DE3117272C2

DE3117272C2 -

Info

Publication number: DE3117272C2
Application number: DE3117272A
Authority: DE
Inventors: Sugio Kodaira Tokio/Tokyo Jp Manabe; Taiichi Banno; Nagahiro Hachioji Tokio/Tokyo Jp Gocho; Masahiko Machida Tokio/Tokyo Jp Sakurada; Ryoichi Ohme Tokio/Tokyo Jp Orimo
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1980-05-02
Filing date: 1981-04-30
Publication date: 1989-11-30
Also published as: JPS56155835A; JPH0224337B2; US4472505A; DE3117272A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen von kinetischen Analysen von chemischen Substanzen mit stark unterschiedlichen Reaktionsverläufen.

Ein solches Verfahren ist aus der Zeitschrift Chem.-Ing.-Techn., 48. Jahrg. 1976/Nr. 5, Seiten 419-427 bekannt.

Ein derartiges Verfahren zum Messen der Konzentrationen und Aktivitäten von Substanzen, bei dem Absorptions- bw. Extinktionsänderungen oder Änderungen der optischen Dichte festgestellt werden, wird gelegentlich kinetische Untersuchung genannt und wird benutzt, um eine Anfangsreaktionsgeschwindigkeit zu messen. Im allgemeinen wird die Reaktion durchgeführt, indem eine Probenflüssigkeit mit einem Reagens zusammengebracht wird. Der Reaktionsverlauf ist von den jeweiligen Proben abhängig.

Fig. 1 zeigt eine übliche Kurve, die eine Extinktionsänderung in der Zeit darstellt. Der Reaktionsprozeß hat eine Verzögerungsphase (a), in der die Reaktion langsam voranschreitet, eine lineare Phase (b) mit linearem Reaktionsverlauf und eine Endpunktphase (c), in der die Reaktion beendet ist. Um bei einer kinetischen Untersuchung die Meßgenauigkeit zu verbessern, ist es absolut notwendig, die Messung in der linearen Phase (b) durchzuführen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden. Beispielsweise werden bei einem bekannten Verfahren für die jeweiligen Proben im voraus ein Meßanfangs- und ein Meßendpunkt festgelegt, und die zwischen diesen Punkten liegende Meßperiode wird in zwei Hälften geteilt. Die in diesen beiden Hälften gemessenen Werte werden miteinander verglichen, um festzustellen, ob die Messung in der linearen Phase (b) vorgenommen worden ist. Wenn die Messung als außerhalb der linearen Phase (b) liegend beurteilt wird, wird kein Analyseergebnis errechnet, und es wird ein Anomalitätszeichen ausgedruckt. Wenn jedoch bei diesem bekannten Verfahren das Anomalitätszeichen für eine bestimmte Probe ausgedruckt wird, muß die Messung für die betreffende Probe nochmals durchgeführt werden. Somit sinkt die Analyseleistung.

Zur Verbesserung der Leistung oder des Wirkungsgrades mit dem Ziel, exakte Messungen in kurzer Zeit durchzuführen, ist es notwendig, die Zahl der Messungen für die jeweiligen Proben zu erhöhen. Das heißt, daß die Zahl der Proben für die Messung der Extinktionsänderung erhöht werden muß, um eine große Menge Daten zu erhalten, die statistisch verarbeitet werden müssen. Außerdem beruht die Beurteilung, ob die Linearität angenommen werden kann, auf der folgenden Ungleichheit

worin A und B in der vorderen bzw. hinteren Halbperiode gemessene Werte sind. Wenn die Brauchbarkeit von Messungen nur nach einer solchen Ungleichheit geprüft wird, kann ein Einfluß der Verzögerungsphase nicht beseitigt werden, außer es werden strenge Bedingungen angewandt. Bei zu strengen Bedingungen kann es vorkommen, daß das Anomalitätszeichen unnötig, auch bei recht kleinen Veränderungen, ausgedruckt wird.

In der JP-OS 1 13 383/79 wird ein anderes bekanntes Absorptions- bzw. Extinktions-Meßverfahren zum Bestimmen chemischer Substanzen beschrieben. Nach diesem Verfahren werden Extinktionen von Prüfflüssigkeiten zu drei verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Zuerst wird eine Extinktionsänderung zwischen einem ersten Paar Meßstellen abgeleitet und dann mit einem Änderungsnormalwert verglichen. Wenn die gemessene Änderung größer ist als der Normalwert, wenn also die Probe eine bestimmte Substanz in einer ausreichend großen Menge enthält oder wenn die Aktivität der Probe ausreichend groß ist, wird die Konzentration oder Aktivität der bestimmten Substanz ausgehend von der gemessenen Extinktionsänderung berechnet. Wenn andererseits die Konzentration oder Aktivität der zu bestimmenden Substanz niedrig bzw. klein ist, wird sie ausgehend von einer Extinktionsänderung berechnet, die von den an der ersten und der dritten Meßstelle gemessenen Extinktionswerten abgeleitet wird. Weil bei diesem Verfahren die Konzentration oder Aktivität einfach aus einer Differenz der im Falle der hohen Konzentration an den beiden Meßstellen gemessenen Extinktionen errechnet wird, kann eine exakte Messung nicht erwartet werden. Um die Meßgenauigkeit zu erhöhen, ist es zweckmäßig, wenn an mehreren Stellen gemessene Daten erfaßt und auch im Falle einer hohen Konzentration nur Daten aus der linearen Phase benutzt werden. Außerdem wird gemäß dem bekannten Verfahren der Meßbereich nur bei niedriger Konzentration erweitert, und die Reaktion wird innerhalb dieses Bereiches nicht tatsächlich überwacht. Somit ist der Reaktionsverlauf nicht bekannt, ein hoher Zuverlässigkeitsgrad kann nicht erreicht werden. Ferner wird stets die an der ersten Meßstelle gemessene Extinktion benutzt. Jedoch ist insbesondere bei der Bestimmung einer enzym-katalisierten Reaktion die Verzögerungsphase (a) verhältnismäßig lang, und es besteht die Gefahr, daß der an der ersten Meßstelle gemessene Wert durch die Verzögerungsphase beeinflußt ist. Die Messung kann daher nicht exakt durchgeführt werden.

