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Phenothiaziniumfarbstoffe, Verfahren zu ihrer Herstellung und
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ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft Phenothiaziniumfarbstoffe
zum Färben von medizinischem Untersuchungsmaterial.
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Die Anfärbung von medizinischem Untersuchungsmaterial, wie Gewebeschnitten,
Blut- und Knochenmarkausstrichen, erfolgt üblicherweise unter Verwendung von kationischen
Thiazinfarbstoffen und anionischen Eosinfarbstoffen. So kommen beispielsweise bei
der Romanowsky-Giemsa-Färbung die vor allem bei Blut- und Knochenmarkausstrichen
in der hämatologischen Cytologie eingesetzt wird, Azur B und Eosin zur Anwendung.
Thionin findet bei einer weiteren für die Medizin sehr wichtigen Färbemethode -
der "Neuen Papanicolaou-Färbung", die beispielsweise in wissenschaftliche Information
7, Heft 2, 1981, Seiten 95-99 beschrieben ist - Verwendung.
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Um fehlerfreie und reproduzierbare Färbeergebnisse zu erhatten, ist
es von entscheidender Bedeutung einheitliche und sehr reine Farbstoffe einzusetzen.
Die technische Herstellung des Azur B- und Thioninchlorids erfolgt ausgehend von
4-Amino-N,N-Dimethylanilin bzw. p-Phenylendiamin nach lange bekannten Verfahren,
welche jedoch zu Gemischen kationischer Thiazinfarbstoffe (Methylenblau, Azur B-,
Azur A-, Azur C- und Thioninchlorid) mit wechselnder Zusammensetzung führen. Für
die Anwendung in der medizinischen Färbetechnik müssen diese Gemische deshalb aufwendigen
Reinigungsverfahren unterzogen werden. In Stain Technology, 50, 143-147 (1975) ist
die Isolierung von Azur B in hochreiner Form mittels eines langwierigen und umständlichen
chromatographischen Verfahrens beschrieben.
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Anhand dieses Verfahrens kann Azur B nur unter großen Ausbeuteverlusten
in nur geringen Mengen und zu einem sehr hohen Preis gewonnen werden. Das gleiche
gilt für das bekannte Azur B-Eosinat, zu dessen
Herstellung man
ebenfalls von sehr reinem Azur B ausgehen muß. Das in Histochemistry (1981) 72:279-290
beschriebene Azur B-Tetrafluoroborat ist zwar leicht aus handelsüblieher, nicht
gereinigtem Azur B-ChAorid erhältlich, aber für die in der Medizin zur Anwendung
kommenden Färbemethoden nicht brauchbar, da es in Wasser nicht genügend löslich
ist.
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Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, hochreine Salze von Phenothiaziniumfarbstoffen
zur Verfügung zu stellen, welche einfach und billig herstellbar und für in der Medizin
gebräuchliche Färbemethoden brauchbar sind.
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überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Azur B-Thiocyanat und
Thioninthiocyanat in äußerst reiner Form ohne aufwendige Reinigungsoperationen hergestellt
werden können und für die oben erwähnten Färbeverfahren brauchbar sind.
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Gegenstand der Erfindung sind deshalb Phenothiaziniumfarbstoffe der
allgemeinen Formel I:
worin die Reste R Wasserstoffatome oder Methylgruppen bedeuten.
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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch a)
Oxidation von p-Phenylendiamin oder 4-Amino-N,N-diinethylanlilin in Gegenwart von
Natriumthiosulfat, b) oxidative Kupplung der erhaltenen Benzolthiosulfonsäure mit
Anilin oder N-Methylanilin und
c) Cyclisierung der erhaltenen Indaminthiosulfonsäure
zum Phenothiazinium-Zinkdoppelsalz, und ist dadurch geknnzeicnet, daß man A) zur
Herstellung der Verbindung der Formel I, worin die Reste R Methylgruppen bedeuten,
das Zinkdoppelsalz der Formel II:
worin die Reste R Methylgruppen bedeuten, in wäßriger Lösung mit Perchlorsäure umsetzt
und das ausgefallene Perchlorat in wäßriger Lösung bei erhöhter Temperatur mit Kaliumthiocyanat
umsetzt, oder B) zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, worin die Reste
R Wasserstoffatome bedeuten, das Zinkdoppelsalz der Formel II, worin die Reste R
Wasserstoffatome bedeuten in das Chlorid überführt und das erhaltene Thioninchlorid
in wäßriger Lösung bei erhöhter Temperatur mit Kaliumthiocyanat umsetzt.
