DE3026805A1

DE3026805A1 - Verfahren zur herstellung von biologisch vertraeglichen materialien durch oberflaechenimmobilisierung von apyrase

Info

Publication number: DE3026805A1
Application number: DE19803026805
Authority: DE
Inventors: Francesco Bartoli; Walter Marconi; Francesco Pittalis
Original assignee: Eni SpA
Current assignee: Eni SpA
Priority date: 1979-08-01
Filing date: 1980-07-15
Publication date: 1981-02-05
Also published as: GB2055848A; IE801466L; SE448820B; US4396716A; DE3026805C2; IE49853B1; ATA367580A; BR8004430A; NO159607C; FR2462475B1; NL190694B; ES493749A0; BE884301A; GB2055848B; NO802049L; DK294280A; CH645920A5; CA1148466A; FR2462475A1; ES8106230A1

Description

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Case 1240

E.IM.I. Ente Nazionale Idrocarburi, Rom / Italien

Verfahren_zur_Herstellung_von_biologisch_verträglichen_ Materialien durch Oberflächenimmobilisierung von Apyrase

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch verträglichen polymeren und nicht-polymeren Materialien durch Immobilisierung von Apyrase an deren Oberfläche. Apyrase ist ein Enz^m, das die Umwandlung von Adenosindiphosphat (ADP) zu Adenosinmonophosphat (AMP) katalysieren kann, woran sich die Umwandlung des letzteren in Adenosin anschließt. Die Erfindung betrifft auch die nach diesem Verfahren erhaltenen Erzeugnisse.

Die Möglichkeit, verschiedenen Materialtypen biologisch verträgliche Eigenschaften zu verleihen, ist gegenwärtig von außerordentlicher praktischer Bedeutung. So gibt ed Materialien, die aufgrund ihrer guten mechanischen maschinellen Bearbeitungs- und Festigkeitseigenschaften und der Abwesenheit von Toxioität unmittelbare Anwendung bei der Herstellung von Prothesen mittlerer oder langer Dauer,für Implantationszwecke oder bei der Herstellung von Elementen für Hilfsmaschinen zur Verwendung in einem sich außerhalb des Körpers befindlichen Kreislauf wie einer Nieren-Dialyseapparatur · oder von Herz-Lungen-Maschinen Anwendung finden wird.

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Zu diesem Zweck könnten Materx^lien verwendet werden, die innerhalb eines sehr breiten Bereichs von aliphatischen oder aromatischen Polyamidpolymeren, Polyestern, Polycarbonaten, Polyureth.ansn und PVC bis zu speziellen Metallegierungen liegen. Unglücklicherweise ist jedoch die Verwendung dieser Materialien in erheblichem Ausmaß aufgrund ihrer allgemein schlechten biologischen Verträglichkeit eingeschränkt. Der Grund hierfür ist der, daß solange ein fremdes Material in den Blutkreislauf eingeschaltet wird, es unmittelbar zur Bildung von Thromben durch die Initiierung eines äußerst komplizierten Prozesses kommt.

Es wird angenommen - daß zuerst eine Adhäsion der Blutplättchen an der Materialoberfläche stattfindet, woran sich die . Freisetzung von ADP und Serotonin aus den Plättchen anschließt, die dann eine Plättchenaggregation verursacht. Die Plättchenaggregation stellt selbst eine fundamentale Stufe bei der Bildung von Thromben dar. De¹" Grund hierfür ist der, daß sie durch Beschleunigung der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin Anlaß zur Freisetzung von Phospholipiden, dit bei den Blutkoagulationsverfahren wesentlich sind, gibt.

