SU818621A1

SU818621A1 - Способ получени поверхностногоАНТигЕНА гЕпАТиТА B

Info

Publication number: SU818621A1
Application number: SU792770439A
Authority: SU
Inventors: Татьяна Васильевна Голосова; Владимир Алексеевич Бурлев; Елена Михайловна Власихина; Александр Михайлович Поверенный; Юрий Алексеевич Семин
Priority date: 1979-05-24
Filing date: 1979-05-24
Publication date: 1981-04-07

Description

45%-ный раствор полиэтиленгликол (ПЭГ) с молекул рной массой 6000 до конечной концентрации о7о

Осадок формируетс Б течение 4-5 час при комнатной температуре. Возможно дальнейшее формирование осадка в течение 13 час при . Ьыпавший осадок отдел ютдеитрифугированиемпри 1UOUO об/мик 3 течение мин. Супернатгкт не. содержит HBs-антигена (по дан1ШМ метод йИсуОФ и представлен альбунп .воЕ (по данным метода электрофореза на анега ной пленке).

Получеинь; осадок трехкратно застригируют Б О,) G jn растворе хлористого иатри Б сбьеме, с;1сгавл,:нзщем 1/10 часть от исходной сыворотки. Э :стракци10 провод т на ма1-к 1шой мешалке в течение 1-2 час н до гледуюашм центрифугированием при 3060-ШООО об/мин в течение 15-20 мин. .После /фехкратной экстракции осадок з дальн,ейшем не используют. Ьсли экстракцию не производ т, то осадок устойчив к хранению при с сохранением активности НВа-антигена в течение 1-2 мес цев.

Подготовленный экстракт диализуют против 0,15 М раствора хлористого натри в течение 24-48 час при 4С. Диализованный экстракт подвергают гель-хроматографии через сефадекс G-200. Используют колоЕку дл хроматографии размером 5,ОХ ХбО.О см, предварительно заполненную гелем н зквилабркрозанную 0,15 М раствором хлористого натри . Гел.ь-хрок.атографи ааправлена на получение первого макроглобул рного пика. Фракции, вход щие в этот пик, объе.дин ют и концентрируют, использу ультрафильтрадию. При проведении- ультрафильтрации целесообразно одновременно подвергать препарат проточному диализу 0,15 .М раствором хлористого натри .

По окончании ультрафильтрации раствор белка нанос т на преформированный ступенчатый градиент хлористого цези от 1,1 до 1,4 г/см. Ультрацентрифугирование провод т при 25000 об/мин в течение 18 час. Фракции после ультрацентрифугировани раздел ют на автоматическом коллекторе и объедин ют по наличию в них HBs-антигена в максимальных активност х. ОбъедиХарактеристика препарата

ненные фракции диализуют против 0,15 М раствора хлористого натри при и концентрируют ультрафильтр а иной.

Полученный препарат нанос т на линейный градиент плотности са.харооы от 1U до 20% и подвергают ультрацектрифугированию при 2оОио об/мин в течение 1й час. Но окончаник цeнтpиq)yгиpoвaни срракции, содержащие НВ -анткген, объедин ют и диализу1от против 0,1 М Трис-HCi буфера рН 7,2 в течение 24-4ч: час при . Диа.лизованный препарат подвергают аф1.нной хроматографии через Н01;итель, содержащий высскоактиБНые антитела к белкгд крсви человека. Элюат после афиынсй хромвтограф;-и концентрируют ультрафильтрацнсй и диализуют против 0,1 о М раствора .хлористого натр1 .

К полученному препарату поверхностного антигена гепатита В в соотношении 1 : i добавл ют раствор, содержащий 0,132 М е-лейцина и 0,0066 Л1 формальдегида. Дл приготовлени 100 мл раствора гмикометилольного соединени формальдегида и е-лейцина необходимо приготовить п смешать 50 мл раствора е-лейцина, добавив 1,73 г е-лейцина и 50 мл формальдегида из расчета; 0,1 мл 11,3 М раствора на 85,5мл физиологического раствора.