Wenn bei bekannten Verfahren die Menge einer bestimmten Substanz in einer zu bestimmenden Probe sehr klein ist und sich daher eine sehr kleine Extinktionsänderung ergibt, wird die Probe gewöhnlich als "nicht meßbar" behandelt. Auf diese Weise wird die Durchführbarkeit der Analyse in hohem Maße eingeschränkt. Ferner, wenn die Extinktion per se oder die Extinktionsänderung anomal groß ist, bleiben die Daten als "anomale Daten" unverwertet. Auch in einem solchen Falle ist es zweckmäßig, wenn Analyseergebnisse so exakt wie möglich abgeleitet werden. Wenn jedoch das so erhaltene Analyseergebnis auf diese Weise abgeleitet worden ist, kann es von durch normale Verarbeitung erhaltenen Analyseergebnissen nicht unterschieden werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein automatisches chemisches Analysiergerät derart zu betreiben, daß mit sehr hohem Durchsatz (d. h. hoher Leistung) sehr zuverlässige Analyseergebnisse für sehr unterschiedliche Proben und Reagentien gewonnen werden können, ohne daß eine Bedienungsperson bei unterschiedlichen Proben Anpassungsarbeiten vornehmen muß.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet.

In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung beschrieben.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine grafische Darstellung einer üblichen Reaktionskurve,

Fig. 2 eine vereinfachte Darstellung einer Ausführungsform eines automatischen chemischen Analysegerätes zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung,

Fig. 3 eine grafische Darstellung zur Erläuterung des Meßverfahrens gemäß der Erfindung,

Fig. 4 eine grafische Darstellung einer GOT-Reaktionskurve,

Fig. 5 eine grafische Darstellung einer CPK-Reaktionskurve,

Fig. 6 ein Flußdiagramm einer Beurteilungsstufe gemäß der Erfindung, und

Fig. 7 und 8 grafische Darstellungen verschiedener Reaktionskurven zur Erläuterung des Verfahrens gemäß der Erfindung.

In Fig. 2 ist der grundsätzliche Aufbau einer Ausführungsform eines automatischen chemischen Analysegerätes dargestellt, welches das Analyseverfahren gemäß der Erfindung durchführt. In dem dargestellten Analysegerät sind ein diskretes, absatzweise arbeitendes System und ein auf mehreren Ebenen sequentiell arbeitendes System vereint, in dem mehrere Proben nacheinander analysiert werden können. Mehrere Probenschalen mit je einer Probenflüssigkeit werden von einer Probenschalenhalteeinheit 2 gehalten, die als schleifenförmige Kette ausgebildet sein kann und in der von einem Pfeil A angegebenen Richtung von einer Probenschalenhalter-Vorschubvorrichtung 3 intermittierend fortgeschaltet wird. Wenn eine Probenschale 1 an einer Probenansaugstelle B verharrt, wird in ihr enthaltene Probenflüssigkeit von einer Probenabgabevorrichtung 4 in einer bestimmten Menge angesaugt, die einer oder mehreren für die jeweilige Probenflüssigkeit zu bestimmenden Substanzen entspricht. Die angesaugte Probenflüssigkeit wird an ein oder mehrere Reaktionsgefäße, beispielsweise Küvetten 6, an einer Probenabgabestelle C zusammen mit einem Verdünnungsmittel 5 abgegeben. Die Küvetten 6 werden an einer Küvettenhalteeinheit 7 gehalten und von einer Vorschubvorrichtung 8 in der von einem Pfeil D angegebenen Richtung eine Reaktionslinie entlang intermittierend vorgeschoben. Dieser Vorschub kann mit einem Takt von 10 Sekunden ausgeführt werden. Der Küvettenhalteeinheit 7 werden Küvetten 6 an einer Küvettenzuführstelle E aus einer Küvettenzuführvorrichtung 9 nacheinander zugeführt.