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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird durch die
Formelschemata 1 bis 3 erläutert, wobei R Wasserstoffatome oder Methylgruppen bedeutet.
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Formelschema 1 Herstellung der Zink-Doppelsalze
Formelschema 2 Herstellung des Azur B - Thiocyanats
Formelschema 3 Herstellung des Thioninthiocyanats
I)ie in FormeRschema 1 wiedergegebene Herstellung der Zinkdoppelsalze
erfolgt analog dem Verfahren von A.v. Klein-Wisenberg, das in NOTE ON THE PREPARATION
OF THE THlAZ.INR DYE AZUR B BY DIRECT SYNTHESIS beschrieben ist. Durch Oxidation,
beispielsweise mit Natriumdichromat, in schwach-saurer Lösung in Anwesenheit von
Natriumthiosuifat erhält man die entsprechende Benzolthiosulfonsäure, wobei man
zur Pufferung der Lösung vorteilhafterweise Aluminiumsulfat zugibt. Durch oxidative
Kupplung der entsprechenden Benzolthiosulfonsäure mit N-Methylanilin bzw. Anilin
erhält man die Indaminthiosulfonsäure, die mit Schwcfe]säure und Zinkchlorid zum
Zinkdoppelsalz cyclisiert wird. Das Zinkdoppelsalz fällt aus und wird zur Weiterverarbeitung
isoliert.
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Zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, worin R Methylgruppen
bedeutet, wird das entsprechende Zinkchoriddope7salz durch Umsetzung mit Perchlorsäure
in das Perchlorat überführt. Vorzugsweise arbeitet man bei erhöhter Temperatur,
insbesondere bei 60 C. Die Konzentration der Perchlorsäure ist nicht entscheidend.
Das erhaltene Azur B-Perchlorat wird isoliert, es muß zur Weiterverarbeitung jedoch
nicht getrocknet werden, sondern kann in feuchtem Zustand eingesetzt werden.
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Die Umsetzung des Azur B-Perchlorats mit Kaliumthiocyanat erfolgt
bei erhöhten Temperaturen, insbesondere bei 30 bis 90 C. Vorzugsweise arbeitet man
jedoch bei 50 bis 7.00C. Das Kaliumthiocyanat kann in ffester Form oder in Form
einer wäßrigen Lösung zur Azur B-Perchloratlösung zugegeben werden und kommt vorzugsweise
im überschuß, am geeignetsten in 30-80%igem molarem Überschuß zur Anwendung. Die
Reaktionslösung rührt man dann noch 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 2 bis 4 Stunden.
Das Azur B-Thiocyanat fällt beim Abkühlen in analysenreiner Form aus.
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Zu-< TTe-stellung der Verbindung der Formel 1, worin R für Wasserstoffatome
steht, überführt man das entsprechende Zinkdoppelsalz in das Chlorid, z.B. durch
Behandlung mit Natriumcarbonat und Aussalzen mit Natriumchlorid. Dies ist die einfachste
Methode zur Herstellung des Thionin chlorids, die aber den Nachteil hat, daß das
so erhaltene Produkt aufgrund der alkagischen Reaktionshedingungen eine Reihe von
Nebenprodukten enthält und deshalb nicht für medizinische Färbeverfahren brauchbar
ist. Durch Umsetzung mit Kaliumthiocyanat unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend
beschrieben, erhält man jedoch in einfacher Weise analysenreines Thioninthiocyanat.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden zum Anfärben und Kenntlichmachen
von medizinischem Untersuchungsmaterial Verwendung. Insbesondere kann Azur B-Thi.ocyanat
für die Romanowsky-Giemsa-Färbung eingesetzt werden, we7-che bei Blut- und Knochenmarkausstrichen
in der hämatologischen Cytologie verwendet wird. Das wichtigste Anwendungsgebiet
für Thioninthiocyanat liegt in der neuen Papanicolaou-Färbung. Die erfindungsgemäßen
Verbindungen sind jedoch in Abhängigkeit vom Lösungsmittel und vom pH der Lösung
auch zum Anfärben von weiteren medizinischen Substraten brauchbar.
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Beispiel 1 ~ Herstellung des Azur B-Zinkchloriddoppelsalzes Lösungen:
I. 76 g (0,56 mol) N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin in 700 ml 1 m Salzsäure II. 350
g (2,6 mol) ZnC12 in 500 ml Wasser
III. 120 g (0,18 mol) Al2 (S04)
. 18 H20 in 200 ml Wasser IV. 150 g (o,6 mol) Na2S203 . 5 H2 in 150 ml Wasser v.
