NO821927L - Fremgangsmaate for fremstilling av ren overflate antigen mot hepatitis b, fra plasma fra mennesker - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av ren overflate antigen mot hepatitis b, fra plasma fra menneskerInfo
- Publication number
- NO821927L NO821927L NO821927A NO821927A NO821927L NO 821927 L NO821927 L NO 821927L NO 821927 A NO821927 A NO 821927A NO 821927 A NO821927 A NO 821927A NO 821927 L NO821927 L NO 821927L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- plasma
- hbsag
- human
- pepsin
- amount
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 12
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 31
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 11
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 208000037319 Hepatitis infectious Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000463291 Elga Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical group OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av rent hepatit B overflateantigen (HBsAg) fra humanplasma. HBsAg er et viralprotein som opptrer i blodet hos folk som lider av infeksiøs hepatit, type B, eller som stadig er tilstede i blodet fra bærere av hepatit B-virus. HBsAg utgjør ved rensing fra det gjenværende plasmaprotein
en vaksine for infeksiøs hepatit B som ved inngivelse til mennesker eller dyr forårsaker fremstilling av HB<1>s antilegemer i pasientens organisme. Nevnte antilegemer beskytter organismen fra full infeksjon forårsaket av infeksiøstaktive partikler av hepatit B-virus.
Det er en kjent fremgangsmåte for fremstilling av rent HBsAg ved flere gangers sentrifugering av egnet prepa-rert plasma i densitetsgradienter, oppnådd fra sakkarose eller caesiumklorid. I fremgangsmåten for separering ved densitetsgradient ved ultrasentrifugering, dvs. ved sentrifugering med høye hastigheter, kan preparater av HBsAg oppnås fritt for gjenværende plasmaproteiner. Ultrasentrifuge-ringsmetoden er en meget tidkrevende metode, den krever tall-rike, kostbare apparaturer som benyttes for å oppnå små mengder av antigen kun for forskningsformål. Således er dette en laboratoriemetode, men ikke en produksjonsprosedyre. I denne metode er det ikke mulig å oppnå en større mengde materiale som er nødvendig for immunisering ved vaksine selv for en relativt liten gruppe personer.
Videre er de t kjent andre met oder for fre mstilling
av HBsAg som består i filtrering på gelpakkede kolonner, ved affinitetskromatografi, og ved elektroforese. Alle kjente metoder tillater ikke å oppnå antigen-preparater som helt er renset, de har alle laboratoriekarakter og er lite produktive.
Ifølge oppfinnelsen består fremgangsmåten for fremstilling av rent HBsAg i at det opprinnelige materiale befris for lipider og partielt fra humanplasmaproteiner, underkastes en fermentering med pepsin i en mengde av 0,01-0,50 mg/mg protein, fortrinnsvis 0,05 mg/mg protein, filtreres av på molekylfilter som tillater å slippe gjennom molekyler på opptil 100 000 Dalton i et fosfatbufret medium, opptil en pH- verdi på 7,1-7,3, mens infeksjonsevnen deretter desaktiveres ved hjelp av formaldehyd, fortrinnsvis i en andel på 1 : 2000 på volumbasis, i 96 timer.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir i motsetning til kjente metoder HBsAg som helt er befridd for plasmaproteiner. Nevnte antigen forårsaker når det benyttes som vaksine for infeksiøs hepatit, type B, noen sidevirkninger på pasienter som vaksineres. Videre kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benyttes i større produksjon av vaksine fra plasma som inneholder hepatit B-virusprotein.
Fremstillingen av renset hepatit B overflateantigen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skjer som følger.
I den første fase gjennomføres delipidisering av humanplasma. For dette gis 1000 ml plasma oppnådd fra donorer av HBsAg med en titer som bestemt ved immunoelektroosmo-utfelling (IEOP) på minst 1 : 10 en tilsetning på 1000 ml 0,1 mol MnCl2. 4 H20.
Etter tilsetning av manganklorid omrøres dette plasma i en elektromagnetisk rører ved isbadtemperatur i 1 time. Deretter sentrifugeres materialet i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Etter sentrifugering blir presipitatet som ikke inneholder HBsAg kastet.
Den overstående væske som oppnås etter sentrifugering bringes til en pH-verdi på 5,6 ved bruk av 0,1 1 HCl og poly-etylenglykol 6000 (PEG 6000) tilsettes i en mengde på 75 g pr. 1000 ml materiale. Deretter underkastes materialet om-røring i ca. 12 timer ved en temperatur på 4°C i en elektromagnetisk rører. Materialet blir etterat det er helt ut fra røreren, sentrifugert i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Overstående væske som ikke inneholder antigen kasseres, og for videre bearbeiding samles sedimentet, oppnådd fra sentrifugeringen.