Die mit einer bestimmten Menge Probenflüssigkeit beschickte Küvette 6 wird in mehreren Schritten vorwärtstransportiert. In die Küvette 6 wird an einer Reagensabgabestelle F eine bestimmte Menge eines bestimmten Reagens zusammen mit einem Verdünnungsmittel 11 von einer Reagensabgabevorrichtung 10 zugegeben. Mehrere Reagenzien, die zum Bestimmen mehrerer Substanzen erforderlich sind, werden in entsprechenden Reagensflaschen 12 ₁ bis 12 _n bereitgehalten, die in einer Reagensflaschenvorschubvorrichtung 13 aufgenommen sind, welche in der von einem Pfeil G angegebenen Richtung bewegbar ist. Jede gewünschte Reagensflasche läßt sich in eine Reagensansaugstelle H weiterschalten. Auf diese Weise kann ein gewünschtes Reagens zum Bestimmen der gewünschten Substanz in die Reaktionsküvette 6 zugegeben werden. Eine ausreichende Vermischung der Probenflüssigkeit und des Reagens in der Küvette 6 läßt sich erreichen, wenn das Reagens und das Verdünnungsmittel von der Reagensabgabevorrichtung 10 mit einer entsprechenden Geschwindigkeit an die Küvette abgegeben werden. Sodann läßt man in der Küvette 6 eine bestimmte Reaktion ablaufen, um eine Prüfflüssigkeit zu bilden, die in der Küvette 6, während diese die Reaktionslinie D entlang vorwärtstransportiert wird, mehrmals mittels einer Vielzahl von fotometrischen Kolorimetern 14 ₁ bis 14 _n, beispielsweise mit 18 Kolorimetern, gemessen wird. Auf diese Weise lassen sich die Reaktionsbedingungen oder der Reaktionsverlauf an mehreren Meßstellen überwachen.

Das Analysegerät umfaßt ferner eine Gerätesteuereinheit 15 zum Steuern der Probenschalenzuführvorrichtung 3, der Probenabgabevorrichtung 4, der Reaktionsküvettenvorschubvorrichtung 8, der Reaktionsküvettenzuführvorrichtung 9, der Reagensabgabevorrichtung 10 und der Reagensflaschenvorschubvorrichtung 13. Die mit den Fotometern bzw. Kolorimetern 14-1 bis 14- n gewonnenen fotometrischen Werte werden einer Datenverarbeitungseinheit 16 zugeführt und von ihr entsprechend verarbeitet. Sowohl die Gerätesteuereinheit 15 und die Datenverarbeitungseinheit 16 werden von einer Zentraleinheit 17 gesteuert, in die mittels eines Dateneingabegerätes 18 Daten von außen eingegeben werden können und aus der Daten mittels eines Ausgabegerätes 19 auf einem Bildschirm dargestellt oder ausgedruckt werden können.

In Fig. 3 ist ein Zeitdiagramm dargestellt mit verschiedenen Zeitpunkten für die fotometrische Messung gemäß der Erfindung. Bei diesem Verfahren ist wesentlich, daß die Prüfflüssigkeiten mehrmals einer Fotometrie unterworfen werden. Bei der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsform geschieht dies mit mehreren Kolorimetern bzw. Fotometern 14-1 bis 14- n, die an der Reaktionslinie D angeordnet sind. Eine andere Möglichkeit besteht darin, mehrere fotometrische Messungen mit einem einzigen Fotometer durchzuführen, wobei die Prüfflüssigkeit mehrmals durch das Fotometer hindurchgeführt oder stets am Fotometer angehalten wird oder eine Kombination beider Methoden angewendet wird. Da die Fotometrie selbst für die vorliegende Erfindung nicht von solcher Bedeutung ist, braucht sie nicht ausführlich erläutert zu werden. In der folgenden Erläuterung werden mehrere fotometrische Messungen von einer Vielzahl Fotometern 14-1 bis 14- n gemäß Fig. 2 durchgeführt.

In Fig. 3 ist mit t ₀ der Zeitpunkt des Reaktionsbeginns bezeichnet, in dem eine bestimmte Menge einer Probenflüssigkeit mit einer bestimmten Menge eines bestimmten Reagens zu einer Prüfflüssigkeit gemischt wird. Die Prüfflüssigkeit erreicht dann in einem Zeitpunkt t ₁ ein erstes Fotometer 14-1, von dem eine erste Messung vorgenommen wird. Danach wird die Prüfflüssigkeit Messungen durch aufeinanderfolgende Fotometer 14-2 bis 14-18 unterworfen. Ein Zeitabstand T zwischen aufeinanderfolgenden Messungen ist mit 20 Sekunden angenommen. Die Zahl der Fotometer und der Zeitabstand T von 20 Sekunden sind nur beispielhafte Werte, die beliebig gewählt werden können.

Die Prüfflüssigkeit wird an allen Fotometerpositionen gemessen, um eine Vielzahl fotometrischer Daten zu gewinnen, die in einem Speicher der Zentraleinheit 17 gespeichert werden. Danach werden die fotometrischen Daten, die in einem nachfolgend Überwachungsbereich genannten vorbestimmten Abschnitt gemessen wurden, selektiv ausgelesen und danach beurteilt, ob sie in Übereinstimmung mit einem im voraus festgelegten Beurteilungsnormal brauchbar sind oder nicht. Beim gezeigten Beispiel werden die mit zehn Fotometern 14-5 bis 14-14 in den Zeitpunkten t ₅ bis t ₁₄ erhaltenen fotometrischen Daten vorläufig ausgewählt. Einzelheiten des Beurteilungsnormals werden weiter unten beschrieben. Wenn festgestellt wird, daß der Überwachungsbereich ausreichende Daten für die exakte und genaue Durchführung der Analyse enthält, werden diese fotometrischen Werte ausgewählt, um Analyseergebnisse abzuleiten bzw. zu gewinnen. Daher werden in diesem Falle fotometrische Werte, die vor dem Zeitpunkt t ₅ als dem Anfang eines Primärdaten-Verwendungsbereiches liegen, also in den Zeitpunkten t ₀ bis t ₄ gewonnen wurden, und solche, die nach dem Zeitpunkt t ₁₄ als dem Ende des Primärdaten-Verwendungsbereiches liegen, also zu den Zeitpunkten t ₁₅ bis t ₁₈ gewonnen wurden, vorläufig nicht benutzt, obwohl sie gespeichert worden sind.

