SU1409121A3

SU1409121A3 - Способ получени поверхностного антигена гепатита В из плазмы крови человека

Info

Publication number: SU1409121A3
Application number: SU823454639A
Authority: SU
Inventors: Бжоско Витольд; Яниски Петр; Класковски Збигнев; Мадалиньски Казимеж; Донброва Анджей
Original assignee: Акадэмия Мэдычна
Priority date: 1981-06-10
Filing date: 1982-06-09
Publication date: 1988-07-07
Also published as: NO821927L; GB2099700A; DD202506A5; PT75031B; FI822018A0; PL231588A1; FR2507478B1; CS425482A2; RO84231B; IT1151793B; RO84231A; FR2507478A1; CA1203169A; CS232726B2; SE8203435L; PT75031A; IT8221787A0; DK260482A; ES8303916A1; ES512971A0

Description

(21)3454639/28-14

(22)09.06.82

(31)Р-231588

(32)10.06.81

(33)PL

(46) 07.07.88. Бюл. 25

(71)Акадэми Мэдычна (PL)

(72)Витольд Бжоско, Петр Яниски, Збигнев Класковски, Казимеж Мадалинь- ски и Анджей Донброва (PL)

(53) 615.373 (088.8) (56) Eveline Е. Reerink et al. Viral jHepatitis Jut. Symposium, edt. by Franklin Just. liess.. Sect V , 1981, 437-450.

(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, включающий делипиди- зацию и предварительное удаление белков плазмы путем обработки полиэти-f ленгликолем, отличающий- с тем, что, с целью повышени чистоты конечного продукта, после делипидизации и предварительного удалени белков плазмы,исходный продукт обрабатывают пепсином в количестве 0,01-0,5 мг/мг белка, далее фильтруют на молекул рном фильтре, позвол ющем прохождение частиц до 100000 даль- тон в фосфатно-буферной среде при рН 7,1-7,3, и дезактивируют формальдегидом в количестве 1:2000 объем/ объем в течение 96 ч.

§

СО

о

to

см

Изобретение относитс к получению чистого поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) из плазмы крови челот века и может быть использовано дл получени HBS-антител при лечении.

Целью изобретени в-. етс повышение чистоты конечного продукта.

Способ осуществл етс следующим образом.

На первой стадии провод т делипи- дизацию плазмы крови человека. Дл этого к 1000 МП плазмы, полученной от доноров HBsAg, имеющей титр согласно определению методом иммуно- злектроосмоосаждени (IEOP) минимально 1:10, прибавл ют 100 мл 0,1 мол ,0.

После прибавлени хлористого марганца плазму перемешивают в электро- магнитном смесительном устройстве при температуре лед ной бани в течение I ч. Затем материал центрифугируют в течение 30 мин при скорости 6000 1/мин. После центрифугирова- ни отбрасывают осадок, не содержащий HBsAg. Слой жидкости, полученный в результате центрифугировани , довод т до рН 5,6, примен 0,1н.НС1, и прибавл ют полиэтилен- гликоль 6000 (PEG 6000) в количестве 75 г на 1000 мл материала. Затем материал перемешивают в течение 12 ч при 4 С в электромагнитном перемащивающем устройстве. Материал выгружают ,из смесител и центрифугируют 30 мин при скорости 6000 1/мин.Спой жидкости, не содержащий антигенов, отбрасывают и дл последующей обр а- ботки собирают осадок, полученный в результате центрифугировани .

Этот осадок раствор ют в 200 мл 0,9 М NaCl и раствор разбавл ют де- ионизирова1шой водой до объема, кото р.1й равен объему материала перед центрифугированием. После прибавлени NaCl осадок переходит снова в раствор. Этот раствор еще раз подвергают центрифугированию 30 мин со скоростью 600 1/мин. После центрифугировани слой жидкости, содержащий HBs антиген, собирают, остаток, не содержащий его, отбрасывают. Прибавлением деионизированной воды объем сло жидкости довод т до 10 000 МП. Небольшое количество остатка, оставшегос после разбавлени , удал ют центрифугированием в тчение 30 мин при скорости 6000

0 g

с

5

0

1/мин. На последующей стадии процесса получени антигена примен ют спой жидкости, получивщийс в результате этого центрифугировани .

