DE3026805C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biolo­ gisch verträglichen Materialien durch Immobilisierung von Apyrase auf der Oberfläche von polymeren Trägern, ausgenommen CM-Cellulose, oder Metall­ trägern. Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens. Die Erfindung betrifft auch das so hergestellte biologisch verträgliche Material, besonders in Form von Sonden, Rohren, Schläuchen, Nadeln, Membranen, Prothesen oder künstlichen Organen. Apyrase ist ein Enzym, das die Umwandlung von Adenosindiphosphat (ADP) zu Adenosinmonophosphat (AMP) katalysieren kann, woran sich die Umwandlung des letzteren in Adenosin anschließt.

Die Möglichkeit, verschiedenen Materialtypen biologisch verträg­ liche Eigenschaften zu verleihen, ist gegenwärtig von außerordent­ licher praktischer Bedeutung. So gibt es Materialien, die auf­ grund ihrer guten mechanischen maschinellen Bearbeitungs- und Festigkeitseigenschaften und der Abwesenheit von Toxizität un­ mittelbare Anwendung bei der Herstellung von Prothesen mittlerer oder langer Dauer, für Implantationszwecke oder bei der Herstel­ lung von Elementen für Hilfsmaschinen zur Verwendung in einem sich außerhalb des Körpers befindlichen Kreislauf wie einer Nieren- Dialyseapparatur oder von Herz-Lungen-Maschinen Anwendung finden.

Zu diesem Zweck könnten Materialien verwendet werden, die inner­ halb eines sehr breiten Bereichs von aliphatischen oder aromati­ schen Polyamidpolymeren, Polyestern, Polycarbonaten, Polyuretha­ nen und PVC bis zu speziellen Metallegierungen liegen. Unglückli­ cherweise ist jedoch die Verwendung dieser Materialien in erhebli­ chem Ausmaß aufgrund ihrer allgemein schlechten biologischen Ver­ träglichkeit eingeschränkt. Der Grund hierfür ist der, daß solan­ ge ein fremdes Material in den Blutkreislauf eingeschaltet wird, es unmittelbar zur Bildung von Thromben durch die Initiierung eines äußerst komplizierten Prozesses kommt.

Es wird angenommen, daß zuerst eine Adhäsion der Blutplättchen an der Materialoberfläche stattfindet, woran sich eine Freisetzung von ADP und Serotonin aus den Plättchen anschließt, die dann eine Plättchenaggregation verursacht. Die Plättchenaggregation stellt selbst eine fundamentale Stufe bei der Bildung von Throm­ ben dar. Der Grund hierfür ist der, daß sie durch Beschleunigung der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin Anlaß zur Freisetzung von Phospholipiden, die bei den Blutkoagulationsverfahren we­ sentlich sind, gibt.

Die Rolle des Adenosindiphosphats (ADP) als Plättchenaggrega­ tionsauslöser und somit als Initiator des Thrombenbildungs­ prozesses ist allgemein bekannt (siehe z. B. die grundlegende Arbeit von A. Gaarder und A. Hellem, in Nature 192, 531 (1961)). Es ist daher offensichtlich, daß die Immobilisierung eines Enzyms wie Apyrase (welche das Adenosindiphosphat (ADP), das bei der Adhäsion der Plättchen an der Oberfläche des Materials, das mit dem Blut in Kontakt gebracht wird, gebildet wird, in Adenosinmonophosphat (AMP) und Adenosin umwandeln kann), die anschließende Plättchenaggregation inhibieren kann und somit gleichzeitig die Bildung von Thrombosen blockiert. In diesem Zusammenhang wurde weiterhin gefunden, daß die Immobilisierung von Apyrase an der Oberfläche von thrombogenen Materialien diesen letzteren zufriedenstellend biologisch verträgliche Eigenschaften verleiht. Diese Eigenschaften hängen nicht von dem für die Immobilisierung des Enzyms verwendeten System ab.