Im umgekehrten Falle, wenn der Überwachungsbereich keine brauchbaren fotometrischen Werte enthält, werden für die Durchführung der Analyse diejenigen gespeicherten fotometrischen Werte benutzt, die nicht aus dem Überwachungsbereich stammen. Wenn beispielsweise die in der Analyse zu bestimmenden Substanzen Lactatdehydrogenase (LDH), α-Ketobuttersäuredehydrogenase ( α-HBD) und alkalische Phosphatase (ALP) sind, verläuft die Reaktion ab dem Reaktionsstartpunkt t ₀ rasch, und es ist notwendig, die zu den Zeitpunkten t ₀ bis t ₄ gewonnenen fotometrischen Werte zu benutzen. Wenn dagegen eine Extinktionsänderung klein ist, ist es zweckmäßig, eine Änderung über einen verhältnismäßig langen Zeitraum zu messen. Es ist dann erforderlich, die zu den späteren Zeitpunkten t ₁₅ bis t ₁₈ gemessenen fotometrischen Werte zu benutzen, um die Genauigkeit der Analyse zu erhöhen.

An Hand Fig. 4 und 5 wird nun erläutert, warum der Zeitpunkt t ₅ für den Primärdaten-Verwendungsbereich gegenüber dem Meßanfangspunkt t ₁ verzögert gesetzt wird. In Fig. 4 sind Reaktionskurven I und J für eine GOT-Reaktion dargestellt. Die Reaktionskurve I besteht aus einem ersten Kurventeil I ₁, in dem eine Reaktion, die durch eine Grundsubstanz bedingt ist, zu Reaktionsbeginn zu einer Reaktion hinzukommt, die durch eine zu bestimmende Substanz hervorgerufen wird, und aus einem zweiten Kurventeil I ₂, in dem die Bestimmung vorgenommen werden soll. Die Reaktionskurve J stellt eine Probe von anomal hoher Aktivität dar und besteht aus einem ersten Kurventeil J ₁, der bestimmt werden soll, und aus einem zweiten Kurventeil J ₂, in dem Substratmangel herrscht. Es ist jedoch unmöglich, den zweiten Kurventeil I ₂ für die Reaktionskurve I und den ersten Kurventeil J ₁ für die Reaktionskurve J automatisch auszuwählen. Zudem wird nicht absolut zugelassen, daß fehlerhafte Ergebnisse hervorgebracht werden können. Unter diesen Umständen ist es zweckmäßig, die in unstabilen Perioden gewonnenen fotometrischen Daten nicht zu benutzen.

In Fig. 5 ist eine bei der CPK-Bestimmung übliche Reaktionskurve K dargestellt. Die Reaktionskurve K besteht aus einem ersten Kurventeil K ₁, der die Verzögerungsphase darstellt, und aus einem zu bestimmenden zweiten Kurventeil K ₂. Die beiden Kurventeile K ₁ und K ₂ werden als linear betrachtet, doch ist der Kurventeil K ₁ offensichtlich nicht brauchbar. Um solche unbrauchbaren Daten zu eliminieren, wird der Anfangspunkt t ₅ des Primärdaten-Verwendungsbereiches nach dem Meßanfangspunkt t ₁ festgelegt, und die fotometrischen Werte zwischen diesem Anfangspunkt t ₅ und dem Endpunkt t ₁₄ des Primärdaten-Verwendungsbereiches werden als die im Überwachungsbereich vorläufig ausgewählt. Unter Benutzung dieser Werte im Überwachungsbereich wird eine erste Beurteilung vorgenommen. Im Vergleich mit der Benutzung aller fotometrischen Werte für eine Beurteilung läßt sich auf diese Weise die Durchführung der Beurteilung wesentlich vereinfachen.

Anhand von Fig. 6, 7 und 8 wird nun das Beurteilungsnormal näher erklärt. Fig. 6 zeigt ein Flußdiagramm des Beurteilungsvorganges, und in Fig. 7 und 8 sind mehrere Reaktionskurven für eine extinktionsmindernde und eine extinktionserhöhende Reaktion dargestellt.

Reaktionskurve a

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden also zu 18 Zeitpunkten t ₁ bis t ₁₈ fotometrische Messungen durchgeführt, um 18 fotometrische Werte, also Extinktionswerte, abzuleiten bzw. zu gewinnen. Diese Werte werden im Speicher vorübergehend gespeichert, und zehn fotometrische Werte innerhalb des Überwachungsbereiches werden als Primärdaten vorläufig ausgewählt. Zuerst wird festgestellt, ob von diesen Primärdaten OD ₅ bis OD ₁₄ alle größer sind als der größte Extinktionswert MAX.OD. Als der Größtwert MAX.OD kann ein Extinktionswert von 2 (OD=2) gesetzt werden. Bei der Reaktionskurve a sind alle Extinktionswerte innerhalb des Überwachungsbereiches größer als der MAX.OD = 2, und somit werden diese Werte als anomal erkannt. Eine Konzentration oder Aktivität wird dann nicht mehr berechnet. Als nächstes wird die betreffende zu bestimmende Substanz danach beurteilt, ob sie spezifisch ist. Wenn nein, werden keine Daten abgeleitet und es wird ein Anomalitätszeichen ausgedruckt.