48 g (0,16 mol) Na2Cr207 . 2 H20 in 100 ml Wasser VI. 5)4 g (0,5 mol) Monomethylanilin
in 80 ml konz.
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Salzsäure VlI. 152 g (0,51 mol) Na2Cr207 . 2 H20 in 27 300 ml Wasser
VJII. 150 ml (2,5 mol) konz. H2S04 IX. 150 g (1,1 mol) ZnC12 in 150 ml Wasser Unter
Rühren werden nacheinander die Lösungen I, II und III in ein 3 l Becherglas gegeben.
Nach Zugabe der Lösung IV und V wird das Reaktionsgemisch so schnell wie möglich
allf 40°C erwärmt. Dann erfolgt die Zugabe der Lösungen VI und VII; die Reaktionstemperatur
wird innerhalb weniger Minuten auf 70 C erhöht und langsam auf 850C gesteigert.
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Nach 15 Minuten wird die Heizung entfernt und das Reaktionsgemisch
bis auf 55 C abgekühlt. Nach tropfenweiser Zugabe von konz. Schwefelsäure (Lösung
VIII) - wobei die Temperatur zwischen 50 - 55 C gehalten wird -, läßt man auf Raumtemperatur
abkühlen, saugt den Niederschlag scharf ab und verwirft das Filtrat. Das Rohprodukt
wird in 2,5 1 Wasser suspendiert, gerührt und auf 60°C erwärmt.
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Nach Filtrieren wird durch Zugabe der Lösung IX abermals Zinkchloriddoppelsalz
ausgefällt. Nach dem Abkühlen wird abgesaugt, 2mal mit kaltem Wasser gewaschen und
im Trockenschrank bei 50 C getrocknet.
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Ausbeute: 85 - 95 g (45,5 - 50,8 % der Theorie)
Beispiel
2 Herstellung des Azur B-Perchlorats 50 g (0,067 mol) des Zinkchloriddoppelsalzes
werden in 2,5 1 Wasser bei 60 C gelöst und tropfenweise mit 15 ml 60 %iger Perchlorsäure
in der Wärme versetzt. zur Vergrößerung der Kristalle wird warm digeriert über Nacht
abgekühlt. Das Azur B-Perchlorat wird abgesaugt, mit kaltem Wasser mineralsäurefrei
gewaschen und im Vakuumexsikator getrocknet.
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Ausbeute: 30 - 35 g (60,7 - 70,8 % der Theorie) Elementaranalyse C
H N S Cl ber. 48,71 4,36 11,36 8,67 9,59 gef. 48,34 4,25 11,16 8,54 9,10 #641 nm.:
87 000 1 . mol-1. cm-1 (c = 1O6mol/1 in Methanol)
Beispiel 3 Herstellung
von Azur B-Thiocyanat 50 g (0,135 mol) Azur B-Perchlorat (oder das noch feuchte
Produkt) werden in 3 1 Wasser von 600C aufgenommen und unter Rühren tropfenweise
mit einer Lösung von 19,5 g (0,2 mol) Kaliumthiocyanat in 30 ml Wasser versetzt.
Die Rcaktionslösung wird 2,5 h gerührt, der Niederschlag nach dem Abkühlen abgesaugt,
2mal mit Wasser, anschließend mit kaltem Ethanol und Äther gewaschen und getrocknet.
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Ausbeute: 40 g (90,1 % der Theorie) H]ementaranalyse C H N S ber.
58,51 4,91 17,06 19,52 gef. 58,25 4,90 16,98 19,43 #641 nm: 88 500 1 . mol-¹ . cm-¹
(c = 10 mol . 11 in Methanol) Sulfatasche c 1 % Trocknungsverlust < 1 %
B
e i s p i e l 4 Herstellung von Thionin-Thiocyanat (Phenothiazin-5-ium, 3,7-diamino-;
thiocyanat) 25 g (0,095 mol) Thioninchlorid werden in 2 1 Wasser von 60 C gelöstung
und unter Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 14,6 g (0,15 mol) Kaliumthiocyanat
in 20 ml Wasser versetzt. Die Reaktionslösung wird 2,5 Stunden gerührt. Nach dem
Abkühlen wird der Niederschlag scharf abgesaugt, mehrmals mit Wasser, anschließend
mit Ethanol und Äther sorgfältig gewaschen, getrocknet.
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Ausbeute: 25 g (92,1 % der Theorie) Elementaranalyse C H N S ber.
54,52 3,52 19,57 22,39 gef. 54,32- 3,47 19,48 22,05 #599 nm = 89 000 1 . mol-¹ .
cm-¹ 599 nm -(c = 10 mol/l in Ethanol)