DE3221813A1 - Verfahren zur herstellung von reinem hepatitis b oberflaechenantigen aus menschlichem plasma - Google Patents
Verfahren zur herstellung von reinem hepatitis b oberflaechenantigen aus menschlichem plasmaInfo
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WARSCHAU/POLEN
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Verfahren zur Herstellung von reinem Hepatitis h Oberflächenantigen
aus menschlichem Plasma
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0524560 BFRG d Posiwheck München 6M4.VRO8 (hl/ 700I0CIMH
Die Erfindung; betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
reinem Hepatitis I- übcrflächenantifer- (HBsAg) aus menschlichem
Plasma. Das HBsAg ist ein virales Protein, das im Blut von Menschen vorkommt, die an infektiöser Hepatitis
des Typs B leiden, bzw. ständig im Blut von Trägern des Hepatitis B Virus vorhanden ist. Nach Reinigung von den
übrigen Plasmaproteinen stellt HBsAg einen Imstoff gegen infektiöse Hepatitis B dar, der bei Verabreichung an Menschen
oder Tiere zur Bildung von HBs Antikörpern im Organismus der Patienten führt. Diese Antikörper schützen den
Organismus gegen volle Infektion durch den aktiv infektiösen Partikel des Hepatitis B Virus.
Es ist ein Verfahren zur Herstellung von reinem HBsAg durch mehrfaches Zentrifugieren von in geeigneter Weise vorbereitetem
Plasma in Dichtegradienten aus Saccharose oder Caesiumchlorid bekannt. Bei dem Trennverfahren in Dichtegradienten
mittels Ultrazentrifugieren, d.h. Zentrifugieren mit hohen Geschwindigkeiten, kann man HBsAg-Zubereitungen
gewinnen, die frei von den restlichen Plasmaproteinen sind. Die Ultrazentrifugierung ist ein sehr zeitaufwendiges
Verfahren, bei dem eine Reihe teurer Apparate verwendet werden müssen, und das folglich nur zur Gewinnung kleiner Anti-"
genmengen für Forschungszwecke angewandt wird. Es ist also ein Labor- und kein Herstellungsverfahren. Es kann damit
keine größere Menge des Materials gewonnen werden, das zur Immunisierung selbst einer relativ kleinen Personengruppe
durch Impfung notwendig wäre.
Zur Herstellung von HBsAg-Zubereitungen sind noch andere Verfahren
bekannt, wie Filtrieren durch mit Gel gefüllte Säulen, Affinitätschromatographie und Elektrophorese. Mit diesen Ver-
-/3
fahren können jedoch keine vollständig reinen Zubereitungen gewonnen werden, sie sind nur für das Labor geeignet und
wenig produktiv.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von reinen
HBsAg-Zubereitungen besteht aus den folgenden Schritten: das Ausgangsmaterial wird von Lipiden und teilweise von
menschlichen Plasmaproteinen befreit, es wird einer Verdauung mit Pepsin in Mengen von 0,01 bis 0,50 mg/mg Protein,
vorzugsweise 0,05 mg/mg Protein ausgesetzt, in einem phosphatgepufferten Medium mit einem pH-Wert bis zu 7,1 bis 7,3
durch Molekularfilter, die Moleküle bis zu 100 000 Dalton passieren lassen, geleitet, und die Infektiosität wird anschließend
innerhalb von 96 h durch Formaldehyd, vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 1:2 000, inaktiviert.
Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren ergibt das erfindungsgemäße
Verfahren von Plasmaproteinen vollständig gereinigtes HBsAg. Bei Verwendung als Iir.pf stoff feren infektiöse
hepatitis B ruft dieses Antigen beim geimpften Patienten keinerlei Nebenwirkungen hervor, überdies kann das erfindungsgemäße
Verfahren zur Massenherstellung von Impfstoff aus Hepatitis B-Virusproteinhaltigem Plasn.a verwendet
werden.
Die Herstellung von gereinigtem Hepatitis B Oberflächenantigen
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geschieht folgendermaßen:
In der ersten Phase erfolgt die Delipidisierung des menschli chen Plasmas. Zu diesem Zweck werden zu 1 000 ml Plasma von
HBsAg-Spendern mit einem Titer von mindestens 1:10 (bestimmt mittels Immunelektroosmopräzipitation, IEOP) 0,1 mol MnCl„*
MH2O, gelöst in 1 000 ml, gegeben.