Материал, полученный в ходе дели- пидизации, подвергают перевариванию с ферментом. Дп этого 1000 мп материала нагревают до температуры около 37°С устанавливают прибавлением 1н. НСI рН 2,5. К полученному таким образом материалу прибавл ют пепсин сигма, несколько раз кристаллизуют в количестве около 0,05 мг на 1 мг белкового раствора. Содержание белков в растворе определ ют спектрофотомет- рическим методом. Через 1 ч переваривани с пепсином его прерывают путем установлени рН раствора 4,6 действием 1н. NaOH. После завершени переваривани раствор центрифугируют 30 мин со скоростью 6000 1/мин. В осадке-, образовавщемс после центрифугировани , HBsAg не обнаруживаетс , поскольку он полностью переходит в слой жидкости.

Переваривание с пепсином вызывает расщепление белков плазмы человеческой крови до полипептидных единиц, размер которых не превьшает 30000 дальтон. Однако белок HBsAg не подвергаетс перевариванию.

Затем следует стади очистки материала от белков плазмы, переваренных с пепсином, при помощи молекул рной фильтрации на фильтрах, пропускающих частицы величиною до 100000 даль- тон. Дп этого может примен тьс система фильтров с замкнутым циклом производства Ami con Company (США), в которой материал, подлежаи(ий фильт-. рации, многократно фильтруют через зону фильтрации, где частицы отдел ют- с от раствора при помощи молекул рных фильтров с размером, меньше, чем предел фильтрации. Согласно предпа- гаемому способу примен ют фильтрацию через фильтры типа HI«100, позвол ющие проход частиц величиною до ЮОООО дальтон. Полный цикл фильтрации заключаетс в 9-кратном прокачивании материала в объеме 80 л при давлении 0,63 атм. Материал перед подачей в фильтрующую систему разбавл ют до указанного объема фосфатным буфером на основе деионизированной не вызывающей лихорадки воды с рН 7,1-7,3. Така вода может быть

3

получена на аппаратуре, выпускаемой фирмой EIGA Company (Великобритани )

В ходе фильтрации происходит полное вымывание белков плазмы, которые были предварительно переварены с пепсином . Материал, полученный из фильтрационной систе, содержащий очищенный HBsAg, помещают порци ми по 10000 мл в холодильник на 96 ч, при- баоив формальдегид в количестве, необходимом дл создани его концентрации в растворе 1:2000 по объему. После того, как раствор вынут из холодильника , формальдегид удал ют из материала при помощи дедиализации. Затем провод т адсорбцию HBsAg на гидроокиси алюмини , прибавл емой в количестве 1 мг на I мл раствора. Готовый продукт, полученный таким об разом, помещают в ампулы.

Затем анализируют его на присутствие в нем белков плазмы крови человека методом двойной диффузии в агаре , при этом не обнаруживаетс линий осаждени при 30-кратиом разбавлении плазмой антипротеинов человека. Он также не содержит инфекционных частиц вируса гепатита В.

Пример 1. От донора HBsAg плазму собирают при помощи плазмофо реза. Активность HBsAg определ ют методом иммуноэлектроосмофореза с титром, не ниже чем 1:16. Плазму крови человека подвергают процессу делипидизации путем прибавлени , в расчете на I л плазмы I л I М и 150000 международных единиц гепарина в объеме 30 мл. Этот материал инкубируют при комнатной темпе- ратуре в электромагнитном перемещи- вакицем устройстве в течение 30 мин. По истечении этого времени весь материал центрифугируют на центрифуге типа Бекман S-6 с мотором SA-10 при скорости 6000 1/мин в течение 30 мин Полученный остаток, представл ющий собой HBsAg (-), отбрасывают, слой жидкости собирают в колбу вместимостью 2 л.

К продукту прибавл ют то же количество 7,5%-ного раствора полиэтилен гликол с молекул рной массой 6000. Устанавливают рН среды рарным 5,5 при помощи iH.HCl. Продукт помещают в холодильник и инкубируют ночь при посто нном перемешивании.

На следующий день центрифугируют на центрифуге Бехман с мотором

JQ 15 20

25

30 Q д5

35

50

5

121

JA-100 при 600 1/M1IH. Слой жидкости, вл ющийс HBsAg, (-), отбрасывают, остаток раствор ют в 200 мл 0,9%-ио-- го NaCl и разбавл ют деионизирован-- ной водой до объема 2 л. Через 20-30 мин обильный осадок удал ют центрифугированием в течение 30 мин на центрифуге Бекман J-6 с мотором JA-10 при скорости 6000 1/мин.