Reaktionskurve b

In diesem Falle ändert sich die Extinktion innerhalb des Überwachungsbereiches solcherart, daß sie zuerst den größten Extinktionswert MAX.OD übersteigt, dann aber unter ihn absinkt. Es wird dann festgestellt, ob von den zehn vorläufig ausgewählten fotometrischen Werten OD ₅ bis OD ₁₄ innerhalb des Überwachungsbereiches wenigstens einer den Größtwert MAX.OD übersteigt. Im Falle der Reaktionskurve b liegt etwa die Hälfte der fotometrischen Werte über MAX.OD, und diese Probe wird als anomal erkannt. Danach wird die betreffende zu bestimmende Substanz danach beurteilt, ob sie eine extinktionserhöhende Reaktion auslöst. Da die zur Reaktionskurve b gehörige zu bestimmende Substanz eine extinktionsmindernde Reaktion auslöst, richtet sich eine weitere Beurteilung darauf, ob eine erste Extinktionsdifferenz Δ OD größer ist als die größte Extinktionsdifferenz MAX. Δ E. Diese erste Extinktionsdifferenz Δ OD ist die Differenz zwischen einem Extinktionswert, der zu einem ersten Zeitpunkt nach dem Absinken der Extinktion unter MAX.OD gemessen wurde, und einem im nächsten Zeitpunkt gemessenen Extinktionswert. Die größte Extinktionsdifferenz MAX. Δ E läßt sich für die jeweiligen zu bestimmenden Substanzen in zweckdienlicher Weise festlegen und kann etwa OD = 0,1 betragen. Wenn entschieden wird, daß die erste Extinktionsdifferenz Δ OD den Größtwert MAX. Δ E übersteigt, wird auch hier eine Anomalitäts-Beurteilung vorgenommen. Sodann wird weiter festgestellt, ob die betreffende zu bestimmende Substanz spezifisch ist. Im vorliegenden Falle ist die zu bestimmende Substanz nicht spezifisch. Unter den zehn Primär-Extinktionswerten OD ₅ bis OD ₁₄ werden dann die Werte ausgewählt, die kleiner als die größte Extinktion MAX.OD sind, und unter den aus diesen ausgewählten Werten errechneten Extinktionsänderungen wird die größte Extinktionsänderung als Analyseergebnis generiert. Da im vorliegenden Falle die betreffende zu bestimmende Substanz bereits einmal als anomal beurteilt wurde, kann nicht immer entschieden werden, daß das abgeleitete Ergebnis absolut korrekt ist. Daher wird das Ergebnis zusammen mit einem Sonderzeichen, z. B. einem Stern, ausgedruckt, um anzugeben, daß das betreffende Ergebnis als Referenz abgeleitet worden ist. Weil jedoch das Ergebnis durch möglichst exakte selektive Benutzung der Daten erhalten worden ist, ist das abgeleitete Ergebnis von verhältnismäßig hoher Zuverlässigkeit, auch dann, wenn das Ergebnis als Referenz dient.

Wenn dagegen die erste Extinktionsdifferenz Δ OD als von kleinerem Betrag als die größte Extinktionsänderung MAX. Δ E bewertet wird, wird festgestellt, ob sie kleiner ist als die kleinste Extinktionsänderung MIN. Δ E. Diese wird ebenfalls abhängig von den zu bestimmenden Substanzen im voraus in zweckdienlicher Weise festgelegt und kann beispielsweise auf 0,02 gesetzt werden. Wenn Δ OD größer als MIN. Δ E festgestellt wird, werden von den zehn Primärwerten innerhalb des Überwachungsbereiches die Werte ausgewählt, die als korrekte Daten in der linearen Phase anerkannt werden können. Diese Beurteilung kann auf verschiedene Weisen vorgenommen werden. Bei einem bevorzugten Beispiel einer solchen Beurteilung kann die folgende Ungleichung benutzt werden:

In dieser Ungleichung ist Δ Ei der Wert einer i-ten Extinktionsänderung, Δ Ei+1 der Wert einer (i+1)ten Extinktionsänderung, und der Schwellenwert x kann beispielsweise auf etwa 10 bis 15 Prozent gesetzt sein. Dann wird festgestellt, ob die Zahl der entsprechend der letztgenannten Beurteilung ausgewählten Daten größer ist als eine im voraus festgelegte Zahl n _x. Diese Zahl n _x kann zwischen 3 und 5 gesetzt werden. Wenn die Zahl der zulässigen Daten größer ist als die Normalanzahl n _x, werden Konzentrations- oder Aktivitätswerte als Differenzen von Extinktionswerten gerechnet, die in den zulässigen Daten, welche als innerhalb der linearen Reaktion liegend ausgewählt wurden, enthalten sind, und als Analyseergebnis wird dann ein Durchschnitt der errechneten Werte abgeleitet. Dieses Ergebnis wird, wie schon erwähnt, mittels der Vielzahl von Beurteilungen erhalten und somit ist seine Genauigkeit ziemlich groß. Bei der letztgenannten Beurteilung wird, wenn die Zahl der zulässigen Daten kleiner ist als die Normalanzahl n _x, eine Anomalität festgestellt, und es wird ein Konzentrations- oder Aktivitätswert als allen Daten innerhalb des Überwachungsbereiches errechnet und als Referenz abgeleitet.

