NL8801125A - Ophthalmologisch preparaat. - Google Patents

Description

ik - Ophthalmologisch preparaat -

De uitvinding heeft betrekking op een nieuw ophthalmologisch preparaat, waarvan het werkzame bestanddeel eicosapentaeenzuur is.

Met eicosapentaeenzuur, hierna afgekort als 5 "EPA" , wordt bedoeld cis-5,8,11,14,17-eicosapentaeenzuur met de formule van bijgaand formuleblad.

EPA is een bekend meervoudig onverzadigd vetzuur uit de voedselketen in zee, dat dient als een voorloper voor de prostaglandine-3- en thromoxan-3-families. Het verschilt van 10 arachidonzuur door het bezit van een extra dubbele binding tussen de koolstofatomen 17 en 18.

De uitvinding verschaft een ophthalmologisch preparaat dat een suspensie van EPA in een alkylcellulose- en/of hydroxyalkylcelluloseoplossing in water omvat. Het EPA is bij voor-15 keur aanwezig in een hoeveelheid van 0,5 tot 3%, met grotere voorkeur 1%. Het alkylcellulose en hydroxyalkylcellulose zijn bij voorkeur respectievelijk methylcellulose en hydroxypropylcellu-lose. De celluloseoplossing is bij voorkeur een 0,5% oplossing.

Het belang van dit ophthalmologische preparaat 20 volgens de uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende proeven welke zijn uitgevoerd met eicosapentaeenzuur bevattende ophthalmologische preparaten op konijneogen.

Proeven 25 De proeven werden uitgevoerd op mannelijke gepigmenteerde chinchillakonijnen met een gewicht van 2,0-2,5 kg. Alle ogen werden eerst onderzocht met een spleetlamp. Alleen dieren zonder enig teken van oogontsteking werden betrokken bij de studie. Immunisering van de gepigmenteerde konijnen werd uit-30 gevoerd door injectie van 20 μΐ pyrogeenvrij humaan serumalbumine (HSA, 20% oplossing) in de cornea van beide ogen, volgens de Morawiecki-methode, na anesthesie van de cornea met 0,4% oxybuprocaine . 880 1 125 % - 2 - Φ en kalmering door Hypnorm (fluanison 10 mg/ml en fentanylcitraat 0,2 mg/kg lichaamsgewicht).

De resultaten werden beoordeeld door meting van.de vorming van cornea-oedeem en door bepaling van de vetzuren 5 in cornea-weefsels.

a) Meting van de vorming van cornea-oedeem

Konijneogen werden behandeld met vetzuursuspensies, bereid met 0,5% hydroxypropylcellulose als drager. Deze 10 suspensies werden onmiddellijk voor toediening bereid. De controle- dieren werden alleen met de drager behandeld. De behandeling met de vetzuurpreparaten, bestaande uit het drie maal daags druppelen van een oogdruppel van 30 jil in de conjunctivale zak, werd 8 dagen na de immunisering gestart en voortgezet voor de duur van de 15 proeven. Keratitis van het konijneoog werd beoordeeld door meting van de vorming van cornea-oedeem, neovascularisatie en het optreden \an het ringvormige leukocytinfiltraat in de cornea (WesseLèy's ring). Deze drie parameters voor corneaontsteking kunnen in vivo goed worden waargenomen. De klinische observatie 20 werd dubbel blind georganiseerd en voor elk dier werden de waarden van beide ogen gemiddeld . De cornea werden beoordeeld door telling van het aantal dagen gedurende welke ondoorzichtige ringen of een diffuse volledig ondoorzichtige cornea zichtbaar waren alsmede, vanhet aantal dagen waarop vaten in.de cornea zichtbaar waren.

25 Een Haag- Streit spleetlamp met een pachymeter voorzien van centrale fixatielichten volgens Mishima en Hedbys werd voor deze metingen gebruikt. Van elk oog werd het gemiddelde van drie metingen genomen.

De dikte van het midden van de cornea werd 30 gemeten vóór en 7,9,11,14,16,18,20,23 en 27 dagen na de intrastro-male injectie met HSA. Voor elk dier werden de verschillen tussen de pachymetrie-metingen vóór en na de intraoculaire injectie met HSA beschouwd als oedeem ( -Δ corneadikte).

