CS232726B2 - Method of making pure surface hepatitide b antigene from human plasma - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby čistého povrchového antigenu hepatitidy B z lidské plasmy, při kterém se odstraní v plasmě lipidy a části bílkovin, enzymaticky se degradují zbývající balastní bílkoviny, jehož podstata spočívá v tom, že se výchozí materiál po odstranění lipidů a části bílkovin natráví pepsinem v množství 0,01 až 0,50 mg/mg a potom se zfiltruje na molekulárním filtru, který dovoluje průtok částic do 100 000 daltonů v prostředí s fosfátovým pufrem o pH 7,1 až 7,3 a infektivita se odstraní formaldehydem.

η .1

Vynález se týká způsobu výroby čistého povrchového antígenu hepatitidy В (HBsAg) z lidské plasmy. Tento antigen je bílkovinou virového původu, kterou je možno prokázat v krvi nemocných s infekční hepatittidou typu B, tento antigen je také stále přítomen v krvi nosičů hepatitidy В. V případě, že se podaří tento antigen izolovat a čistit, je možno jej užít к výrobě vakcíny proti infekční hepatitidě В a tuto vakcínu podávat lidem nebo zvířatům, čímž dochází ke vzniku protilátek proti hepatitidě B. Tyto protilátky chrání organismus tak, že nikdy nedochází к plně rozvinuté infekci.

Je znám způsob výroby čistého HBsAg opakovaným odstředěním vhodně zpracované plasmy při stoupající koncentraci sacharózy nebo chloridu cesia. Při způsobu, který se týká dělení tímto způsobem v ultraodstředivce je možno získat antigen, prostý zbývajících bílkovin plasmy. Ultracentrifugace je však metoda, náročná na čas, vyžaduje celou řadu nákladných zařízení a je tedy možno ji použít pouze к získání malých množství antigenu pro výzkumné účely. Jde tedy o laboratorní metodu, avšak nikoli o metodu použitelnou v průmyslovém měřítku. Tímto způsobem není možno získat větší množství materiálu, nutného к imunizaci vakcinací, a to ani. v případě malé skupiny lidí.

Jsou známy další způsoby pro výrobu antigenu, které spočívají v tom, že se plasma filtruje na sloupcích, naplněných gelem, nebo se postupuje afinitní chromatografií nebo elektroforézou. Žádný z těchto způsobů nedovoluje získat úplně čistý antigen, mimoto mají tyto způsoby laboratorní charakter a jsou málo produktivní.

Způsob podle vynálezu pro výrobu čistého HBsAg spočívá v tom, že se výchozí materiál zbaví lipidů a částečně i bílkovin lidské plasmy a pak se natráví toxinem, který se užije v množství 0,01 až 0,50 mg/mg bílkoviny, s výhodou 0,05 mg/mg bílkoviny, směs se filtruje molekulárními filtry, které dovolují průchod molekul až o 100 000 daltonech v prostředí s fosfátovým pufrem až do pH 7,1 až 7,3, přičemž infekciozita materiálu se odstraní formaldehydem, s výhodou v objemovém poměru 1 : 2000 na dobu 95 hodin.

Způsob podle vynálezu poskytuje na rozdíl od známých způsobů antígenu, zcela prostý plasmaUckých bílkovin, V případě, že se tento antigen užije jako vakcína proti infekční hepatitidě typu B, nedochází к vedlejším účinkům u očkovaných osob. Mimoto je možno způsob podle vynálezu užít v průmyslovém měřítku, pro výrobu očkovacího materiálu z plasmy, která obsahuje virus hepatitidy B.

Čištěný povrchový antigen hepatitidy В je způsobem podle vynálezu možno získat takto.

V první fázi se provádí odstranění lipidů z lidské plasmy. 1000 ml plasmy, získané od dárců s titrem, stanoveným imunoelektroosmoprecipitací (IEOP) alespoň 1 : 10 se smísí s 1000 ml chloridu manganatého se 4 molekulami vody o koncentraci 0,1 M.

Po přidání chloridu manganatého se plasma míchá elektromagnetickým míchadlem za chlazení směsí vody a ledu po dobu 1 hodiny. Pak se materiál odstřeďuje 30 minut při 6000 otáčkách za minutu. Po odstředění se sraženina odstraní, protože neobsahuje žádný antigen.

Supernatant, který se získá odstředěním se upraví na pH 5,6 při použití 0,1 N kyseliny chlorovodíkové a pak se přidá polyethylenglykol 6000 (PEG 6000) v množství 75 g na 1000 ml materiálu. Pak se materiál míchá 12 hodin při teplotě 4 °C elektromagnetickým míchadlem. Po skončeném míchání se materiál odstřeďuje 30 minut rychlostí 6000 otáček za minutu. Supernatant, který neobsahuje žádný antigen se odstraní a dále se zpracovává usazenina, získaná odstředěním.