♦ Dette sediment oppløses i 200 ml 0,9 NaCl,og oppløs-ningen fylles opp med avionisert vann til det volum materialet hadde før sentrifugering. Etter tilsetning av NaCl opptrer det påny bunnfelling i oppløsningen. Denne oppløsning underkastes ytterligere en gang sentrifugering i 30 minutter
med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Etter sentrifugering samles den overstående væske inneholdende HBs-antigen, sedimentet som ikke inneholder dette kasseres. Ved tilsetning av deionisert vann økes volumet av overstående væske til 10 000 ml. En liten mengde sediment som for-blir etter fortynning fjernes ved hjelp av sentrifugering i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Ved det ytterligere trinn i antigen-fremstillingsprosessen benyttes den overstående væske som oppnås ved sentrifugeringen.
Materialet som fremstilles ved delipidiseringen underkastes nu en fermentering med et enzym. For dette opp-varmes 10 000 ml av materialet til en temperatur på ca. 37°C, mens pH-verdien standardiseres til 2,5 ved hjelp av tilsetning av 1N HC1. Til materialet som fremstilles på denne-måte tilsettes pepsin Sigma som gjentatte ganger er krystallisert,
i mengder på ca. 0,05 mg pr. 1 mg proteinoppløsning. Inn-holdet av proteiner i oppløsningen bestemmes etter den spek-trofotometriske metode. Etter en tid på ca. 1 time avbrytes fermenteringen med pepsin ved standardisering av oppløsningen til en pH-verdi på 4,6 ved hjelp av 1N NaOH. Etter ferdig fermentering sentrifugeres oppløsningen av i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. I sedimentet etter sentrifugeringen påvises intet HBsAg, således at alt er overført til den overstående væske.
Fermenteringen med pepsin forårsaker en nedbrytning
av humanplasmaproteiner til polypeptidenheter med en størrel-se på ikke over 30 000 Dalton. HBsAg-proteinet underkastes imidlertid ikke fermentering.
Nu skjer en rensing av materialet fra plasmaproteiner fermentert med pepsin ved hjelp av molekylfiltrering på filteret som slipper gjennom partikler med størrelse opptil 100 000 Dalton. Til dette kan det benyttes et filtrerings-system med lukket krets, fremstilt av AMICON Company i USA, hvori materialet som skal filtreres mange ganger filtreres gjennom filtreringssonen der partikler kasseres fra oppløs-ningen ved hjelp av molekylfiltere med en størrelse mindre enn filtreringsgrensen. Ifølge oppfinnelsen benyttes det en filtrering gjennom filteret av typen H 1 x 100 som slipper gjennom partikler med størrelse opptil 100 000 Dalton. Den hele filtreringscyklus omfatter ni ganger pumping av materialet i et volum på 80 liter under et trykk på 6,2 atmosfærer. Før materialet tilføres til filtreringssystemet fortynnes
det til det ovenfor spesifiserte volum ved hjelp av et fosfatbufret, deionisert, apyrogent vann. Et slikt vann kan fremstilles i en apparatur fra ELGA Company, Storbritannia.
Under filtreringen skjer det en total utvasking av plasmaproteiner som tidligere er fermentert med pepsin. Materialet som oppnås ved filtreringssystemet inneholdende renset HBsAg, anbringes i andeler på 10 000 ml hver i et kjøleskap i 96 timer etter tilsetning av formaldehyd i mengde nødvendig til å oppnå en konsentrasjon i oppløsningen på ca. 1 : 2000 på volumbasis. Etter fjerning fra kjøleskapet fjernes formaldehyd fra materialet ved hjelp av dedialysering. Deretter gjennomføres adsorpsjon av HBsAg på aluminiumhydroksyd som tilsettes i en mengde av 1 mg pr. 1 ml oppløsning. Den ferdige vaksine som oppnås på denne måte fylles på ampuller.
Vaksinen som oppnås på den ovenfor beskrevne måte viser ved analyse med henblikk på humanplasmaproteiner etter dobbeltdiffusering i agar ingen utfellingslinjer ved 30 gangers fortykning med plasma av anti-humanproteiner. Nevnte vaksine inneholder altså ikke infeksiøse partikler av hepatit E-virus.
