CH645920A5

CH645920A5 - Procedimento per la preparazione di materiali biocompatibili tramite l'immobilizzazione superficiale di ''apirasi''.

Info

Publication number: CH645920A5
Application number: CH539180A
Authority: CH
Inventors: Walter Marconi; Francesco Bartoli; Francesco Pittalis
Original assignee: Eni Ente Naz Idrocarb
Priority date: 1979-08-01
Filing date: 1980-07-14
Publication date: 1984-10-31
Also published as: IE801466L; AT387906B; IT7924838A0; FI75737B; GB2055848A; AU536483B2; JPS6410228B2; US4396716A; DE3026805C2; JPS5672868A; CA1148466A; IT1122388B; ES8106230A1; DK294280A; NO159607C; NL8004068A; IE49853B1; FI802246A; NO802049L; AU6004980A

Description

La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per ottenere materiali biocompatibili polimerici e non polimerici tramite l'immobilizzazione sulla loro superficie di apirasi, un enzima in grado di catalizzare la trasformazione di adenosina difosfato (ADP) ad adenosina monofosfato (AMP) ed infine la trasformazione di quest'ultima ad adenosina. L'invenzione si riferisce altresì ai manufatti ottenuti secondo tale procedimento.

Come è noto la possibilità di impartire proprietà biocompatibili a vari tipi di materiali riveste attualmente una enorme importanza pratica. Esistono infatti materiali che per le loro elevate proprietà meccaniche, di lavorabilità, di resistenza e per l'assenza di tossicità troverebbero immediata applicazione nella costruzione di protesi da impianto di media o lunga durata o nella costruzione di elementi di macchine ausiliarie da utilizzare in circolazione extracorporea come, ad esempio, apparecchiature per dialisi renale o macchine cuore-polmone.

Potrebbero essere utilizzati per questo scopo materiali compresi entro una gamma molto vasta che va da polimeri poliammidici alifatici od aromatici, poliesteri, policarbonati, poliuretani, PVC sino a leghe metalliche speciali. Purtroppo l'impiego di questi materiali è fortemente limitato dalla loro, in genere, scarsa biocompatibilità. Come è infatti noto non appena un materiale estraneo è inserito nella circolazione sanguigna esso dà immediatamente luogo alla formazione di trombi attraverso l'attivazione di un processo estremamente complesso.

Si ritiene che in un primo momento vi sia una adesione delle piastrine del sangue sulla superficie del materiale con conseguente rilascio, da parte delle piastrine, di ADP e serotonina che, successivamente, causano l'aggregazione delle piastrine. L'aggregazione piastrinica è a sua volta uno stadio fondamentale della formazione di trombi: essa dà infatti luogo al rilascio di fosfolipidi che sono essenziali nel processo di coagulazione del sangue promuovendo la conversione del fibrinogeno in fibrina.

Il ruolo dell'ADP come induttore di aggregazione piastrinica, e quindi come iniziatore del processo di formazione di trombi, è ormai ampiamente riconosciuto. Si veda ad esempio il fondamentale lavoro di A. Gaarder ed A. Hellem in Nature 192, 531 (1961). Si capisce quindi come l'immobilizzazione di un enzima quale l'apirasi, in grado di trasformare in AMP ed in adenosina l'ADP prodotta dalla adesione delle piastrine sulla superficie del materiale posto a contatto con il sangue possa inibire la successiva aggrega- ■ zione piastrinica bloccando così la formazione di trombi. In effetti è stato trovato, e forma oggetto della presente invenzione, che l'immobilizzazione di aspirasi sulla superficie di materiali trombogenici impartisce a questi ultimi soddisfacenti proprietà biocompatibili.

Tali proprietà non dipendono dal sistema usato per la immobilizzazione dell'enzima. Questa può essere ottenuta per absorbimento e successiva reticolazione sulla superficie di materiali polimerici od anche su superfici metalliche, ad esempio sulla superficie di aghi utilizzati per le connessioni artero-venose in circolazione extracorporea.

Alternativamente l'apirasi può essere legata covalentemente a gruppi funzionali presenti sulla superficie di materiali possibile, se necessario, attivare preventivamente il materiale in modo da liberare sulla sua superficie gruppi reattivi utilizzabili per l'immobilizzazione dell'apirasi. Ad esempio l'enzima può essere attaccato covalentemente ai gruppi amminici (o carbossilici) di poliammidi alifatiche od aromatiche sottoposte a blanda idrolisi superficiale. Allo stesso modo possono essere utilizzati gruppi carbossilici di poliesteri idrolizzati in superficie.