35 .8801125 - 3 - b) Bepaling van vetzuren in lipiden van cornea-weefsel na plaatselijke behandelingmet eicosapentaeenzuur of columbi-nezuur

Drie groepei^van 4 konijnen met niet ontstoken 5 ogen ontvingen 3 maal daags gedurende 4 dagen een oogdruppel van 30 jïl van ofwel de drager (0,5% hydroxypropylmethylcellulose in water) ofwel een suspensie van 3% eolumbinezuur of 1% eicosapentaeenzuur in de drager. De konijnen werden gedood met behulp van een overdosis penthotal op de vijfde dag 4 uur nadat een laatste 10 dosis eicosapentaeenzuur of eolumbinezuur plaatselijk was toegediend. Met behulp van een 14 mm trephaan werden de cornea's gesneden uit de intacte uitgepelde ogen. De cornea's werden 4 maal gewassen in zoutoplossing ter voorkoming van verontreiniging bij de analytische methode met plaatselijk toegediende vetzuren. Bij elk van 15 de drie groepen dieren werden de rechter- en linkerogen afzonderlijk bij elkaar gedaan voor de vetzuuranalyse.

Een volume methanol werd toegevoegd aan de bij elkaar gevoegde monsters en zij werden bewaard bij -60°C tot de biochemische analyse. Lipiden werden uit de corneaweefseis 20 geextraheerd met een mengsel, van chloroformrmethanol (2:1) .

De chloroformlaag werd geconcentreerd met een stikstofstroom en het residu werd omgeësterd met methanolisch zoutzuur ( 2 uur , 65°C).

Na extractie met een mengsel van hexaan/diethyl-25 ether 50/50 en verdamping van het oplosmiddel met een stik- stofstroom werden de vetzure esters gechromatografeerd over silica-kolommen met hexaan/diethylether 90/10. De vetzure methylesters werden geanalyseerd met gasehromatografie na verwijdering van het oplosmiddel met een stikstofstroom. Een HP5880 gaschromatograaf 30 voorzien van een automatische monsternemer (7672 A, Hewlet-Packard) en een FID-detector en een WCOT glazen capillaire kolom (CP SIL 88, 1 * 25 cm, i.d. = 0,22 ) werden gebruikt; de injectie-temperatuur bedroeg 225°C, detectie vond plaats bij 350°C, en de gaschromatograaf was geprogrammeerd van 110 tot 186°C met 2°C/min 35 en 10 min handhaving op de eindtemperatuur .

.8801125 * .-4-

Statistische analyse

De gegevens werden geanalyseerd met behulp van niet-parametrische methoden ter vermijding van aannames omtrent de verdeling van de betrokken variabelen. De Wilcoxon’s rangschikkingsproef werd toegepast voor de gemiddelde pachymetrie-5 gegevens welke verkregen werden op verschillende tijdstippen bij de behandelde en niet behandelde groepen gedurende de ontstekings-periode, en de Mann-Whitney U-proef diende voor analyse van de duur van de neovascularisatie en van de ondoorzichtigheid van de cornea bij de behandelde en onbehandelde ogen op elk gegeven tijdstip. 10 De significantie van het verschil wordt gegeven voor twee langdurige waarnemingen, waarbij P-waarden C0,05 als significant werden beschouwd.

Resultaten 15 Niet-behandelde ogen

Het verschijnen van keratitis in de met drager behandelde ogen verliep als volgt. Een week tot 10 dagen na de intracorneale injectie met HSA begon de cornea bij de limbus troebel te worden en na ongeveer 14-17 dagen verscheen een witte 20 ondoorschijnende ring, bekend als de ring van Wesselê'y.

De ring bleef 1 tot 8 dagen bestaan. Binnen een tijdsbestek van 2 tot 4 dagen begon vascularisatie van de comea vanuit de limbus, schreed voort tot ongeveer de 22e-25e dag en verdween vervolgens weer snel wat in alle gevallen leidde tot een 25 heldere cornea 30 dagen na de injectie van het HSA.

Alle met HSA geïnjecteerde dieren reageerden met de vorming van een witte ring en neovascularisatie. De vorming van cornea-oedeem , zoals bepaald met pachymetrie, begon ongeveer op de 7e dag en duurde tot de 30e dag.