Die Rolle des ADP als Plättchanaggregatxonsauslöser und somit als Initiator des Thrombenbildungsprozesses ist allgemein bekannt (siehe z.B. die grundlegende Arbeit von A. Gaarder und A. Hellem, in Nature 192, 531 (1961)). Es ist daher offensichtlich, daß die Immobilisierung eines Enzyms, wie Ap^ rase, das das ADP, welches bei der Adhäsion der Plättchen an der Oberfläche des Materials, das mit dem Blut in Kontakt gebracht wird, gebildet wird, in AIiP und Adenosin umwandeln kann, die anschließende Plättchenaggregation inhibieren kann und somit gleichzeitig die Bildung von Thromben blockiert. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, - dies stellt-den Gegenstand der Erfindung dar - daß die Immobilisierung von Apyrase an der Oberfläche von thrombogenen Materialien diesen letzteren zufriedenstellende biologisch verträgliche Eigen-

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schaft-en verleiht.

Diese Eigenschaften hängen nicht von dem für die Immobilisierung des Enzyms verwendeten System ab.Dies kann durch Absorption und ansch¹ießende Quervernstzung an der Oberfläche der polymeren Materialien oder sogar an Metalloberflächen, beispielsweise an der Oberfläche von Nadeln, die für arterio-venöse Verbindungen in einem sich außerhalb des Körpers befindlichen Kreislauf verwendet werden, erfolgen.

Alternativ kann die Apyrase kovalent an funktioneile Gruppen gebunden werden, die sich an der Oberfläche der Materialien befinden, deren biologische Verträglichkeit erhöht werden soll. In der Tat ist es möglich, soweit erforderlich, zuvor das Material derart zu aktivieren, daß die reaktiven Gruppen an seiner Oberfläche,die für die Immobilisierung der Apyrase verwendet werden kann, freigesetzt werden.

Beispielsweise kann das Enzym kovalent an Amino-(oder Carboxyl-) gruppen von einer milden Oberflächenhydrolyse unterworfenen aliphatischen oder aromatischen Polyamiden geknüpft werden.

In der gleichen Weise könnnen Carboxylgruppen von oberflächenhydroiysierten Polyestern verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1

Man stellte Nylon-6-Ringe (Länge 9 mm, Innendurchmesser 4 mm, Außendurchmesser 5 mm) her, wobei man während der maschinellen Bearbeitung sorgfältig darauf achtete, daß sie an den Ecken abgeschrägt und gerundet wurden.

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Entlang der Mitte der Außenseite des Ringes wurde um seinen gesamten Umfang herum ein Einschnitt von 0,25 mm Tiefe angebracht.

Die Ringe wurden in 3,5 N HCl eine Stunde bei 37°C hydrolysiert.-Die Tatsache, daß die Oberflächenhydrolyse des Nylons durchgeführt wurde, wurde durch einen color!metrischen Test bestätigt, der durch Eintauchen der mit Wasser gewaschenen Ringe in eine Lösung, die 0,1 % Gew./Vol. Trinitrobenzolsulfonsäure in gesättigtem Tetraborat enthielt, erfolgte.

Nach etwa einer Stunde bestätigte die Bildung einer orangen Färbung an der Nyloneberfläche, daß die Hydrolyse stattgefunden hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Ringe in eine 2,5 %-ige GIutaraldehydlösung eingetaucht und 3,5 Stunden bei 4⁰C eingetaucht gelassen. Die Ringe wurden dann rasch in eisgekühltem Wasser gewaschen und in eine 0,01 M Phosphatpufferlösung, die 8 mg/ml Apyrase (spezifische Aktivität 3,4 I.E./mg unter Verwendung von ADP als Substrat) enthielt, eingetaucht. Man ließ die Reaktion einen Tag und eine Nacht bei 4⁰C ablaufen. Am Ende der Reaktion wurden die Ringe in destilliertem Wasser gewaschen und es wurde ein Test bezüglich der enzymatischen Aktivität durchgeführt. Ein Ring wurde in 50 ml einer 0,1 Tris-HCl-Pufferlc^ung von pH 7,4 eingetaucht, die 0,25 mg/ml ADP und 0,5 mg/ml CaCl₂ enthielt.