Полученный прозрачный фильтрат имеет активность HBsAg согласно определению методом иммуноэлектроосмофореза с титром 1:8. Объем раствора увеличивают до 10 л разбавлением деионизированной воды (2 л + 8 л деионизационной воды). Через 30 мин наблюдаетс небольшое количество осадка, который удал ют центрифугированием на центрифуге Бекман J-6 с мотором JA-10 при скорости 6000 1/мин в течение 30 мин. Получают прозрачный слой жидкости с титром около 1:2 согласно тесту на иммуноэлектроосмоосаждение.

К 10 л жидкости прибавл ют 90 г NaC1, получа 0,9%-ный раствор NaCl.

Продукт, полученный таким образом, инкубируют при 37°С в течение 12 ч. По истечении этого времени к жидкости при 37 с и при рН 2,5 прибавл ют пепсин в количестве 0,01 мг на 1 мг белков. Переваривание пепсина с продуктом производ т 1 ч при 37°С. Через 1 ч переваривание прекращают путем прибавлени 0,1 н. NaOH до установлени рН до 3,5.

Оставшийс осадок центрифугируют в течение 20 мин на центрифуге Бекман J-6 с мотором JA-10 при 6000 1/мин и затем осадок отбрасывают.

Слой жидкости подвергают молекул рной фильтрации в аппарате ДС 30 Amicon Company с применением полого волокнистого фильтра Н 10 100. Фильтрацию ведут в среде фосфатного буфера с рН 7,1.

Получают в результате молекул рной фильтрации материал объемом 10 л, титр при определении методом иммуноэлектроосмоосаждени HBsAg 1:2. Этот материал при 100-кратном разбавлении не показывает линий осаждени по технологии иммунодиффузии с применением плазмы крови животных анти- IgG, анти-IgM, анти-IgA, анти-протеи- нов человека и плазмы антипротеинов человека. Антиген, очищенный от про51

I f-iiHoa lГIaз 5 l,инaктивиpo aн формальдегидом н течение 96 ч р количестве i:2000 по объему.

вакцинаци лабораторных животных таких как морские свинки или кролики с 100--кратным разбавлением материала не дает им туногенноУ1 реакции против заражени препарата белком, происход щим из плазмы крови человека. Полу чаетс только одна лини осаждени с материалом, содержащим HBsAg.

Материал, полученный предлагаемым способом, вл етс сильно иммуноген- ным, что доказано при вакцинации шим панзе-и 10 человек.

Химические характеристики вакцины дл вирусного гепатита В:

HBsAg, мм/см 0,5 Общий белок,

мм/см 0,5

Полипептиды, мм/см0,02

Молекул рный вес30000

NaCl, %0,85

g

0

5

216

1 идроокись алюмини , мг/см 1

Мертиолат,мм/смЗ100

В материале не присутствует HBsAg, HBsAg и DNA полимераэа, что доказано с применением третьего поколени тестов.

Пример 2. Исходный материал обрабатывают по способу примера 1, использу дл разложени белков большее количество пепсина, т.е. 0,5 мг пепсина на 1 мг белков при . Далее полученный продукт фильтруют на молекул рном фильтре, как в примере 1, при этом используют фосфатио-буфер- иую среду с рН 7,3 и дезактивируют формальдегидом в количестве 1:2000 по объему в течение 96 ч. Необходимую концентрацию формальдегида получают добавлением 150 см 4%-ного раствора формалина к 10 дм фильтрата.

Предложенный способ позвол ет повысить чистоту HBsAg до 100% (по известному 15%).

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, включающий делипидизацию и предварительное удаление белков плазмы путем обработки полиэти-f ленгликолем, отличающийс я тем, что, с целью повышения чистоты конечного продукта, после делипидизации и предварительного удаления белков плазмы,исходный продукт обрабатывают пепсином в количестве 0,01-0,5 мг/мг белка, далее фильтруют на молекулярном фильтре, позволяющем прохождение частиц до 100000 дальтон в фосфатно-буферной среде при pH 7,1-7,3, и дезактивируют формаль- <о дегидом в количестве 1:2000 объем/ объем в течение 96 ч.

SU .,1409121 АЗ

140912 I