Nach Zugabe des Manganchlorids wird das Plasma in einem elektromagnetischen
Rühren bei Eisbadtemperatur 1 h gerührt. Dann wird das Material 30 min. mit 6 000 U/min zentrifugiert.
I>er Niederschlag wird verworfen, er enthält kein HbsAp,.
Der erhaltene flüssige Oberstand wird nach dem Zentrifugieren
mit 0,1 mol/1 HCl auf einen pH-Wert von S,6 gebracht, und
Polyethylenglycol 6 000 (PEG 6 000) wird in einer Menge von 75 g auf 1 000 ml Material zugegeben. Das Material wird dann
etwa 12 h bei M C in einem elektromagnetischen Rührwerk gerührt. Anschließend wird es 30 min. mit 6 000 U/min zentrifugiert.
Der flüssige Überstand, der kein Antigen enthält, wird verworfen, das beim Zentrifugieren erhaltene Sediment wird
für die weitere Verarbeitung gesammelt.
Dieses Sediment wird in 200 ml 0,9%igem NaCl gelöst, und die
Lösung wird mit entionisiertem Wasser bis zu dem Volumen aufgefüllt, das das Material vor dem Zentrifugieren hatte. Nach
der NaCl-Zugabe bildet sich in der Lösung erneut ein Sediment. Diese Lösung wird nochmals 30 min. mit 6 000 U/min
zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der flüssige
Überstand, der das HBs Antigen enthält, gesammelt, das kein
HBsAg enthaltende Sediment wird verworfen. Durch Zugabe von entionisiertem Wasser wird der flüssige Überstand auf ein
Volumen von IQ 000 ml aufgefüllt. Ein kleiner, nach der Verdünnung
verbleibender Sedimentrest wird durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 6 000 U/min entfernt. Für die nächste
Stufe des Antigen-Herstellungsverfahrens wird der bei diesem Zentrifugieren gewonnene flüssige Überstand verwendet.
Das im Verlauf der Delipidisierung gewonnene Material wird nunmehr einer Verdauung mit einem Enzym ausgesetzt.. Hierfür
werden 10 000 ml des Materials auf etwa 37°C erhitzt, und der pH-Wert durch Zugabe von 1 mol/1 HCl auf 2,5 standardisiert.
Zu diesem vorbereiteten Material wird mehrfach umkristallisiertes Pepsin (Sigma) in einer Menge von etwa 0,05 mg pro
1 mg Protein in der Lösung gegeben. Der Proteingehalt der Lösung wird mit einem Spektrophotometrasehen Verfahren bestimmt.
Nach etwa 1 h wird die Verdauung mit Pepsin abgebrochen, indem man den pH-Wert der Lösung mit 1 mol/1 NaOIl
auf 4,6 einstellt. Nach Anschluß der Verdauung wird die Lösung 30 min. mit 6 000 U/min zentrifugiert. In dem nach den. Zentrifugieren
verbleibenden Sediment wird kein HBsAg festgestellt, da es vollständig in 'den flüssigen Oberstand übergeleitet
wurde.
Die Verdauung mit Pepsin verursacht eine Degradation menschlicher Plasmaproteine zu Polypeptideinheiten, die nicht grosser
als 30 000 Dalton sind. Das HBsAg-Protein wird jedoch nicht verdaut.
Nun folgt als nächster Schritt die Reinigung des Materials von mit Pepsin verdauten Plasmaproteinen mit Hilfe von
Molekularfiltern, die Partikel bis zu 100 000 Dalton passieren lassen. Hierzu kann ein Filtersystem mit geschlossenem
Kreislauf der AMICON Comp., USA, verwendet werden. Das zu filternde Material wird mehrmals durch die Filterzone geleitet,
in der mit Hilfe von Molekularfiltern Partikel aus der Lösung abgezogen werden, die kleiner sind als die Filtrationsgrenze.