Als nächstes wird der Fall erläutert, wenn die erste Extinktionsdifferenz Δ OD kleiner ist als die kleinste Extinktionsdifferenz MIN. Δ E. In diesem Falle werden die Extinktionswerte vom Meßanfangspunkt t ₁ bis zum Meßendpunkt t ₁₈ alle einmal angenommen. Sodann werden die Daten von einem Meßpunkt, hinter dem der Extinktionswert unter den größten Extinktionswert MAX.OD absinkt, bis zum Meßendpunkt t ₁₈ vorläufig ausgewählt. Danach werden Extinktionswerte, die als diejenigen in der linearen Reaktion und als solche zulässig betrachtet werden, entsprechend einem bestimmten Beurteilungsnormal ausgewählt. Dieses Normal kann durch die folgende Ungleichung ausgedrückt werden:

oder

|Δ Ei - Δ Ei + 1| < y′ ,

worin der Wert y wie der Wert x auf etwa 10 bis 15 Prozent gesetzt werden kann und der Wert y′ mit etwa 0,002 festgelegt werden kann. Wenn eine der beiden Ungleichheitsbedingungen erfüllt ist, werden die Daten als zulässig erkannt.

Als nächstes wird die Zahl der ausgewählten Extinktionswerte, die als zur linearen Reaktion gehörig und als solche als zulässig beurteilt worden sind, mit einer bestimmten Normalanzahl n _y verglichen, die genau wie die Normalanzahl n _x auf etwa zwischen 3 und 5 gesetzt werden kann. Wenn festgestellt wird, daß die Zahl der ausgewählten Daten größer als n _y ist, werden aus den ausgewählten Daten Konzentrations- oder Aktivitätswerte errechnet, und aus diesen wird dann als Analyseergebnis ein Durchschnitt abgeleitet. Wenn dagegen ermittelt wird, daß die Zahl der ausgewählten Daten nicht größer als n _y ist, wird auf Anomalität erkannt, und es wird ein aus allen gemessenen Daten errechneter durchschnittlicher Konzentrations- oder Aktivitätswert als Referenz abgeleitet.

Reaktionskurve c

In diesem Falle sind die innerhalb des Überwachungsbereiches gemessenen Extinktionswerte kleiner als die größte Extinktion MAX.OD und größer als die kleinste Extinktion MIN.OD. Sodann wird beurteilt, ob Differenzen Δ OD zwischen den Extinktionswerten innerhalb des Überwachungsbereiches positiv für die abnehmende Reaktion oder negativ für die zunehmende Reaktion sind. Beim gezeigten Beispiel handelt es sich um eine abnehmende Reaktion und die Extinktionsdifferenz Δ OD ist positiv. Die Beurteilung bzw. Entscheidung lautet daher "NEIN". Danach wird die gleiche Verarbeitung durchgeführt wie bei der Reaktionskurve b.

Reaktionskurve d

Bei dieser Reaktionskurve d wird der Extinktionswert im Überwachungsbereich kleiner als der kleinste Extinktionswert MIN.OD. Daher gehören zu den Daten innerhalb des Überwachungsbereiches die Extinktionswerte kleiner als MIN.OD; es wird eine vorläufige Entscheidung getroffen, daß Anomalität vorliegt. Sodann wird weiter ermittelt, ob der Extinktionswert am Anfangspunkt t ₅ des Primärdaten-Verwendungsbereiches kleiner ist als der niedrigste Extinktionswert MIN.OD. Die Entscheidung lautet in diesem Falle "NEIN". Sodann werden die Daten zwischen dem Anfangspunkt t ₅ des Primärdaten-Verwendungsbereiches und einem Zeitpunkt ausgewählt, in dem die Extinktion kleiner wird als MIN.OD. Aus den Daten innerhalb des Überwachungsbereiches werden also alle Extinktionswerte ausgewählt, die größer sind als MIN.OD. Aus den ausgewählten Werten werden dann Konzentrations- oder Aktivitätswerte errechnet und aus diesen wird als Analyseergebnis ein Durchschnitt abgeleitet und zusammen mit dem Referenzzeichen ausgedruckt.

Reaktionskurve e

In diesem Falle sind alle Extinktionswerte innerhalb des Überwachungsbereiches kleiner als der kleinste Extinktionswert MIN.OD. Wie bei der Reaktionskurve d wird daher eine vorläufige Entscheidung getroffen, daß eine Anomalität vorliegt. Außerdem ist der Extinktionswert am Anfangspunkt t ₅ des Primärdaten-Verwendungsbereiches kleiner als MIN.OD; ein Konzentrations- oder Aktivitätswert wird nicht mehr berechnet, und es wird nur ein Anomalitätszeichen ausgedruckt.

Reaktionskurve f

Weil alle innerhalb des Überwachungsbereiches gemessenen Extinktionswerte größer sind als der größte Extinktionswert MAX.OD, wird für die Reaktionskurve f zuerst die Anomalität festgestellt. Wenn jedoch in diesem Fall die zu bestimmende Substanz spezifisch ist, werden die Daten vom Meßanfangspunkt t ₁ bis zum Zeitpunkt t ₄, der unmittelbar vor dem Anfangspunkt t ₅ des Primärdaten-Verwendungsbereiches liegt, zusätzlich angenommen. Sodann werden aus allen Daten vom Meßanfangspunkt t ₁ bis zum Endpunkt t ₁₄ des Primärdaten-Verwendungsbereiches Konzentrations- oder Aktivitätswerte errechnet, von denen der höchste Wert als Referenz abgeleitet wird. Es wird also die Größe ausgewählt, welche die größte Extinktionsdifferenz Δ OD ergibt, und die aus der ausgewählten Größe errechnete Ausgabe wird als Analyseergebnis und Referenz abgeleitet.