L'invenzione è descritta in dettaglio dai seguenti esempi dai quali tuttavia non deve intendersi limitata.

Esempio 1

Sono stati preparati anelli di nylon 6 (lunghezza 9 mm, diametro interno 4 mm, diametro esterno 5 mm) ponendo particolare cura nella lavorazione degli spigoli che sono stati smussati ed arrotondati.

Esternamente, nella parte mediana dell'anello, è stato praticato un solco profondo 0,25 mm, lungo tutta la circonferenza.

Gli anelli sono stati posti ad idrolizzare in HCl 3,5 N a 37°C per un'ora. L'avvenuta idrolisi superficiale del nylon è stata confermata con un saggio colorimetrico effettuato immergendo gli anelli, lavati con acqua, in una soluzione contenente lo 0,1% (peso-volume) di acido trinitrobenzen-solfonico in tetraborato saturo.

Dopo circa un'ora la formazione di una colorazione arancione sulla superficie del nylon ha confermato l'avvenuta idrolisi. A questo punto gli anelli sono stati immersi in una soluzione di glutaraldeide al 2,5 % e vi sono stati tenuti immersi per 3,5 ore a 4°C. Successivamente gli anelli sono stati lavati rapidamente in acqua ghiacciata ed immersi in una soluzione di tampone fosfato 0,01 M contenente 8 mg/ml di aspirasi (attività specifica 3,4 U.I./mg utilizzando ADP come substrato). Si è fatta avvenire la reazione a 4°C per un giorno ed una notte. A fine reazione gli anelli sono stati lavati in acqua distillata ed è stato effettuato il saggio della attività enzimatica. Un anello è stato immerso in 50 mi di una soluzione di tampone Tris HCl 0,1 M pH 7,4 contenente per ml 0,25 mg di ADP e 0,5 mg di CaCl2. La miscela è stata tenuta sotto agitazione a 25°C. Ad intervalli di 30' sono stati prelevati campioni di 1 mi l'uno e sono stati analizzati per la determinazione dei fosfati inorganici seguendo il metodo di Fiske e Subbarrow (C.H. Fiske; Y. Subbarow; J. Biol. Chem. 66, 375 [1925]). È stata misurata sugli anelli una attività enzimatica pari a 4,5 p.moli di fosfati inorganici liberati in un'ora di reazione.

Gli anelli di nylon con apirasi legata covalentemente ai gruppi amminici superficiali sono stati sottoposti a test di biocompatibilità «in vivo» inserendoli nella vena femorale di cani di media taglia.

L'inserimento è stato effettuato in anestesia generale e l'anello, una volta inserito in ven'a, è stato fissato tramite

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un laccio di seta. La ferita è stata suturata e antibiotici sono stati somministrati all'animale.

Un analogo anello di nylon non trattato è stato inserito per un raffronto seguendo la medesima procedura.

Dopo un periodo di inserimento di 15 giorni gli anelli sono stati estratti ed esaminati.

L'anello con apirasi è stato trovato pervio mentre quello di riferimento è risultato completamente occluso da trombi. L'anello con apirasi estratto dal cane è risultata pari a circa 4 [imoli di fosfati inorganici liberati in un'ora.

Esempio 2

Sono stati preparati anelli di nylon 6 simili a quelli descritti nell'esempio 1 e sono stati immersi in una soluzione di tampone fosfato 0,01 M a pH 7 contenente 8 mg/ml di apirasi. Dopo 4 ore è stato aggiunto un volume doppio di soluzione di glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato 0,01 M e pH 7. La miscela è stata tenuta in reazione a 4°C per un giorno ed una notte. Successivamente gli anelli sono stati lavati e sottoposti al saggio dell'attività enzimatica secondo la procedura descritta nell'esempio 1.

L'attività enzimatica è risultata pari a circa 2 [unoli di fosfati inorganici liberati in un'ora da un singolo anello. È stato effettuato il test di biocompatibilità «in vivo» inserendo anelli con apirasi e anelli di riferimento nella vena femorale di cani di media taglia.

Le modalità seguite sono le stesse di quelle indicate nell'esempio 1. Dopo un periodo di inserimento di 15 giorni gli anelli sono stati estratti. L'anello con apirasi è risultato pervio e l'attività enzimatica misurata è stata pari a circa 2 [unoli di fosfati inorganici liberati in un'ora.