Eksemgel^
Fra en donor av HBsAg samles plasma ved hjelp av plasmaforese. Aktiviteten for HBsAg bestemmes ved hjelp av immunoelektroosmoforese med en titer ikke lavere enn 1 : 16. Dette humanplasma underkastes delipidiseringsprosessen ved tilsetning av, til 1 liter plasma, 1 liter 0,1 M MnCl~. 4 H^ O og 150 000 internasjonale enheter heparin i et volum på 30 ml. Dette materiale inkuberes ved en romtemperatur i en elektromagnetisk rører i et tidsrom på 0,5 timer. Etter at denne tid er forbi blir hele materialet sentrifugert på en Beckman J-6-sentrifuge i en rotor JA-10 med en hastighet på
6000 omdreininger pr. minutt i et tidsrom på 30 minutter.
Det oppnådde sediment, HBsAg (-), kasseres og overstående væske samles i en kolbe med en kapasitet på 2 liter.
Til materialet tilsettes det noe 7,5% PEG-oppløsning med en molekylmasse på 6000. pH-verdien bringes til 5,5 ved hjelp av 1N HC1. Materialet anbringes deretter i et kjøle-skap og inkuberes over natt under kontinuerlig omrøring.
Neste dag filtreres materialet av på Beckman J-6-sentrifugen i rotoren JA-10 ved 6000 omdreininger pr. minutt. Den overstående væske med HBsAg (-) kasseres, sedimentet opp-løses i 200 ml 10,9% NaCl og fylles opp med deionisert vann til et volum på 2 liter. Etter 20-30 minutter opptrer rikelig sediment som fjernes ved sentrifugering på Beckman J-6-sentri-fugen i rotoren JA-10 ved 6000 omdreininger pr. minutt i løpet av 30 minutter. Det oppnådde klarede filtrat viser HBsAg-aktivitet ved bruk av immunoelektroosmoforese med en titer på 1 : 8. Volumet av materialet økes deretter til 10 liter ved hjelp av deionisert vann (2 liter + 8 liter deinonisert vann). Etter 30 minutter observeres en avsetning av små mengder av et sediment som kasseres ved sentrifugering på Beckman J-6-sentrifugen i rotoren JA-10 ved 6000 omdreininger pr. minutt i et tidsrom på 30 minutter. Klaret, overstående væske oppnås hvis titer utgjør ca. 1 : 2 ved immunoelektroosmo-utfellingsprøven.
Til 10 liter overstående væske tilsettes 90 g NaCl, hvorved 0,9% NaCl-oppløsning oppnås.
Materialet som fremstilles på denne måte inkuberes ved en temperatur på 37°C i 12 timer. Etter dette tidsrom settes til væsken med en temperatur på 37°C og en pH-verdi på 2,5, pepsin i en mengde på 0,05 ml/ml, dvs. 0,5 g pepsin pr. 10 liter materiale. Pepsinfermenteringen av oppløsningen gjennomføres i 1 time ved 37°C. Etter 1 time stoppes fermenteringen ved å øke pH-verdien til 3,5 ved hjelp av 0,1 N NaOH.
Det gjenværende sediment sentrifugeres på Beckman J-6-sentrifugen. i JA-10-rotoren ved 6000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter og kasseres deretter. Den overstående væske underkastes molekylfiltrering i en apparatur DC 30 fra AMICON
Company ved bruk av hule fiberfiltere H 10 x 100.
Ved molekylfiltreringen oppnås materiale i en mengde på 10 liter og hvis titer ved immunoelektroosmo-utfelling av HBsAg utgjør 1 : 2.
Nevnte materiale viser ved 100 gangers fortykkelse ingen utfellingslinjer ved immunodiffusjonsteknikken på agar ved bruk av animal-plasma: anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, antihumanprotein og plasma-antihumanprotein.
Vaksinering av laboratoriedyr slik som marsvin eller kaniner med et 100 ganger fortykket materiale gir ingen immunologisk respons mot kontaminering av preparatet med proteiner fra humanplasma. Det oppnås kun en utfellingslinje med HBsAg-holdig materiale.
Materialet som ble oppnådd på den beskrevne måte er sterkt immunogent, slik det er prøvet ved vaksine på sjim-panser og ca. et dusin frivillige personer.