Reaktionskurve g

In diesem Falle übersteigt der Extinktionswert den größten Extinktionswert MAX.OD innerhalb des Überwachungsbereiches. Sodann wird die Entscheidung, ob die Daten im Überwachungsbereich den MAX.OD übersteigenden Extinktionswert enthalten, mit "JA" getroffen, und es wird eine Anomalität festgestellt. Als nächstes wird ermittelt, ob die betreffende Reaktion eine zunehmende Reaktion ist. Da dies bei dem in Fig. 8 dargestellten Beispiel zutrifft, erfolgt die Beurteilung bzw. Entscheidung mit "JA". Ferner wird entschieden, ob die betreffende zu bestimmende Substanz spezifisch ist. Im zutreffenden Fall lautet die Entscheidung "JA". Sodann wird wie bei der Reaktionskurve f der Anfangspunkt des Primärdaten-Verwendungsbereiches vom Zeitpunkt t ₅ auf den Meßanfangspunkt t ₁ vorverlegt, es wird die Größe ausgewählt, welche die größte Extinktionsdifferenz ergibt, und ein aus der ausgewählten Größe errechneter Konzentrations- oder Aktivitätswert wird als Analyseergebnis und Referenz abgeleitet.

Reaktionskurve h

Bei der Reaktionskurve h sind alle Extinktionswerte innerhalb des Überwachungsbereiches kleiner als die größte Extinktion MAX.OD und größer als die kleinste Extinktion MIN.OD, und es handelt sich um eine zunehmende Reaktion. Die Entscheidung, ob die Extinktionsdifferenzen Δ OD innerhalb des Überwachungsbereiches positiv sind, wird daher mit "NEIN" getroffen, weil die Extinktionsdifferenzen negativ sind. Sodann wird beurteilt, ob die erste Extinktionsdifferenz Δ OD innerhalb des Überwachungsbereiches größer ist als MAX. Δ E. Wenn diese Entscheidung "JA" lautet, ist vorläufig eine Anomalität gegeben. Weiterhin wird ermittelt, ob die betreffende zu bestimmende Substanz spezifisch ist. Beim dargestellten Beispiel wird die Entscheidung mit "JA" getroffen. Sodann wird der anzunehmende Datenbereich, wie im Zusammenhang mit der Reaktionskurve f erläutert, erweitert. Unter den Daten werden die Extinktionswerte ausgewählt, welche die größte Extinktionsdifferenz ergeben, und aus den ausgewählten Extinktionswerten wird ein Konzentrations- oder Aktivitätswert errechnet. Dieser Wert wird zusammen mit dem Referenzzeichen ausgedruckt.

Wenn dagegen die erste Extinktionsdifferenz Δ OD kleiner ist als MAX. Δ E, werden die Daten in derselben Weise, wie im Zusammenhang mit der Reaktionskurve b erläutert, verarbeitet.

Reaktionskurve i

In diesem Falle sind alle Extinktionswerte innerhalb des Überwachungsbereiches kleiner als MAX.OD und größer als MIN.OD, ähnlich wie bei der Reaktionskurve h. Sodann wird entschieden, ob die Extinktionsdifferenzen innerhalb des Überwachungsbereiches positiv sind. In diesem Falle wird die Entscheidung mit "JA" getroffen. Sodann wird überprüft, ob ein Absolutwert einer Extinktionsdifferenz zwischen den Anfangs- und Endpunkten t₅ und t₁₄ des Primärdaten-Verwendungsbereiches größer ist als ein vorbestimmter Wert α. Der Wert α kann mit einem verhältnismäßig kleinen Betrag, beispielsweise zwischen 0,001 und 0,002, gesetzt werden. Wenn ein Ergebnis dieser Beurteilung "JA" lautet, ist die Anomalität festgestellt. Sodann wird keine Berechnung mehr durchgeführt, und es wird nur das Anomalitätszeichen ausgedruckt. Wenn dagegen festgestellt wird, daß der vorgenannte Absolutwert der Extinktionsdifferenz |Δ OD | kleiner ist als α, wird als Analyseergebnis ein Konzentrations- oder Aktivitätswert Null abgeleitet (der von "keine Daten" unterschieden werden sollte). Auf diese Weise läßt sich für eine solche spezielle Probe ein brauchbares Analyseergebnis erzielen, das den Konzentrations- oder Aktivitätswert Null darstellt. Bei bekannten Verfahren dagegen wird eine solche Probe lediglich als anomale Probe behandelt, weil das Signal nicht deutlich von Rauschen unterschieden werden kann.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird bei der Entscheidung darüber, ob die Daten als zum linearen Reaktionsbereich zugehörig zugelassen werden können, der Schwellenwert in Übereinstimmung mit einem Konzentrations- oder Aktivitätswert geändert, und es werden weiterhin zwei Beurteilungs- oder Entscheidungsbedingungen bereitgestellt; wenn eine von ihnen erfüllt ist, werden die Daten als zum linearen Reaktionsbereich gehörig erkannt. Die erste Entscheidungsbedingung ist durch die folgende Ungleichheit gegeben:

worin Δ Ei eine Extinktionsdifferenz zwischen benachbarten Meßpunkten und Δ Ei+1 eine Extinktionsdifferenz zwischen nächsten benachbarten Meßpunkten ist, und y der Schwellwert ist. Die zweite Bedingung ist gegeben durch die Ungleichung

|Δ Ei - Δ Ei + 1| < y′ ,

worin y′ der Schwellenwert ist. Es sei darauf hingewiesen, daß in der ersten Ungleichung der Divisor

durch Δ Ei ersetzt werden kann.