Es ist bekannt, daß Apyrase zur Eliminierung von ADP im Blut befähigt ist (Myrbäck, The Enzymes, Band II, Teil 1, 1951, S. 151 bis 161, besonders S. 152). Weiterhin ist es bekannt, daß Enzyme in Mikrokapseln eingeschlossen werden können, um damit enzymatische Reaktionen durchführen zu können (Science, Band 146, 1964, S. 524/525). Schließlich ist es bekannt, daß man Produkte mit enzymatischer Aktivität herstellen kann, indem das Enzym an Polymere gebunden wird und diese Produkte dann wiederholt für enzymatische Reaktionen verwendet werden können (Chemical Abstracts, Band 56, 1962, 7702h, Referat des israelischen Patents 13 950), jedoch ist in diesen Literatur­ stellen nur allgemein von Enzymen die Rede, Apyrase ist nicht erwähnt.

In der Zeitschrift Chemtech Januar 1974 ist im Kapitel Enzyme Engineering auf Seite 47-55 die Immobilisierung von verschiedenen Enzymen, u. a. auch von Apyrase, durch kovalente Bindung beschrieben. In Tabelle 3 auf Seite 48 ist das Enzym Apyrase erwähnt, als Trägermatrix ist CM-Cellulose genannt, und als Bindungsmittel ist Woodward′s Reagent K genannt. Auf Seite 49, linke Spalte, ist von einer Methode der Enzym­ immobilisierung die Rede, auf Seite 49, rechte Spalte, dieses Artikels ist weiter ausgeführt, daß die Immobilisierung von Enzymen über kovalente Bindung oder durch intramolekulares Vernetzen verschiedene Schwierigkeiten beseitigen kann. Es ist jedoch dazu erwähnt, daß die kovalente Bindung die Struktur des Enzyms verändert und seine Aktivität abändern kann. Der aktive Sitz des Enzyms kann beeinträchtigt werden, was zu einem größeren Verlust an Aktivität führt.

Infolgedessen war es nicht naheliegend und sehr überraschend, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren die Immobilisierung von Apyrase ohne Aktivitätsverlust möglich ist. Es ist weiterhin sehr überraschend, daß die Immobilisierung des Enzyms Apyrase an der Oberfläche von medizinisch zu ver­ wendenden Gerätschaften die Bioverträglichkeit derselben er­ möglicht und diese biologisch verträglich gemacht werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von biologisch verträglichen Materialien ist also dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym Apyrase auf der Oberfläche von polymeren Trägern, ausgenommen CM-Cellulose, oder Metallträgern immo­ bilisiert.

Die Immobilisierung kann durch Absorption und anschließende Quervernetzung an der Oberfläche der polymeren Ma­ terialien oder sogar an Metalloberflächen, beispielsweise an der Oberfläche von Nadeln, die für arterio-venöse Verbindungen in einem sich außerhalb des Körpers befindlichen Kreislauf verwen­ det werden, erfolgen.

Alternativ kann die Apyrase kovalent an funktionelle Gruppen ge­ bunden werden, die sich an der Oberfläche der Materialien befin­ den, deren biologische Verträglichkeit erhöht werden soll. In der Tat ist es möglich, soweit erforderlich, zuvor das Material derart zu aktivieren, daß die reaktiven Gruppen an seiner Ober­ fläche, die für die Immobilisierung der Apyrase verwendet werden kann, freigesetzt werden.

Beispielsweise kann das Enzym kovalent an Amino-(oder Carboxyl-)­ gruppen von einer milden Oberflächenhydrolyse unterworfenen ali­ phatischen oder aromatischen Polyamiden geknüpft werden.

In der gleichen Weise können Carboxylgruppen von oberflächen­ hydrolysierten Polyestern verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Man stellte Nylon-6-Ringe (Länge 9 mm, Innendurchmesser 4 mm, Außendurchmesser 5 mm) her, wobei man während der maschinellen Bearbeitung sorgfältig darauf achtete, daß sie an den Ecken ab­ geschrägt und gerundet wurden.

Entlang der Mitte der Außenseite des Ringes wurde um seinen gesam­ ten Umfang herum ein Einschnitt von 0,25 mm Tiefe angebracht.

Die Ringe wurden in 3,5 N HCl eine Stunde bei 37°C hydrolysiert. Die Tatsache, daß die Oberflächenhydrolyse des Nylons durchgeführt wurde, wurde durch einen colorimetrischen Test bestätigt, der durch Eintauchen der mit Wasser gewaschenen Ringe in eine Lösung, die 0,1% Gew./Vol. Trinitrobenzolsulfonsäure in gesättigtem Te­ traborat enthielt, erfolgte.