I materialet er det ikke påvist noe nærvær av HBcAg, HBeAg og DNA-polymerase ved bruk av tredje-generasjonsprøver.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av ren hepatit B overflateantigen fra humanplasma omfattende fjerning av lipider og en del av plasmaproteinene/ enzymatisk nedbrytning av gjenværende ballastproteiner og en siste isolering av immunologisk aktive antigenpartikler, karakterisert ved at det opprinnelige materiale som er de-lipidisert og partielt deproteinisert for plasmaproteiner underkastes fermentering med pepsin i en mengde på 0,01-0,50 mg/mg, fortrinnsvis 0,05 mg/mg, hvoretter det filtreres på et molekylfilter som slipper gjennom partikler opp til 100 000 Dalton i et fosfatbufret medium med en pH-verdi på 7,1-7,3,
og at infeksjonsevnen inaktiveres med formaldehyd.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at utgangsmaterialet underkastes en fermentering med pepsin i en mengde på 0,05 mg/mg protein.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antigenet som er renset for plasmaproteiner inaktiviseres med henblikk på infeksjonsevnen med formaldehyd i en mengde på 1 : 2000 vol./vol. i et tidsrom på 96 timer.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL1981231588A PL133476B1 (en) | 1981-06-10 | 1981-06-10 | Method of obtaining pure antigen hba from human serum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO821927L true NO821927L (no) | 1982-12-13 |
Family
ID=20008812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO821927A NO821927L (no) | 1981-06-10 | 1982-06-09 | Fremgangsmaate for fremstilling av ren overflate antigen mot hepatitis b, fra plasma fra mennesker |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4558011A (no) |
| JP (1) | JPS584729A (no) |
| AU (1) | AU8471282A (no) |
| CA (1) | CA1203169A (no) |
| CH (1) | CH650682A5 (no) |
| CS (1) | CS232726B2 (no) |
| DD (1) | DD202506A5 (no) |
| DE (1) | DE3221813A1 (no) |
| DK (1) | DK260482A (no) |
| ES (1) | ES8303916A1 (no) |
| FI (1) | FI822018A0 (no) |
| FR (1) | FR2507478A1 (no) |
| GB (1) | GB2099700B (no) |
| HU (1) | HU186864B (no) |
| IT (1) | IT1151793B (no) |
| NO (1) | NO821927L (no) |
| PL (1) | PL133476B1 (no) |
| PT (1) | PT75031B (no) |
| RO (1) | RO84231B (no) |
| SE (1) | SE8203435L (no) |
| SU (1) | SU1409121A3 (no) |
| YU (1) | YU116882A (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
| US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
| GB9822714D0 (en) | 1998-10-16 | 1998-12-09 | Smithkline Beecham Sa | Vaccines |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| DE2225548C3 (de) * | 1972-05-26 | 1980-05-29 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Intravenös verträglicher Impfstoff gegen Staupe- und Hepatite contagiosa canis |
| FR2303562A1 (fr) * | 1975-03-14 | 1976-10-08 | Community Blood Council Greate | Nouvelle preparation d'antigene utilisable comme vaccin |
| US4017360A (en) * | 1975-05-14 | 1977-04-12 | Merck & Co., Inc. | Method for purifying hepatitis B antigen |
| SE420977B (sv) * | 1976-03-18 | 1981-11-16 | Kabi Ab | Forfarande for rening och isolering av hepatitvirus for vaccinframstellning |
| SU810811A1 (ru) * | 1979-02-19 | 1981-03-07 | Институт Полиомиелита И Вирусныхэнцефалитов Amh Cccp | Способ получени вируса гепатитаА |
-
1981
- 1981-06-10 PL PL1981231588A patent/PL133476B1/pl unknown
-
1982
- 1982-06-03 YU YU01168/82A patent/YU116882A/xx unknown
- 1982-06-03 SE SE8203435A patent/SE8203435L/xx not_active Application Discontinuation
- 1982-06-07 FI FI822018A patent/FI822018A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1982-06-07 US US06/386,182 patent/US4558011A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-06-08 CA CA000404716A patent/CA1203169A/en not_active Expired
- 1982-06-08 CS CS824254A patent/CS232726B2/cs unknown
- 1982-06-08 PT PT75031A patent/PT75031B/pt unknown