Erfindungsgemäß wird durch Filter des Typs H 1x100 filtriert, die Partikel bis zu 100 000 Dalton passieren
lassen. Der vollständige Filtrierzyklus umfaßt neunmaliges Durchpumpen des Materials in einem Volumen von 80 1 und
unter einem Druck von 6,3-10 Pa. Vor der Einleitung des Materials in das Filtersystem wird es mit phosphatgepuffertem,
entionisierten und pyrogenfreien Wasser zu dem oben genannten Volumen verdünnt. Dieses Wasser kann in einem Gerät der ELGA
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Comp., Großbritannien, hergestellt werden.
Während des Filtrierens erfolgt ein vollständiges Auswaschen von Plasmaproteinen, die zuvor mit Pepsin verdaut wurden.
Das aus dem Filtersystem erhaltene Material, das gereinigtes HEsAg enthält, wird in Portionen von je 10 000 ml
96 h in den Kühlschrank gestellt, wobei so viel Formaldehyd zugegeben wird, bis dieses in der Lösung in einer Konzentration
von 1:2 000 Vol./Vol. vorhanden ist. Nach der Entnahme aus dem Kühlschrank wird das Formaldehyd mittels Dialyse
aus dem Material entfernt. Anschließend wird das HBsAg an Aluminiumhydoxid adsorbiert, das in einer Menge von
1 mg auf 1 ml Lösung zugegeben wird. Der auf diese Weise erhaltene endgültige Impfstoff wird in Ampullen abgefüllt.
Der in der obigen Weise erhaltene Impfstoff zeigt bei einer Analyse auf Gegenwart von menschlichen Plasmaproteinen mit
dem Verfahren der Doppeldiffusion in Agar bei 30-facher Eindickung
gegenüber antihumanen Plasmaproteinen keine Präzipitationslinien.
Der Impfstoff enthält ferner keine infektiösen Partikel des Hepatitis B Virus.
Von einem HBsAg-Spender wird mittels Plasmapherese Plasma
gesammelt. Die HBsAg-Aktivität wird mit Immunoelektroosmophorese bestimmt, wobei der Titer nicht kleiner als 1:16
ist. Das menschliche Plasma wird delipidisiert, indem man zu 1 1 Plasma 1 1 0,1 mol/1 MnCl2'4H2O und 150 000 internationale
Einheiten Heparin in einem Volumen von 30 ml gibt. Dieses Material wird bei Raumtemperatur 0,5 h auf einem elektro
magnetischen Rührer inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wird das gesamte Material in einer Beckmann J-6 Zentrifuge, mit
dem Rotor JA-IO und 6 000 U/min 30 min zentrifugiert. Das
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erhaltene Sediment, das kein HBsAg aufweist, wird verworfen, der Überstand wird in einem 2 1 Kolben gesammelt.
Zu dem Material wird 7,5%ige PEG Lösung, Molekulargewicht
6 000, gegeben. Der pH-Wert wird mit 1 mol/1 HCl auf 5,5
eingestellt. Das Material wird dann in den Kühlschrank gestellt und unter fortdauerndem Rühren über Nacht inkubiert.
Am folgenden Tag wird das Material in der Beckmann-Zentrifuge J-6, mit dem Rotor JA-IO und 6 000 U/min zentrifugiert.
Der HBsAg-frefe Überstand wird verworfen, das Sediment wird in 200 ml 0,9%igem NaCl gelöst und mit entionisierteir. Wasser
auf 2 1 aufgefüllt. Nach 20 bis 30 min. bildet sich reichlich Sediment, das durch Zentrifugieren in der beckmann J-6
Zentrifuge, mit Rotor JA-IO und 6 000 U/min, innerhalb von 30 min. entfernt wird. Das erhaltene klare Filtrat zeigt bei
Immunoelektroosmophorese mit einem Titer von 1:8 HBsAg-Aktivität. Das Materialvolumen wird dann mit entionisierteir. Wasser
auf10 1 erhöht (21+81 entionisiertes Wasser). Nach
30 min. wird eine kleine Menge Sedimentbeobachtet, das nach Zentrifugieren in der Beckmann J-6 Zentrifuge mit Rotor JA-IO
und 6 000 U/min in 30 min. verworfen wird. Man erhält klaren Überstand, der Titer bei der Immunoelektroosmophorese beträgt
etwa 1:2.
