DE3246135A1

DE3246135A1 - Kristallines (gamma)-bestatin und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3246135A1
Application number: DE19823246135
Authority: DE
Inventors: Masaaki Tokyo Ishizuka; Tetsushi Yono Saitama Saino; Terukatsu Ohmiya Saitama Sakurai; Takashi Terada; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1981-12-24
Filing date: 1982-12-14
Publication date: 1983-07-07
Anticipated expiration: 2002-12-15
Also published as: SE8207338L; DK236690D0; IT1155439B; SE8207338D0; CH652727A5; HU187831B; US4786754A; FR2518989B1; GB2111991A; JPS58110553A; ES8602618A1; DK161972C; DK161972B; ES8405855A1; ES518517A0; CS236866B2; DK161094C; ES530642A0; DK161094B; FR2518989A1

Description

0 O O *
O

β ο

Beschreibung

Vorliegende Erfindung betrifft kristallines -^-Bestatin j. sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Bestatin oder (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin ist eine außerordentlich wenig toxische Substanz, die von H.Umezawa et al. aus einem Kulturfiltrat von •_n Streptomyces olivoreticuli isoliert wurde und die ein Inhibitor für Aminopeptidase ist (siehe US-PS 4 052 449 und japanische Offenlegungsschrift Nr. 7187/1976). Ferner wurde festgestellt, daß Bestatin eine steigernde Wirkung auf eine Immunitätsreaktion, beispielsweise eine verzögerte Über-

. _ empfindlichkeit, entfaltet, den Abwehrmechanismus eines ο

lebenden Körpers aktiviert und dadurch eine das Krebswachstum hemmende Wirkung zeigt (siehe japanische Offenlegungsschrift Nr. 117435/1977) und deshalb als ein vorteilhaftes pharmazeutisches Mittel angewendet werden kann.

Bekannte Verfahren zur Herstellung von Bestatin sind ein Fermentationsverfahren, das in US-PS 4 052 449 beschrieben wird, sowie chemische Syntheseverfahren, wie sie z.B. in US-PS 4 189 604 (siehe auch japanische Offenlegungsschrift 1 36 118/1977) und US-PS 42 81 180 (siehe auch japanische Offenlegungsschrift Nr. 79353/1980) beschrieben werden.

Im Verlaufe von Untersuchungen zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln mit einem Gehalt an Bestatin, das nach dem in Beispiel 19 der oben genannten US-PS 4 281 180 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, wurde festgestellt, daß Bestatin wegen seiner hygroskopischen Eigenschaften schwierig zu handhaben ist. Aufgrund von Versuchen wurde festgestellt, daß die hygroskopischen

Eigenschaften des Bestatin auf das Vorliegen hygroskopischer ο ο

Bestatinkristalle (im folgenden als ß-Kristalle bzw. Kristalle in ß-Form bezeichnet) zurückzuführen ist und daß diese ß-Kristalle beim Stehen an der Luft in eine nicht hygroskopische Dihydrat-Kristallform umgewandelt werden (im folgenden als c(--Kristalle bzw. Kristalle in af-Form bezeichnet), und zwar durch Absorption von Wasser, und daß sowohl die (X-Kr istallf orm als auch die ß-Kr istallf orm beim Suspendieren oder Kneten mit einem bestimmten Lösungsmittel in eine wasserfreie, nicht hygroskopische, besonders stabile Kristallform umgewandelt wird, die ein spezifisches Röntgenbeugungsmuster aufweist (nachfolgend wird diese erfindungsgemäße Kristallform des Bestatin als ^»-Kristallform bezeichnet ) .

Dementsprechend liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Bestatin in eine stabile Kristallform überzuführen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein kristallines ^-Bestatin, daß das folgende spezifische Röntgenbeugungsmuster aufweist:

ä (A)

27_f59 0,23

13,80 l_;00

6,86 0.08

5,57 0,03

5,47 0,0 3

5,09 0,02

4,79 0,02

4,55 0,28

4,41 ·. 0,0 3

' ⁽

3,78 0,03

3,43 0,04

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem ^-Bestatin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

,_ a) hygroskopische Bestatinkristalle und/oder ein entsprechendes Hydrat derselben auf eine Temperatur im Bereich von 148 C bis zum Schmelzpunkt des Bestatin erhitzt werden,oder

b) hygroskopische Bestatinkristalle und/oder ein entsprechendes Hydrat derselben in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus der Gruppe Aceton, Methylethylketon, Diethylketon, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Dioxan, Isopropylalkohol und wässriges Methanol, suspendiert oder geknetet werden.