- 1982-06-09 DD DD82240579A patent/DD202506A5/de unknown
- 1982-06-09 ES ES512971A patent/ES8303916A1/es not_active Expired
- 1982-06-09 NO NO821927A patent/NO821927L/no unknown
- 1982-06-09 SU SU823454639A patent/SU1409121A3/ru active
- 1982-06-09 AU AU84712/82A patent/AU8471282A/en not_active Abandoned
- 1982-06-09 DE DE19823221813 patent/DE3221813A1/de not_active Withdrawn
- 1982-06-09 IT IT21787/82A patent/IT1151793B/it active
- 1982-06-09 RO RO107839A patent/RO84231B/ro unknown
- 1982-06-10 FR FR8210146A patent/FR2507478A1/fr active Granted
- 1982-06-10 CH CH3598/82A patent/CH650682A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-06-10 HU HU821884A patent/HU186864B/hu unknown
- 1982-06-10 GB GB8216916A patent/GB2099700B/en not_active Expired
- 1982-06-10 DK DK260482A patent/DK260482A/da not_active Application Discontinuation
- 1982-06-10 JP JP57099922A patent/JPS584729A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2099700B (en) | 1984-12-19 |
| IT1151793B (it) | 1986-12-24 |
| ES512971A0 (es) | 1983-02-16 |
| SU1409121A3 (ru) | 1988-07-07 |
| DE3221813A1 (de) | 1983-02-17 |
| CS425482A2 (en) | 1984-06-18 |
| PT75031B (en) | 1984-05-09 |
| RO84231B (ro) | 1984-07-30 |
| PL133476B1 (en) | 1985-06-29 |
| CS232726B2 (en) | 1985-02-14 |
| AU8471282A (en) | 1982-12-16 |
| YU116882A (en) | 1985-03-20 |
| FR2507478B1 (no) | 1984-09-07 |
| IT8221787A0 (it) | 1982-06-09 |
| RO84231A (ro) | 1984-05-23 |
| DK260482A (da) | 1982-12-11 |
| DD202506A5 (de) | 1983-09-21 |
| JPS584729A (ja) | 1983-01-11 |
| PT75031A (en) | 1982-07-01 |
| SE8203435L (sv) | 1982-12-11 |
| FI822018A0 (fi) | 1982-06-07 |
| HU186864B (en) | 1985-10-28 |
| GB2099700A (en) | 1982-12-15 |
| US4558011A (en) | 1985-12-10 |
| CH650682A5 (de) | 1985-08-15 |
| CA1203169A (en) | 1986-04-15 |
| FR2507478A1 (fr) | 1982-12-17 |
| PL231588A1 (no) | 1982-12-20 |
| ES8303916A1 (es) | 1983-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4464474A (en) | Non-A, non-B hepatitis assay and vaccine | |
| JP2538224B2 (ja) | 百日咳抗原の精製 | |
| EP0071640A1 (en) | NOT-A, NOT-B HEPATITISVIRUS. | |
| DK145347B (da) | Fremgangsmaade til rensning af hepatitis b antigen | |
| JPH0331691B2 (no) | ||
| US4241045A (en) | Purified antigen to test for Neisseria gonorrheae antibodies | |
| CA1184846A (en) | Non-a, non-b hepatitis-associated antigen and diagnostic reagent | |
| US4351761A (en) | Purified antigen to test for Neisseria gonorrhoeae antibodies | |
| NO850025L (no) | Virusantigener, fremgangsmaate for erholdelse av disse og anvendelse av disse ved diagnose og terapi (podevaksine) | |
| NO821927L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av ren overflate antigen mot hepatitis b, fra plasma fra mennesker | |
| JPH051280B2 (no) | ||
| EP0068465B1 (en) | Non-a, non-b hepatitis-associated antibody conjugate, the use thereof and detection reagent | |
| EP0012686B1 (en) | Isolation of hepatitis be antigen | |
| Kasper et al. | Immunological studies of scrapie infection | |
| WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
| SU568378A3 (ru) | Способ получени препарата антигенов | |
| CN102731670B (zh) | Hib荚膜多糖纯化工艺 | |
| CN105586330B (zh) | 一种尖吻蝮蛇凝血酶及其制备方法 | |
| RU1776415C (ru) | Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ @ А @ ) | |
| RU1792709C (ru) | Способ отбора сырь дл получени антилептоспирозной плазмы | |
| SU1750689A1 (ru) | Способ получени полисахаридно-белковой вакцины против NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В | |
| Mistretta et al. | Identification of some HBAg (HAA) antigenic determinants by two-dimensional electro-immunodiffusion | |
| SU818621A1 (ru) | Способ получени поверхностногоАНТигЕНА гЕпАТиТА B | |
| RU1771749C (ru) | Способ очистки аллергена | |
| CN111505291A (zh) | 一种排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法 |