In einem Bereich mit niedriger Konzentration oder Aktivität wird der Divisor der ersten Ungleichung klein, und selbst wenn ein Dividend |Δ Ei-Δ Ei+1| klein ist, kann der ganze Wert groß werden. Daher wäre es sehr schwierig, die Daten zu erhalten, die als im linearen Reaktionsbereich liegend zulässig sind. Wenn zur Vermeidung eines solchen Nachteils der Schwellenwert y verhältnismäßig hoch festgelegt wird, werden in einem Bereich hoher Konzentration oder Aktivität nahezu alle Daten als im linearen Reaktionsbereich liegend und somit zulässig beurteilt werden. Dies ist nicht sehr störend. Wenn daher der Schwellenwert y zwischen den Bereichen niedriger und hoher Konzentration oder Aktivität geändert wird, ist es möglich, sowohl für den Bereich mit niedriger als auch für den Bereich mit hoher Konzentration eine sehr exakte Beurteilung vorzunehmen. Wenn jedoch Δ Ei extrem klein ist und nahe Null beträgt, wird der Schwellenwert gelegentlich überschritten und eine unnötig große Datenmenge wird als anomal festgestellt. Für diesen Fall steht die zweite Bedingung zur Verfügung, und selbst wenn die erste Bedingung nicht erfüllt ist, ist es zweckmäßig, die Daten als im linearen Reaktionsbereich liegend zu beurteilen, wenn die zweite Bedingung erfüllt ist.

Claims

1. Verfahren zum Durchführen von kinetischen Analysen von chemischen Substanzen mit stark unterschiedlichen Reaktionsverläufen, gekennzeichnet durch die Kombination, daß

a) eine Probenflüssigkeit und zumindest ein Reagens gemischt werden und photometrische Messungen des Reaktionsverlaufes in einem Zeitintervall (t₁-t₁₈) zu einer Vielzahl von Zeitpunkten (t₁, t₂, . . ., t₁₈) durchgeführt und die Meßwerte gespeichert und ausgewertet werden,
b) aus der Vielzahl photometrischer Meßwerte eine Gruppe ausgewählt wird, deren Meß-Zeitpunkte (t₅, . . ., t₁₄) in einem Sub-Zeitintervall (t₅-t₁₄) liegen, welches derart im Zeitintervall (t₁-t₁₈) liegt, daß vor und/oder nach ihm mehrere Reserve-Meßzeitpunkte (t₁, t₂, . . ., t₄ bzw. t₁₅, t₁₆, . . ., t₁₈) nicht in ihm enthalten sind,
c) die Meßwerte aus dem Sub-Zeitintervall (t₅-t₁₄) mit vorgegebenen Vergleichswerten (MAX.OD, MIN.OD) und/oder untereinander verglichen werden, um zu prüfen, ob sich aus ihnen ein Analyseergebnis ermitteln läßt, und
d) daß dann, wenn sich kein Analyseergebnis ermitteln läßt, zumindest einer der an den Reservemeßzeitpunkten (t₁, t₂, . . ., t₄ bzw. t₁₅, t₁₆, . . ., t₁₈) gewonnenen Meßwerte zur Ermittlung des Analyseergebnisses herangezogen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt c beim Vergleich der Meßwerte aus dem Sub-Zeitintervall (t₅-t₁₄) geprüft wird, ob jeder der Meßwerte einen Grenzwert übersteigt, welcher zumindest annähernd einem Extremwert der linearen Phase (b) des Reaktionsverlaufes entspricht, und daß bei positivem Ergebnis dieser Prüfung, im Verfahrensschritt d Meßwerte zu den Reserve-Meßzeitpunkten (t₁, t₂, . . ., t₄ bzw. t₁₅, t₁₆, . . ., t₁₈), die kleiner sind als der Grenzwert, herangezogen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt c geprüft wird, ob die Meßwerte aus dem Sub-Zeitintervall (t₅-t₁₄) aus der linearen Phase (b) des Reaktionsverlaufes stammen und daß im Verfahrensschritt d zu den Reserve-Meßzeitpunkten (t₁, t₂, . . ., t₄ bzw. t₁₅, t₁₆, . . ., t₁₈) gewonnene Meßergebnisse herangezogen werden, die aus der linearen Phase (b) des Reaktionsverlaufes stammen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt c geprüft wird, ob die Anzahl der Meßwerte aus der linearen Phase (b) des Reaktionsverlaufes eine vorgegebene Anzahl übertrifft und daß nur in dem Fall, daß die vorgegebene Anzahl übertroffen wird, aus diesen Meßwerten das Analyseergebnis ermittelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt c ermittelt wird, ob die Meßwerte des Sub-Zeitintervalls (t₅-t₁₄) mit dem Reaktionsverlauf fallen oder steigen, je nach dem, ob die betreffende Reaktion fallende oder steigende Meßwerte ergibt, daß die Änderungsrate der Meßwerte ermittelt wird und daß die ermittelte Änderungsrate mit einem vorgegebenen, sehr kleinen Wert verglichen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der sehr kleine Vergleichswert im Bereich von 0,001 bis 0,002 liegt.