L'anello di nylon di riferimento è risultato invece completamente occluso.

Esempio 3

Sono stati preparati anelli di polietilentereftalato simili a quelli descritti nell'esempio 1. Gli anelli sono stati idrolizzati in NaOH 1 M a 50°C per 5 ore. Successivamente gli anelli sono stati lavati ed immersi in 50 mi di una soluzione contenente 8 mg/ml di apirasi e 10 mg/ml di N-etil--N' (3 dimetil ammino propil carbodiimmide) in tampone fosfato 0,1 M a pH 6,8. La reazione è stata condotta a 4°C per una notte. In questo modo l'apirasi è stata legata al supporto per formazione di legame ammidico fra i gruppi e-am-mino lisinici dell'enzima ed i gruppi carbossilici del poliestere idrolizzato in superficie. Il saggio dell'attività enzimatica sugli anelli, eseguito come indicato nell'esempio 1, ha dato valori di circa 4 immoli di fosfati inorganici liberati in un'ora per singolo anello. Ê stato effettuato il test in biocompatibili-5 tà «in vivo» inserendo anelli di poliestere con apirasi ed anelli non trattati nella vena femorale di cani da esperimento. Si sono seguite le modalità descritte nell'esempio 1. Dopo 15 giorni di inserimento gli anelli sono stati estratti.

Quello di riferimento è risultato completamente occluso io mentre quello con l'apirasi è risultato pervio con solo qualche sporadico trombo.

Il saggio dell'attività enzimatica sull'anello dopo l'inserimento «in vivo» ha dato come risultato circa 3 [Amoli di fosfati inorganici liberati in un'ora.

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Esempio 4

Sono stati preparati anelli di polietilentereftalato simili a quelli descritti nell'esempio 1. Su questi anelli è stata reticolata apirasi seguendo la procedura indicata nell'esempio 2. 20 Dopo l'immobilizzazione l'attività enzimatica per anello è risultata pari a circa 3 [imoli di fosfati inorganici liberati in un'ora. Il test di biocompatibilità «in vivo» su cane effettuato seguendo le modalità descritte nell'esempio 1 ha dato risultati positivi per gli anelli con apirasi reticolata che 25 sono stati trovati pervii e quasi completamente liberi da trombi mentre quelli di riferimento sono risultati occlusi. L'attività enzimatica residua sugli anelli era di circa 2,5 jxmoli di fosfati inorganici liberati in un'ora.

30 Esempio 5

Sono stati preparati anelli in acciaio C 50 simili a quelli descritti nell'esempio 1. Su alcuni di essi è stata fissata api-rasi per reticolazione con glutaraldeide secondo la procedura descritta nell'esempio 1. L'attività immobilizzata su ogni 35 anello è stata dosata e trovata pari a circa 1,5 pinoli di fosfati inorganici liberati in un'ora. Sono stati eseguiti test di biocompatibilità «in vivo» su cani da esperimento come descritto precedentemente.

Dopo 15 giorni di inserimento gli anelli sono stati estrat-40 ti ed esaminati. Mentre quelli di riferimento sono stati trovati occlusi quelli con apirasi reticolata sono risultati aperti e con scarsi trombi sulla parte interna.

L'attività residua sugli anelli trattati con apirasi dopo l'inserimento è stata trovata pari a 0,9 (Jimoli di fosfati inor-45 ganici liberati per ora.

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Claims

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1. Procedimento per la preparazione di materiali biocompatibili consistente nelFimmobilizzare su supporti polimerici o metallici un opportuno agente biologico in grado di eliminare ADP del sangue.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui l'agente biologico è costituito dall'enzima apirasi.

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RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'agente biologico è immobilizzato sul supporto attraverso una tecnica di adsorbimento e reticolazione.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'agente biologico è immobilizzato sul supporto attraverso la formazione di legame covalente tra l'agente biologico e gruppi funzionali esistenti sul supporto.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che il supporto di natura polimerica è scelto fra le poliammidi alifatiche ed aromatiche, i poliesteri,

i polimeri cellulosici blandamente idrolizzati.

6. Manufatti prostetici biocompatibili, sonde, tubi, aghi, membrane, protesi varie ed organi artificiali in genere, ottenuti col procedimento secondo la rivendicazione 1.