Nach etwa einer Stunde bestätigte die Bildung einer orangen Fär­ bung an der Nylonoberfläche, daß die Hydrolyse stattgefunden hat­ te. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Ringe in eine 2,5%ige Glu­ taraldehydlösung eingetaucht und 3,5 Stunden bei 4°C eingetaucht gelassen. Die Ringe wurden dann rasch in eisgekühltem Wasser ge­ waschen und in eine 0,01 M Phosphatpufferlösung, die 8 mg/ml Apy­ rase (spezifische Aktivität 3,4 I.E./mg unter Verwendung von ADP als Substrat) enthielt, eingetaucht. Man ließ die Reaktion einen Tag und eine Nacht bei 4°C ablaufen. Am Ende der Reaktion wurden die Ringe in destilliertem Wasser gewaschen und es wurde ein Test bezüglich der enzymatischen Aktivität durchgeführt. Ein Ring wur­ de in 50 ml einer 0,1 Tris-HCl-Pufferlösung von pH 7,4 einge­ taucht, die 0,25 mg/ml ADP und 0,5 mg/ml CaCl₂ enthielt.

Die Mischung wurde bei 25°C unter Rühren gehalten. Man entnahm 1 ml Proben in Zeitabständen von 30 Minuten und analysierte sie, um anorganische Phosphate zu bestimmen, gemäß der Methode von Fiske und Subbarrow (C.H. Fiske, Y. Subbarrow; J. Biol. Chem. 66, 375 (1925)). Man ermittelte an den Ringen eine enzymatische Ak­ tivität von 4,5 µM anorganischer Phosphate, die in einer einstün­ digen Reaktion freigesetzt wurden.

Die mit Apyrase covalent an die oberflächlichen Aminogruppen ge­ bundenen Nylonringe wurden einem in vivo-Bioverträglichkeits­ test unterzogen, indem man sie in die Femoralvene von Hunden durchschnittlicher Größe einsetzte.

Das Einsetzen erfolgte unter Vollanaesthesie und als der Ring in die Vene eingesetzt worden war, wurde er mit Hilfe eines Sei­ denfadens fixiert. Man vernähte die Wunde und verabreichte dem Tier Antibiotika.

Ein anologer unbehandelter Nylonring wurde zu gleichen Zwecken unter Befolgung des gleichen Verfahrens eingesetzt.

Nach einer Einsatzdauer von 15 Tagen wurden die Ringe entnommen und untersucht.

Der Ring mit Apyrase erwies sich als durchlässig, während der Ver­ gleichsring vollständig durch Thromben okkludiert war.

Eine Messung an dem vom Hund entnommenen Ring mit Apyrase zeigte, daß 4 µM anorganische Phosphate in einer Stunde freigesetzt wur­ den.

Beispiel 2

Man stellte Nylon-6-Ringe analog den in Beispiel 1 beschriebenen her und tauchte sie in eine 0,01 M Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7, die 8 mg/ml Apyrase enthielt, ein.

Nach 4 Stunden wurde ein doppeltes Volumen einer 2,5%igen Glutaraldehydlösung in einer 0,01 M Phosphatpufferlösung bei pH 7 zugegeben.

Man ließ die Mischung einen Tag und eine Nacht bei 4°C reagieren. Die Ringe wurden dann gewaschen und einem Test hinsichtlich der enzymatischen Aktivität gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Ver­ fahren unterzogen.

Für die enzymatische Aktivität wurde ermittelt, daß sie etwa 2 µM anorganischer Phosphate in einer Stunde durch einen einzigen Ring freisetzte. Der in vivo-Bioverträglichkeitstest wurde durchge­ führt, indem man die Ringe mit Apyrase und die Vergleichsringe in die Femoralvene von Hunden durchschnittlicher Größe einsetzte.

Die für diesen Zweck befolgte Methode wurde in Beispiel 1 angegeben. Nach einer Einsatzdauer von 15 Tagen wurden die Ringe entnommen. Der Ring mit Apyrase erwies sich als durchlässig und die gemesse­ ne enzymatische Aktivität war etwa 2 µM anorganischer Phosphate, die in eine Stunde freigesetzt wurden, äquivalent.

Der Vergleichsring war jedoch vollständig okkludiert.