Die ^-Bestatinkristalle gemäß dieser Erfindung sind nicht hygroskopisch, enthalten kein Kristallisationswasser und sind in einem solchen Maße stabil, daß die Kristalle keiner Gewichtsänderung unterliegen, wenn sie hochfeuchten Bedingungen oder einem Erwärmen ausgesetzt werden. Diese /»-Kristalle können daher außerordentlich leicht bei der Herstellung pharmazeutischer Mittel mit einem Gehalt an Bestatin gehandhabt werden.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen weiter erläutert. Es zeigen:

Figur 1 ein Röntgenbeugungsmuster der ^-Form von erfindungsgemäßen Bestatinkristallen und

Figur 2 ein Differentialthermogram von kristallinem ^-Bestatin gemäß vorliegender Erfindung.

Das kristall ine γ-Bestatin zeigt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

1. Bei der' Röntgenbeugung zeigt das kristalline ^-Bestatin ein spezifisches Röntgenbeugungsmuster, das in Tabelle I

und in Figur 1 anhand von gemessenen Daten dargestellt wird. Die Messungen wurden mit einem Rikagakudenki-Röntgenbeugungsinstrument ermittelt, das mit einer Kupferbestrahlungsvorrichtung ausgerüstet ist, die mit einem Nickelfolienfilter und einem Szintillationszähler versehen ist.

Tabelle I

d	ο (A)	1/I₁	d	O (A)	I/	02
27	,59	0,23	4		o,	28
13	,80	l_;00	4	,55	°;	03
6	,86	0_;08	4	/⁴¹	°;	0 3
5		0,03	3	,78	°;	04
5	>⁴?	0,03-	3	,43	°;
5	,09.	0.02

(elektrische Quelle: Cu; Ni, 30 KV, 20 mA λ=1,5405)

Thermische Analyse: Bei einer thermischen Differentialanalyse mit dem thermischen Analyseinstrument Shimadzu DT-Modell wurden bis zu einer Temperatur von 233 C, bei der Bestatin schmilzt und sich zersetzt, keine exothermen oder endothermen Reaktionen beobachtet. Ferner wurde bei einer thermogravimetrischen Analyse bis zum Zer-

Ht* O
It Cl

setzungspunkt keine Gewichtsveränderung beobachtet. Dagegen wird .bei einer thermogravimetnischen Analyse der o(-Kristallform des Bestatin der Beginn einer Gewichtsabnahme bei etwa 48 C beobachtet, wobei der Gewichtsverlust etwa 9 bis 10 %, bezogen auf das Gesamtgewicht, beträgt.

3. Die absolute Dichte.

Die absolute Dichte betrug 1,173 g/ml bei Messung mit einem Pyknometer unter Verwendung von "Kerosin als Dispersionsmedium.

4. Bestimmung der hygroskopischen Eigenschaften.

Die ^-Kristalle, deren Trocknungsverlust unter 0,5 % la-g> wurden unter folgenden Bedingungen stehengelassen: Temperaturen:25 C und 37 C; relative Luftfeuchtigkeit: 31 % und 83 %. In beiden Fällen wurde keine Gewichtsänderung beobachtet. Demnach ist das kristalline ■^-Bestatin nicht hygroskopisch. In Parallelversuchen zeigte die ß-Kristallform des Bestatin eine Gewichtszunahme von 8,2 % bzw. 9,7 %, wenn die Kristalle Stunden lang bei 31 % bzw. bei 82 % relativer Luftfeuchtigkeit stehengelassen wurden.

Das erfindungsgemäße kristalline /^-Bestatin kann nach einer der folgenden Verfahren (a) und (b) hergestellt werden.

Das Verfahren (a) besteht darin, die c&- oder ß-Kristallform auf eine Temperatur im Bereich von 148 C bis zum Schmelzpunkt des Bestatin, vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von 150 bis 200 C, zu erhitzen. Bei 148 C wird die ß-Kristallform in die 7>-Kristallform des Bestatin umgewandelt. Bei Temperaturen, die niedriger liegen, erfolgt lediglich eine Umwandlung der o(-Kristallform in die ß-

OW >J ■»■

^ w W »· W V-¹ *"* Uv^¹

Ii,«U 1) W-¹W w

Kristallform, d.h. die 71-Kristallform kann nicht erhalten werden. Bei Temperaturen oberhalb des Schmelzpunktes zersetzt sich Bestatin.

Die Erhitzungsdauer ist vorzugsweise nicht kurzer als 1 Stunde. Falls sie dennoch kürzer gewählt wird, ist die Umwandlung in die /»-Kristallform unvollständig.

Das Verfahren (b) besteht darin, daß die <- oder ß-Kristallform des Bestatin in einem spezifischen organischen Lösungsmittel suspendiert oder geknetet, wird.