В случае радиоактивной метки HBs-антигена дл подготовки аминометилольного соединени формальдегида используют радиоактивный формальдегид по . Суммарна активность препарата может быть в пределах от 0,1 мк до 10,0 мк и более.

Полученную смесь белка и аминометклолького соединени формальдегида и е-лейцина выдерживают при 22-37°С в течение 72 час, после чего препарат мол4ет хранитьс при 4°С в течение одного года (срок наблюдени ) без изменени активности HBs-антигена с сохранением стерильности раствора.

Дл удалени непрореагировавшего аминометилольного соединени препарат подвергают гель-фильтрации через сефадекс G-50 или ультрафильтрации с проточным диализом.,

В таблице приведены результаты, подтверждающие стабильные свойства препарата при хранении.

Активность - антигена (титр в РПГА)

Препарат, обработанный аминометилольиым спедииспием формаль-1егида : е-лейuii;;;i . ч- чр и1ЯО1 имх.ушгеи-пмс .вопгтва вно -iaBiicuMocTH от способа вьслсни , по отпоiiOiiiiK ) 1ч пагивниму белку, не no.iBepri;;eмус одифинацни

Способ 110зв1л ет выдел ть препарат повер ппст1 ого антигена гепатита В и( сырь , 1ч дер к; 1цегп нл.нчне и BiiicoKSie титры НВ,,антигсна .

Препарат стабилен при храненнн и позвол ет хранить его в услов1 Ял бь1тового холодильника i4C} без изменени его антиген1;ых и иммуногенньгх свойств п исключает необходимость хранени препарата npjf низкпх температурах (-20, -40, - 196С), т|1ебую1цих специального оборудоваи; и э ;ергоресурсов.

Исиользование в качестве сырь дл получени препарата поверхностного антигена гепатита В выбракованной крови, содержащей НВ.5-антиген, позвол ет экономить в год от 50 до 100 тыс руб.

Формула и -i о б р е т е н и

Способ П11лучеи iioet рхностноги антигена гепатита В путем обработки плазмы

крови сол ной кислотой, отделени осадка, обработки надосадочной жидкости по,лнати .1епглико1ем с последующим выделением целевого проаукта из полученного оеадка и его счисткой концентрировани в градиенте плотности сахарозы и диализа, отличающийс тем, что, с целью поВ1;1шеннн стаби.1ьности целевого продукта в процессе хранени , полученный после обработки полиэти 1енгликолем осадок экстрагируют хлористым натрием, экстракт диалнзуют , затем подвергают гель-хроматографическому фракционированию, отбирают активные фракции, подвергают их улырафильтрации , ультрацентрифугированию Б в хлористом цезии, затем после диализа подвергают афинной хроматографии, полученный элюат концентрируют, диализуют и обрабатывают аминометилольным соединеппем формальдегида и е-лейцика.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

25 1. Методические рекомендации «Исследование крови доноров на антиген гепатита В, утвержд

43 СССР 11.07,74 г.

Claims

Формула изобретения

Способ получсия повтрхноетното антигена гепатита В путем обработки плазмы крови соляной кислотой, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости полиэти.тенгликеием с последующим выделением целевого продукта из полученного осад5 ка и его очисткой путем концентрирования в градиенте плотности сахарозы и диализа, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевого продукта в процессе хранения, полученный после обработки полиэти 1енгликолем осадок экстрагируют хлористым натрием, экстракт диализуют, затем подвергают гель-хроматографическому фракционированию, отбирают активные фракции, подвергают их ультрафильтрации, ультрацентрифугированию в в хлористом цезии, затем после диализа подвергают афинной хроматографии, полученный элюат концентрируют, диализуют и обрабатывают аминометилольным соединением формальдегида и ε-лейцина.