Tato usazenina se rozpustí ve 200 ml chloridu sodného o koncentraci 0,9 % a roztok se doplní deionizovanou vodou na objem materiálu před odstředěním. Po přidání chloridu sodného se znovu objeví sediment. Roztok se znovu odstřeďuje 30 minut rychlostí 6000 otáček za minutu. Po odstředění se oddělí supernatant s obsahem antígenu a sediment, který antigen neobsahuje se odstraní. Přidáním deionizované vody se doplní objem supernatantu na 10 000 ml. Malé množství sedimentu, které se objeví po zředění, se odstraní odstředováním po dobu 30 minut rychlostí 6000 otáček za minutu. Získaný supernatant se dále zpracovává.

Materiál, získaný tímto způsobem se natráví enzymem. К tomuto účelu se 10000 ml materiálu zahřeje na teplotu 37 °C_; pH se upraví na 2,5 přidáním kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 N. К tomuto materiálu se přidá pepsin Sigma po opakované krystalizaci v množství 0,05 mg na 1 mg roztoku bílkoviny. Obsah bílkoviny v roztoku se předem stanoví spektrometricky. Po 1 hodině se trávení přeruší a roztok se upraví na pH 4,6 přidákním hydroxidu sodného o koncentraci 1 N. Pak se roztok odstřeďuje 30 minut rychlostí 6000 otáček za minutu. V usazenině, získané tímto způsobem není možno prokázat žádný antigen, což znamená, že veškerý antigen se nachází v supernatantu.

Při natrávení pepslnem dochází к rozkladu bílkovin lidské plasmy na polypeptidy s hmotností nejvýš 30 000 daltonů. Antigep však rozkladu nepodléhá.

Získaný materiál se dále čistí od produktů rozkladu plasmatických bílkovin molekulární filtrací na filtrech, které dovolují průchod částic až do 100 000 daltonů. К tomuto účelu je možno použít filtrační systém s uzavřeným okruhem (Amicon Company USA), při němž se filtrovaný materiál opakovaně filtruje při průchodu filtrační zónou, v níž jsou částlcé odděleny od roztoku molekulárními filtry s menším rozměrem než určená hranice. Při provádění způsobu podle vyná lezu se užívá filtr typu Η 1 x 100, který nechá procházet částice až do 100 000 daltonů. Při úplném cyklu prochází ' materiál devětkrát při objemu 80 litrů při tlaku 0,62 MPa. Před přívodem materiálu do filtračního systému se materiál zředí na svrchu uvedený objem deionizovanou apyrogenní vodou s obsahem fosfátového pufru. Tuto vodu je možno získat ze zařízení ELGA Company z Velké Británie.

Při filtraci dochází k úplnému odstranění rozložených produktů plasmatických bílkovin, které byly natráveny toxinem. Materiál, získaný z filtračního· systému, obsahuje čištěný antigen a uloží se po podílech 10 000 ml v lednici na 96 hodin po přidání formaldehydu v objemovém množství 1 : 2000. Po odstranění z lednice se formaldehyd odstraní dedialyzaci.· Pak se antigen adsorbuje na hydroxid hlinitý, který se přidá v množství 1 mg na 1 ml roztoku. Vakcína, získaná tímto způsobem, se plní do ampulí.

Takto získaná vakcína při analýze na bílkoviny lidské plasmy dvojitou difúzí na agaru poskytuje výsledky, na nichž nelze prokázat srážení ani při 30násobném sycení plasmy bílkovinami, které jsou protilátkami proti lidským bílkovinám. Tato vakcína rovněž neobsahuje infekční části viru hepatitidy B.

Vynález bude osvětlen následujícím příkladem.

Příklad

Od dárce plasmy se oddělí antigen plasmoforézou. Účinnost tohoto antigenu se · stanoví imunoelektroosmoforézou a má mít titr alespoň 1 : 16. Lidská plasma se pak zbaví tukovitých látek tak, že se na 1 litr plasmy přidá 1 litr 0,1 M MnClh. 4 H2O a 150 000 mezinárodních jednotek heparinu v objemu 30 ml. Materiál se inkubuje při teplotě místnosti za míchání elektromagnetickým míchadlem po dobu 0,5 hodiny. Po této době se materiál odstředí na odstředivce typu Beckman J-6 s rotorem JA-10 při rychlosti 6000 otáček za minutu po dobu 30 minut. Získaný sediment neobsahuje antigen a odloží se, supernatant se uloží do láhve o objemu 2 litry.