30

Met vetzuren behandelde ogen

Bij konijnen die waren behandeld met EPA, colum-binezuur , DHGL enY-linoleenzuur was de periode van ondoorzichtigheid van de cornea aanzienlijk korter in vergelijking met de controles. 35 De vaatgroei werd in belangrijke mate verminderd na behandeling met .8801125 - 5 - 0 EPA, columbinezuur en Y—linoleenzuur (tabel A). Deze stoffen en DHGL remden ook in belangrijke mate de vorming van comea-oedeem. Plaatselijke toediening van arachidonzuur deed de inflammatoire respons toenemen noch afnemen (tabel A)

Tabel A

Ondoorzichtigheid van de cornea, vaatgroei en oedeemvorming tijdens immunogene keratitis -------f

Duur v.d.on- Duur v.d.neo- Pachymetrie AUC; doorzichtig- vascularisatie (% vergeleken j heid v.d. van de met de cornea(dagen)° cornea(dagen)0 ! controles)0 _:___I_

f I

Controles(n=16) j 6,7 ± 0,5 7,2 ± 0,8 100 ± 13

Columbinezuur 3% ί ; (18:2 n-6 trans) (n=8) ; 3,7 ± 0,7*** 3,7 ± 0,7** j 47 ± 10

Eicosapentaeenzuur 1% i ++ (20:5 n-6) (n=8) 1 3,3 ± 0,5*** 1 4,3 ± 0,8* 60 ± 11

Dihomo-Y -linoleenzmr + t%(20;3 n-6)(ji-=8) 3,9 ± 0,5** 4,9 ± 0,9 70 ± 15 Y-linoleenzuur 1% i (18:3 n-6)(n=8) j 4,6 ± 0,5* 4,8 ± 0,6** 71 ± 12

Arachidonzuur 1% ! (20:4 n-6) (n=8) 5,3 ±1,0 6,4 ± 1,0 97 + 21 i

AUC : Oppervlakte onder de curve 0 : gemiddelde ± SEM

Significantie van het verschil vs. controles voor de duur van de ondoorzichtigheid van de cornea en de vaatgroei werd berekend met de Mann-Whitney U-proef.

* p < 0,05 +p< 0,05 ** p < 0,01 ++p <0,01 *** p < 0,002

De gemiddelde pachymetrie-waarden van de controles en behandelde dieren op verschillende tijdstippen tijdens de ontsteking werden onderzocht op significantie met de Wilcoxon's rangschikkingsproef.

.8801125

A

i -6-.

Vetzuren in lipiden van corneaweefsel na plaatselijke behandeling met eicosapentaeenzuur of columbinezuur

Na 4 dagen plaatselijke behandeling vertoonden met EPA behandelde dieren het voorkomen van 1,8% EPA (20:5 n-3) 5 en 2,5 % van zijn metaboliet 22:5 n-3 in de fosfolipiden van de cornea (zie tabel B).

Het columbinezuur behandelde dieren vertoonden het voorkomen van 5,6% van dit vetzuur in de fosfolipiden van de cornea.

10 Na behandeling met zowel EPA als columbinezuur nam het gehalte arachidonzuur (20:4 n-6) af en werd de verdere metabolisering van arachidonzuur tot 22:4 n-6 gedeeltelijk geremd tot respectievelijk 1,9 en 2,5% 22:4 n-6' in behandelde dieren vergeleken met 3% in de controledieren. Het gehalte oliezuur (18:1) 15 nam ook af,en het gehalte palmitinezuur ( 16:0) nam toe in de fosfolipiden van de cornea van met EPA en columbinezuur behandelde dieren. De totale hoeveelheid van de vrije vetzuren was 4% van de hoeveelheid aan fosfolipiden gebonden vetzuren. Columbinezuur en EPA kwamen voor in de vrije vetzuurfractie , maar het gehalte van 20 deze vetzuren was klein vergeleken met de aan fosfolipiden gebonden fractie.

Discussie

De vetzuren columbinezuur, eicosapentaeenzuur 25 en Y-linoleenzuur waren doeltreffend in het remmen van leukocyt- infiltratie, neovascularisatie en cornea-oedeemvorming. Wat betreft de neovascularisatie en het comea-oedeem vertoonde columbinezuur de meest doeltreffende remming. Eicosapentaeenzuur was de meest doeltreffende remmer van de leukocytinfiltratie. DHGL-zuur vertoonde 30 een significante remming van de leukocytinfiltratie en oedeem- vorming,maar niet van neovascularisatie. Behandeling met arachidonzuur had noch een remmend noch een stimulerend effect op de parameters van het immuuncomplex keratitis.

