragraphe <SEP> "méthodes",
<tb> Les <SEP> chiffres <SEP> indiquent <SEP> les <SEP> pourcentages <SEP> des <SEP> acides <SEP> gras <SEP> totaux.
<SEP> Le <SEP> symbole <SEP> numérique <SEP> désigne <SEP> la <SEP> longueur <SEP> de <SEP> chaîne <SEP> et <SEP> le <SEP> nombre <SEP> de <SEP> doubles <SEP> liaisons <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> gras, <SEP> n <SEP> désignant <SEP> l'emplacement <SEP> de <SEP> la
<tb> première <SEP> double <SEP> liaison. <SEP> (PL <SEP> acides <SEP> gras <SEP> liés <SEP> aux <SEP> phospholipides, <SEP> FFA <SEP> = <SEP> acides <SEP> gras <SEP> libres).
<tb>
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Les animaux traités uniquement avec le véhicule ont répondu ä 100% par une opacification cornéenne, une neovascularisation et un oedème. L'apparition d'anneaux opaques et de la neovascularisation dans la cornée concorde avec les observations antérieures en utilisant ce modèle d'anaphylaxie cornéenne.
PRESENTATION-POSOLOGIE
La presentation préférée comprend 0, 5 ä 1% en poids d'EPA dans une suspension aqueuse d'hydroxypropyl-cellulose/ méthyl-cellulose. La posologie habituelle comprend trois instillations par jour, pendant environ dix jours.
INDICATION
11 faut utiliser la composition suivant l'invention dans n'importe quel cas d'inflammation oculaire chez les êtres humains et/ou les animaux.