Zu 10 1 Überstand werden 90g NaCl gegeben, sodaß man eine 0,9%ige NaCl-Lösung erhält.
Das solchermaßen zubereitete Material wird bei 37°C 12 h inkubiert. Anschließend wird zu der Flüssigkeit, die 37°C
und einen pH-Wert von 2,5 hat, Pepsin in einer Menge von 0,05 ml/ml, d.h. 0,5 g Pepsin pro 10 1 Material, gegeben.
Die Verdauung der Lösung mit Pepsin wird 1 h lang bei 37°C durchgeführt. Nach 1 h wird die Verdauung durch Anheben des
-/8
-V-
pH-Werts auf 3,5 mit 0,1 mol/1 NaOH abgebrochen.
Das restliche Sediment wird in der beckmann J-6 Zentrifuge mit Rotor JA-IO und 6 000 U/min 2 0 min. zentrifugiert und
anschließend verworfen.
Der Überstund wire] mit Molekularfiltern filtriert, und
zwar in den Gerät DC 30 der AKiICON Com. , unter Verwendung von Hohlfaserfiltern H 10x100.
Bei dem Filtervorgang wird Material in einer Menge von 101 gewonnen, der Titer bei der Immunoelektroosmopräzipitation
des HBsAg beträgt 1:2.
Diese Material zeigt bei lOOfacher Eindickung keine Präzipitationslinien
bei dem Immunodiffusionsverfahren auf Agar, wenn tierisches Plasma, anti-IgG, anti-IgM, anti-l£A,anti-Kumanprotein
und anti-Humanplasmaprotein verwendet werden.
Die Impfung von Labortieren wie Meerschweinchen oder Kaninchen mit 100-fach eingedicktem Material ergibt keine Immunreäction
gegen Kontamination der Zubereitung mit aus menschlichem Plasma stammenden Proteinen. Mit dem HBsAg-haltigen
Material erhält man nur eine Präzipitationslinie.
Das mit dem beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Material ist hoch immunogen, was durch Impfung von
Schimpansen und etwa einem Dutzend Menschen nachgewiesen wurde.
-/9
Chemische Zusammensetzung des Impfstoffs gegen virale Hepatitis B
HBsAg 0,5 μg/cm3
Gesamtprotein 0,5 ug/cm3
Polypeptide -
Molekulargewicht 30 000 0,02 ug/cm3
NaCl 0,85 %
Aluminiumhydroxid 1 mg/cm3
Merthiolat 100 ug/cm3
Bei Tests in der dritten Generation wurden in dem Material kein HBcAg, HBeAg und DNA-Polymerase nachgewiesen.
Ende der Beschreibung
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von reinem Hepatitis B
Oberflächenantigen aus menschlichem Plasma, bei dem Lipide und ein Teil der Plasmaproteine entfernt werden, restliche
Ballastproteine enzymatisch abgebaut werden, und schließlich die immunologisch aktiven Antigenpartikel isoliert
werden, dadurch gekennzeichnet,
daß das delipidisierte und teilweise von Plasmaproteinen befreite Ausgangsmaterial einer Verdauung mit
Pepsin in einer Menge von 0,01 bis 0,50 mg/mg, vorzugsweise 0,05 mg/mg, ausgesetzt wird, dann in einem phosphatgepufferten
Medium mit einem pH-Wert von 7,1 bis 7,3 über Molekularfilter geleitet wird, die Partikel bis zu
100 000 Dalton passieren lassen,und daß die Infektiosität mittels Formaldehyd inaktiviert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet
, daß das Ausgangsmaterial einer Verdauung mit Pepsin in einer Menge von 0,05 mg/mg
Protein ausgesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das von Plasmaproteinen gereinigte
Antigen hinsichtlich seiner Infektiosität mit Formaldehyd in einer Menge von 1:2 000 Vol./Vol. innerhalb
von 96 h inaktiviert wird.
ja
«· (089) 98 82 72 - 74 Telex: S 24 560 BERG d Bankkonten: Bayer. Vereinsbank München 453100 (8LZ 700 202 70)
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