Als spezifische organische Lösungsmittel können für den erfindungsgemäßen Zweck wässriges Methanol, vorzugsweise Methanol mit einem Gehalt von 6 bis 86 Vol.%, vorzugsweise von 10 bis 80 Vol.% Wasser, ferner Aceton, Methylethylketon, Diethylketon, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Dioxan oder Isopropylalkohol eingesetzt werden. Diese Lösungsmittel können auch als Kombination aus zwei oder mehr Lösungsmitteln eingesetzt werden. Alle oben erwähnten Lösungsmittel mit Ausnahme des wässrigen Methanols sind vorzugsweise wasserfrei, obgleich sie eine gewisse Menge an Wasser enthalten können, sofern dadurch die Kristallform nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Beispielsweise kann Aceton einen Gehalt an 20 % (v/v), vorzugsweise bis zu 15 % (v/v) Wasser enthalten.

Unter den oben erwähnten Lösungsmitteln werden solche bevorzugt, die einen niedrigen Siedepunkt aufweisen, wie -z.B. Methanol mit einem niedrigen Wassergehalt von beispielsweise 50 bis 10 % (v/v). Unter dem Gesichtspunkt der Lösungsmittelentfernung werden Aceton und Tetrahydrofuran bevorzugt eingesetzt, wobei Aceton ganz besonders bevorzugt wird.

(P	O	Φ	ο	ϋ	«Φ	οβ	© Ώ
βο β	β D	0 (υ			β * <	οβ > α β ο «	ο O
φ JtO	•9			«οββ	οβ	ÖCJOG

Obwohl die Dauer des Suspendierens oder Knetens von den verschiedenen Bedingungen, wie beispielsweise der angewandten Temperatur, abhängig ist, beträgt sie in der Regel mehr als 10 Minuten und praktisch etwa 20 Minuten bis 3 Stunden. Die Temperatur, bei der das Suspendieren oder Kneten durchgeführt wird, wird nicht besonders vorgeschrieben, in der Praxis werden jedoch normale Temperaturen angewandt.

Der Anteil an Lösungsmittel pro Menge an et- oder ß-Kristallform des Bestatins ist nicht besonders vorgeschrieben, es muß nur darauf geachtet werden, daß die Lösungsmittelmenge ausreicht, um die Kristalle vollständig zu benetzen. Ein Anteil von beispielsweise 0,3 Teilen Lösungsmittel pro Teil Kristalle (Gewicht/Gewicht) ist ausreichend.

Die ei-Kristallform des Bestatins kann nach dem in US-PS 42 81 180 beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Das Produkt kann durch Fällung beim isoelektrischen Punkt gewonnen werden, wobei die Kristalle aus einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5 bis 6 abgetrennt werden. Die ß-Kristallform des Bestatins kann durch Trocknen der ec-Kristallform bei einer Temperatur unterhalb 148 C erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der ^»-Kristallform des Bestatins wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert.

Beispiel 1 · .

100 g Bestatin (in der o(-Kristallf orm), die durch Fällung beim isoelektrischen Punkt' erhalten worden waren, wurden bei 150 C 3 Stunden lang getrocknet, wobei man die /»-Kristallforrn erhielt. Die Bestätigung der Kristallform erhielt man mit Hilfe der Röntgenpulverbeugungsmethode„

- ίο -

Beispiel 2

10 g der ß-Kristallform des Bestatins, die durch Trocknen der c(-Kristallform aus Beispiel 1 bei '60 C erhalten worden waren, wurden in 100 ml Aceton suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann filtriert. Der erhaltene Kristallkuchen wurde unter vermindertem Druck bei 30 C 3 Stunden lang getrocknet. Es wurden 9,3 g Bestatin der ^»-Kristallform erhalten.

:

Beispiel 3

10 g eines Bestatin in der ß-Kristallform wurden in 100 ml Methylethylketon suspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Der erhaltene ._ Kristallkuchen wurde im Luftstrom bei 60 C 5 Stunden lang

getrocknet. Es wurden 7,6 g Bestatin in der^-Kristallform erhalten.

Beispiel 4

100 g Bestatin in der <X-Kristallform wurden in 600 g Diethylketon suspendiert. Die Suspension würde bei Zimmertemperatur 20 Minuten lang gerührt und anschließend zentrifugiert. Der erhaltene Kristallkuchen wurde unter vermindertem Druck bei 30 C 6 Stunden lang getrocknei

_OI_ Bestatin in der 7»-Kristallform erhalten,

*

Druck bei 30 C 6 Stunden lang getrocknet. Es wurden 91 g

Beispiel 5

10 g Bestatin in der ß-Kristallform wurden in 10 g Tetrahydrofuran suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang __ gerührt und dann filtriert. Der erhaltene Kristallkuchen wurde im Luftstrom bei 60 C 4 Stunden lang getrocknet. Es wurden 9,2 g Bestatin in der -p-Kristallform erhalten.