.8801125 P""·' * ___^ - 7 - 1 l o ,n _ 0 <u 0

& (U HU

0 0 <D Q) 0 0 TJ ,Ο 0 ^ 0 < r---ooo-o-o ·η 4«

1 N&J ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛ P H

0 S£ o--ooaoooo . „^.g·

« nj N H H

m a> e rt 0 ” « _________ 0 0 P 0 2-. td ...............~ rl ® 0 ®

IN 0 P ι-l 0 0 O

^ "7 « 0000 p,j ^ ao to ooot».inocnoocraincn 2 ·£ m .2 ^ cjiJ mCTvLnoo<r^^iNO 000,011

C *» P 0 P« ^ ^ >00PU

0 0 .P W Q 0 0 iC U st « „ *d *00 P 0 !S μ fl 4J 0 0 0 0 -H 0 00 0

0 > eo 0 0O

& 0 (U oo 5 nn 0 Μ r-l 0 W 0 Μ .SJ >, 0 0 Ο M 0 0 0 0¾ 0 IH -rj 0 0 P 0 0 0 0 [S 0 0 0 “ S Φ o-c*<i--<t-<NO-oo * ·* ·“ tw 0 W ut 00-0000000

°0C3h «0 O

Ϊ S 2 0 0 P ,Ο /*» O g N jrj 1H n CM0 0 0 P.T300 »-^“5 0000 01-5 S & S “ „ «δ I 1 » >» -. 1°. °. °- ïi οϊ "! « 22SO^^OCOO ·ϋ»ϊ "0 Oft 1- 1- n 0 X S 0 CO N 0 0 P, — P & 0 M 0 w 0 0 00 Ϊ—Ι 0 > .......... _ _______0 0 M n. 0 0 P 0 0 0 0-Γ-10 0 0 ‘I-! Ο ·γΙ 00 >

N *0 ON

c > r^stooooooooo -P «

.5 * C λλ»»*"·'·'"'' <}J « « -H

00 mp 0-00000000 3.«wg E 0 03 ο -η . 0 w £ ^ _______________________________I i 0 ft.

0 0 ο N 0 0 0 0O0 P 0000

0 . *2 P 0 > N

«II g * <» “1 °1 ° ^ ° ° ^ ^ > 2 0 Ü H > ο a oco cMOOn-ocnoo $-«!>« 00 00 f0— <f £ 03 tJ 00 P P 0 -0 0 0 .:_____ ... ---------------------------------------------------------------------. ...-------rQ 0 0 0 0 u 0 ,0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 0 > 0 0 0 •g 2· N 0 > 0 0 0 0 0 0 O > " q 0 - J, 000 N 0^300 II I 5¾ § § § S ωS5s.

A ^ C 0 N 0 0 g g § 3^.3¾^

•j? « -S 0 0 § -5 0 & & e ο 0 a S

1 * 3 3 I 1 I I 3 s 1 a^ss

P0 > g 0 0 O 5 Ü O O

8 ? t 12 2-5-323 I S ."«

0 H O.O3O0UPIU

0*“P 0^0^0 0 0 N 0 0 > 0 0

SlüJni-j N 00 0 0 > 0 CM 0M>>

Mm n *> 0rbSOO0ll « S f τ?^ΤΤ??Τ 0 I « 00U-1 0 0000 3>g.Sfe ‘“S 'ia >.« g-g j

mni m ÖÓoóoÖooOOOCMCMCM

;g ^ O — — — — — CMCMCMCMCM Q N ft^O

. 880 1 1 2 5

Jt '** - 8 -

Dieren die alleen met de drager waren behandeld gaven alle ondoorzichtigheid, neovascularisatie en oedeem van de cornea. Het verschijnen van ondoorzichtige ringen en neovascularisatie in de cornea is in overeenstemming met eerdere observaties onder toepassing van dit model van corneaanafylaxis.

Presentatie - Posologie

Een voorkeurspresentatie bestaat uit een suspensie in water met methylcellulose/hydroxypropylcellulose van 0,5 tot 1 gew.% EPA . Een gebruikelijke posologie is 3 maal daags druppelen gedurende ongeveer 10 dagen.

Indicatie

Het preparaat volgens de uitvinding kan worden gebruikt bij elke oogontsteking bij mensen en dieren.

. 880 1 1 25

Claims (4)

1. 3. Ophthalmologisch preparaat volgens conclusie 1 of 2 waarbij het eicosapentaeenzuur aanwezig is in een hoeveelheid van 1%.
2. 4. Ophthalmologisch preparaat waarbij de celluloseoplossing een 0,5% oplossing is.
3. 5. Ophthalmologisch preparaat volgens één van de voorgaande conclusies waarbij het alkylcellulose methylcellulose is.
4. 6. Ophthalmologisch preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het hydroxyalkylcellulose hydroxypropylcellulose is. -o-o-o- .8801125