Beispiel 3

Man stellte analog den in Beispiel 1 beschriebenen Ringen Poly­ äthylenterephthalatringe her. Die Ringe wurden in 1 M NaOH 5 Stun­ den bei 50°C hydrolysiert. Die Ringe wurden anschließend gewaschen und in 50 ml einer Lösung eingetaucht, die 8 mg/ml Apyrase und 10 mg/ml N-Äthyl-N′-(3-dimethylaminopropylcarbodiimid) in einem 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 6,8 enthielt. Die Reaktion wurde eine Nacht bei 4°C durchgeführt. Auf diese Weise wurde die Apyra­ se an den Träger durch die Bildung einer Amidobindung zwischen den ε-Aminolysingruppen des Enzyms und den Carboxylgruppen des oberflächenhydrolysierten Polyesters gebunden. Der enzymatische Aktivitätstest an den Ringen, der wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, ergab Werte von etwa 4 µM anorganischer Phosphate, die in einer Stunde je Ring freigesetzt wurden. Der in vivo-Bio­ verträglichkeitstest wurde durchgeführt, indem man Polyester­ ringe mit Apyrase und nicht-behandelte Ringe in die Femoralvene von Versuchshunden einsetzte. Man befolgte die in Beispiel 1 be­ schriebene Methode. Nach einer 15tägigen Einsatzdauer wurden die Ringe entnommen. Der Vergleichsring war vollständig okklu­ diert, während der Ring mit Apyrase durchlässig war, wobei ledig­ lich einige sporadische Thromben vorhanden waren.

Der enzymatische Aktivitätstest an dem Ring nach den in vivo- Einsätzen ergab etwa 3 µM anorganischer Phosphate, die in einer Stunde freigesetzt wurden.

Beispiel 4

Man stellte analog den in Beispiel 1 beschriebenen Ringen Poly­ äthylenterephthalatringe her. Die Apyrase wurde unter Befolgung des in Beispiel 2 angegebenen Verfahrens an diesen Ringen querver­ netzt. Nach der Immobilisierung fand man für die enzymatische Ak­ tivität je Ring etwa 3 µM in einer Stunde freigesetzter anorgani­ scher Phosphate. Der in vivo-Bioverträglichkeitstest an Hunden wurde unter Befolgung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode durchgeführt und ergab für die Ringe mit Quervernetzung in der Apyrase positive Ergebnisse, wobei diese Ringe sich als durchläs­ sig und nahezu vollständig frei von Thromben erwiesen, wohin­ gegen die Vergleichsringe okkludiert waren. Die verbliebene enzy­ matische Aktivität an den Ringen betrug etwa 2,5 µM in einer Stun­ de freigesetzter anorganischer Phosphate.

Beispiel 5

Man stellte analog den in Beispiel 1 beschriebenen Ringen C-50- Stahlringe her. Die Apyrase wurde an einigen derselben durch Quervernetzung mit Glutaraldehyd nach dem in Beispiel 1 beschrie­ benen Verfahren fixiert. Man bestimmte die immobilisierte Akti­ vität an jedem Ring und ermittelte für sie etwa 1,5 µM anorgani­ scher Phosphate, die in einer Stunde freigesetzt wurden. Der in vivo-Bioverträglichkeitstest wurde an Versuchshunden, wie vorher beschrieben, durchgeführt.

Nach einer 15tägigen Einsatzdauer wurden die Ringe entnommen und untersucht. Während man für die Vergleichsringe fand, daß diese okkludiert waren, ergab sich für die mit Apyrase quervernetzten Ringe, daß sie offen waren, wobei sich an ihrer Innenseite ledig­ lich geringfügige Thromben befanden.

Für die verbliebene Aktivität an den mit Apyrase behandelten Rin­ gen nach dem Einsatz ermittelte man 0,9 µM je Stunde freige­ setzter anorganischer Phosphate.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von biologisch verträglichen Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym Apyrase auf der Oberfläche von polymeren Trägern, ausgenommen CM-Cellu­ lose, oder Metallträgern immobilisiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der polymere Träger ausgewählt wird unter mild bzw. schwach hydrolysierten alliphatischen und aromatischen Polyamiden, Polyestern und Cellulosepolymeren.

3. Biologisch verträgliches Material, erhältlich gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2.

4. Biologisch verträgliches Material gemäß Anspruch 3 in Form von Sonden, Rohren, Schläuchen, Nadeln, Membranen, Prothesen oder künstlichen Organen.