Die Mischung wurde bei 25⁰C unter Rühren gehalten. Man entnahm 1 ml Proben in Zeitabständen von 30 Minuten und analysierte sie, um anorganische Phosphate zu bestimmen, gemäß der Met'iode von Fiske und Subbarrow (CH. Fiske; Y. Subbarrow; J. Biol. Chem. 66, 375 (1925)). Man ermittelte an den Ringen eine enzymatische Aktivität von 4,5 μΜ anorganischer Phosphate, die in einer einstündigen Reaktion freigesetzt wurden.

Die mit Apyrase covalent an die oberflächlichen Aminogruppen ge-

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bundenen Nylonringe wurden einem "in vivo" Bioverträgllchkeitstest unterzogen, indem man sie in die Femoralvene von Hunden durchschnittlicher Größe einsetzte.

Das Einsetzen erfolgte unter Vollaesthesie und als der Ring in die Vene eingesetzt worden war, wurde er mit Hilfe eines Seidenfadens fixiert. Man vernähte die Wunde und verabreichte dem Tier Antibiotika.

Ein analoger unbehandelter Nylonring wurde zu gleichen Zwecken unter Befolgung des gleichen Verfahrens eingesetzt.

Nach ainer Einsatzdauer von 15 Tagen wurden die Ringe . entnommen und untersucht.

Der Ring mit Apyrase erwies sich als durchlässig, während der Vergleichsring vollständig durch Thromben okkludiert war.

Eine Messung an dem vom Hund entnommenen Ring ru.t Apyrast zeigte, daß 4 μΜ anorganische Phosphate in einer Stunde freigesetzt wurden.

Beispiel 2

Man stellte Nylon-6-Ringe analog den in Beispiel 1 beschriebenen her und tauchte sie in eine 0,01 M Phosphatpufferlösung mit eine.n pH von 7, die 8 mg/ml Apyrase enthielt, ein.

Nach 4 Stunden wurde ein doppeltes Volumen einer 2,5 %-igen Glutaraldehydlösung in einer 0,01 M Phosphatpufferlösung bei pH 7 zugegeben.

Man ließ die Mischung einen Tag und eine Nacht bei 4⁰C reagieren. Die Ringe wurden dann gewaschen und einem Test hinsichtlich der

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enzyma-ischen Aktivität gemäß d.am in· Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unterzogen.

Für die enzymecische Aktivität wurde ermittelt, daß sie etwa 2 μΜ anorganischer Phosphate in einer Stunde durch einen einzigen Ring freisetzte. Der "in vivo" Biov<ürträglichkeitstest wurde durchgeführt, indem man die Ringe mit Apyrase und die Vergleichsringe in die Femoralvene von Hunden durchschnittlicher Größe einsetzte.

Die für diesen Zweck befolgte Methode wurde in Beispiel 1 angegeben. Nach einer Einsatzdauer von 15 Tagen wurden die Ringe entnommen. Der Ring mit Apyrase erwies sich als durchlässig und die gemessene enzymatische Aktivität war etwa 2 μΜ anorganischer Phosphate, die in einer Stunde freigesetzt wurden, äquivalent.

Der Vergleichsring war jedoch vollständig okkludiert. Beispiel 3

Man stellte analog den in Beispiel 1 beschriebenen Ringen PoIyäthyienterephthalatringe her. Die Ringe wurden in 1 M NaOH 5 Stunden bei 50⁰C hydrolysiert. Dia Ringe wurden anschließend gewaschen und in 50 ml einer Lösung eingetaucht, die 8 mg/ml Apyrase und 10 mg/ml N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropylcarbodiimid) in einem 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 6,8 enthielt. Die Reaktion wurde eine Nacht bei 4°C durchgeführt. Auf diese Weise wurde die Apyrase an den Träger durch die Bildung einer Amidobindung zwischen den £-Aminolysingruppen des Enzyms und den Carboxylgruppen des oberflächenhydrolysierten Polyesters gebunden. Der enzymatische Aktivitätstest an den Ringen, der wie in Eaispiel 1 durchgeführt wurde, ergab Werte von etwa 4 μΜ anorganischer Phosphate, die in einer Stunde je Ring freigesetzt wurden. Der "in vivo" Bioverträglichkeitstest wurde durchgeführt, indem man Polyesterringe mit Apyrase und nicht-behandelte Ringe in die Femoralvene