Beispiel 6

10 g' Bes.tatin in der ß-Kristallform wurden mit 30 ml Dioxan

in einem Mörser gemischt und 30 Minuten lang geknetet,

- -". ·-■···: 32A61 35

- 11 -

wobei sich eine Paste bildete. Die Paste wurde unter vermindertem Druck bei 60⁰C 10 Stunden lang getrocknet. Danach wurden 8,6 g Bestatin in der ^5-Kristallform erhalten.

Beispiel 7

10 g Bestatin in der ß-Kristallform wurden in 100 ml Isopropylalkohol suspendiert. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur 20 Minuten lang gerührt und dann filtriert.

Der erhaltene Kristallkuchen wurde unter vermindertem _o

Druck bei 60 C 5 Stunden lang getrocknet. Es wurden 9,0 g Bestatin der ^? -Kristallform erhalten.

Beispiel 8

10 g Bestatin in der ß-KristalIform wurden in 100 ml Methanol 15

mit einem Gehalt von 10 % Wasser suspendiert. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang gerührt und dann filtriert. Der erhaltene Kristallkuchen wurde im Luftstrom bei 50 C 10 Stunden lang getrocknet. Es wurden 8,1 g Bestatin der -r>-Kristallform erhalten. ^/

Beispiel 9

100 g Bestatin in der ß-Kristallform wurden zu 70 ml Methanol, das 50 % Wasser enthielt, zugefügt. Die Mischung wurde in einem kleinen Kneter 20 Minuten lang geknetet. ο

Das geknetete Produkt wurde in einem Luftstrom bei 50 C 10 Stunden lang getrocknet. Man erhielt 94 g Bestatin in der ^-Kristallform.

Beispiel 10

.

10 g Bestatin in der ß-Kristallform wurden in 100 ml Methanol, das 80 % Wasser enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang gerührt und dann firtriert. Der erhaltene Kristallkuchen wurde unter vermindertem Druck bei 50⁰C 5 Stunden lang getrocknet. Man erhielt

8,9 g Bestatin in der γ-Kristallform.

sy/do

Claims

UEXKÜLL S$SY|H.BER.qj.. ",.ΈώορΕΑΝ patent attorneys

DR. J.-D. FRHR. von UEXKÜLL DR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL.-ING. JÜRGEN SUCHANTKE DIPL-ING. ARNULF HUBER DR. ALLARD von KAMEKE DR. KARL-HEINZ SCHULMEYER

Zaidan Hojin Biseibutsu
Kagaku Kenkyukai
3, 14-23, Kamiosaki,
Shinagawa-ku,

Tokio, Japan

Prio: 24. Dez. 1981 JP 208144/81 (19238 sy/do)

Dezemben 1982

Knistallines ^»-Bestatin und
Verfahren zu seiner Herstellung

Patentansprüche

Kristallines ^-Bestatin mit dem 'folgenden Röntgenbeugungsmuster:

d (A)

27_f59 13,80

6,86

⁵I⁵⁷ 5,47

V⁹

4_?55

3_f78 3 „43

1/I₁-0„23

°/⁰⁸

0_f 02 0_f02 0„28

Oj.03 0_?03
2. Verfahren zur Herstellung von kristallinem y-Bestatin, dadurch gekennzeichnet, daß

a) hygroskopische Bestatinkristalle und/oder ein entsprechendes Hydrat derselben auf eine Temperatur im Bereich von 148 C bis zum Schmelzpunkt des Bestatins erhitzt werden, oder

b) hygroskopische Bestatinkristalle und/oder ein entsprechendes Hydrat derselben in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus der Gruppe Aceton, Methylethylketon, Diethylketon, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Dioxan, Isopropylalkohol und wässriges Methanol, suspendiert oder geknetet"werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hygroskopischen Bestatinkristalle und/oder ein entsprechendes Hydrat derselben auf eine Temperatur im Bereich von 150 bis 200 C erhitzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel ein oder mehrere organische Lösungsmittel aus der Gruppe Aceton, Tetrahydrofuran und wässriges Methanol ausgewählt werden.
5. Verfahren zur Herstellung von kristallinem ^-Bestatin, dadurch gekennzeichnet, daß hygroskopische Bestatinkristalle und/oder ein entsprechendes Hydrat derselben in Aceton suspendiert wird.

BAD ORIGINAL