K tomuto materiálu se přidá určité množství 7,5 % roztoku polyethylenglykolu s · molekulární hmotností 6000. Pak se pH roztoku upraví na 5,5 přidáním 1 N kyseliny chlorovodíkové. Materiál se pak ulolží do lednice přes noc za stálého míchání.

Následujícího dne se materiál odstředí na odstředivce Beckman J-6 s rotorem JA-10 při 6000· otáčkách za minutu. Supernatant neobsahuje · antigen a odloží se, sediment se rozpustí ve 200 ml chloridu sodného · o koncen traci 10,9 % a doplní se deionizovanou vodou na objem 2 litry. Po 20 až 30 minutách se nový sediment odstraní odstředěním na odstředivce Beckman J-6 s rotorem · JA-10 při 6000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Získaný čirý filtrát obsahuje antigen, jak je možno prokázat imunoelektroosmoforézou, a to v titru 1 : 8. Materiál se pak doplní na objem 10 litrů deionizovanou vodou (2 litry + 8 litrů deionizované vody). Po 30· minutách usazování malého množství sedimentu se sediment odstraní odstředěním na odstředivce Beckman J-6 s rotorem JA-10 při 6000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Získá se čirý supernatant s titrem přibližně 1 :2, jak je možno prokázat srážením při imunoelektroosmóze.

K · 10 litrům supernatantu se přidá 90 g chloridu sodného, čímž se získá koncentrace chloridu sodného 0,9 %.

Tímto způsobem se získá materiál, který se inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 12 hodin. Po této době se přidá ke kapalině s teplotou 37 °C a pH 2,5 pepsin v množství 0,05 ml/ml, to znamená 0,5 g na 10 litrů materiálu. Natrávení pepsinem trvá 1 hodinu při teplotě 37 °C. Po 1 hodině se ·trávení zastaví zvýšením hodnoty pH na 3,5 přidáním 0,1 N hydroxidu sodného.

Zbývající sediment se odstředí na odstředivce Beckman J-16 s rotorem JA-10 při 6000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut a pak se odloží.

Supernatant se podrobí molekulární filtraci na přístroji (DC 30 Amicon Company) při použití filtru s dutými vlákny typu H 10 X x 100.

V průběhu molekulární filtrace se získá materiál o objemu 10 litrů a titru antigenu 1 : 2, což je možno prokázat srážením při imunoelektroosmóze.

Tento materiál při lOOnásobném zahuštění nevykazuje žádné srážecí čáry při imunodifúzi na agaru při použití živočišné plasmy, anti-IgG, anť-IgM, anti-IgA, antigenu proti lidské bílkovině a bílkovině v plasmě.

Při vakcinaci laboratorních zvířat, například morčat nebo králíků stonásobně zahuštěným materiálem · nedochází k imunologické odpovědi proti znečištěninám, které by mohly pocházet z bílkovin lidské plasmy. Sráží se pouze antigen.

Materiál, získaný způsobem podle vynálezu je vysoce imunologický a byl zkoušen vakcinací na šimpanzech a lidských dobrovolnících.

V následující tabulce jsou uvedeny vlastnosti vakcíny proti viru hepatitidy B.

7 Chemické vlastnosti vakcíny	chlorid sodný	•	0,85 %
Obsah antigenu	0,5 μΜ/ml	hydroxid hlinitý		1 mg/ml
celkové množství bílkoviny	0,5 μΜ/ml	merthiolát		100 μΜ/ml
polypeptidy s molekulovou hmotností 30 000	0,2 μΜ/ml	Materiál neobsahuje HBcAg, HBeAg ani DNA polymerázu.

pRedmEt

Claims (3)

1. Způsob výroby čistého povrchového antigenu hepatitidy B z lidské plasmy, sestávající z odstranění lipidů a části bílkovin v plasmě, enzymatické degradaci zbývajících balastních bílkovin ' a konečné izolaci imunologicky aktivního antigenu, vyznačující se tím, že se výchozí materiál zbaví lipidů a částečně bílkovin v plasmě a pak se natráví pepsinemi v množství 0,01 až 0,50 mg/mg, s výhodou 0,05 mg/mg, pak se zfiltruje na· molekulárním filtru, který dovoluje průtok částic do

VYNALEZU

100 000 daltonů v prostředí s fosfátovým pufrem o pH 7,1 až 7,3 a infektivita se odstraní formaldehydem.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se k natrávení užije pepsinu v koncentraci 0,05 mg/mg bílkoviny.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se antigen, zbavený bílkovin v plasmě, inaktivuje formaldehydem v množství 1: 2000 objemových dílů 96 hodin.