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von Versuchshunden einsetzte. Man befolgte die in Beispiel 1 beschriebene Methode. Nach einer 15-tägigen Einsatzdauer wurden die Ringe entnommen. Der Vergleichsring war vollständig okkludiert, während der Ring mit Apyrase durchlässig war, wobei lediglich einige sporadische Thromben vorhanden waren.

Der enzymatische Aktivitätstest an dem Ring nach den "in vivo" Einsätzen ergab etwa 3μΜ anorganischer Phosphate, die in einer Stunde freigesetzt wurden.

Beispiel 4

Man stellte analog den in Beispiel 1 beschriebenen Ringen Polyäthylen terephthalatringe her. Die Apyrase wurde unter Befolgung des in Beispiel 2 angegebenen Verfahrens an diesen Ringen quervernetzt. Nach der Immobilisierung fand man für die enzymatische Aktivität je Ring etwa 3μΜ in einer Stunde freigesetzter anorganischer Phosphate. Der "in vivo" Bioverträglichkeitstest an Hunden wurde unter Befolgung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode durchgeführt und ergab für die Ringe mit Quervernetzung in der Apyrase positive Ergebrisse, wobei diese Ringe sich als durchlässig und nahezu vollständig frei von Thromben erwiesen, wohingegen die Vergleichsringe okkludiert waren. Die verbliebene enzymatische Aktivität an den Ringen betrug etwa 2,5 μΜ in einer Stunde freigesetzter anorganischer Phosphate.

Beispiel 5

Man stellte analog den in Beispiel 1 beschriebenen Ringen C-50-Stahlringe her. Die Apyrase wurde an einigen derselben durch Quervernetzung mit Glutaraldehyd nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren fixiert. Man bestimmte die immobilisierte Aktivität an jedem Ring und. ermittelte für sie etwa 1,5 μΜ anorganischer Phosphate, die in einer Stunde freigestzt wurden.Der "in

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vivo" Bioverträglichkeitstest wurde an Versuchshunden, wie vorher beschrieben, durchgeführt.

Nach einer 15-tägigen Einsatzdauer wurien die Ringe entnommen und untersucht. Während man für die Vergleichsringe fand, daß diese
okkludiert waren, ergab sich für die mit .Apyrase quervernetzten
Ringe, daß sie offen waven, wobei sich an ihrer Innenseite lediglich geringfügige Thromben befanden.

Für die verbliebene Aktivität an den mit Apyrase behandelten Ringen nach dem Einsatz ermittelte man 0,9 μΜ je Stunde freigesetzter anorganischer Phosphate.

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Zusammenfassung

Es werden biologisch verträgliche Materialien hergestellt, indem man an einem geeigneten polymeren Substrat ein biologisch aktives Mittel, das zur Entfernung von Adenosindiphosphat aus dem Blut befähigt ist, vorzugsweise Apyrase, immobilisiert, wobei die Immobilisierung durchgeführt wird durch Absorptions- und Quervernetzungsverfahren oder durch Bildung einer covalenten Bindung zwischen dem biologisch aktiven Mittel und bestimmten funktioneilen Gruppen des Substratmoleküls.

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Claims

Dr. F. Zumstein sen. - Di.c As^mann - Di. R. Koenigsberger Dipl.-Phys- R. Holzbauer - Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE 8OOO München 2 ■ BrauhausstraQe 4 - Telefon Sammel-Nr. 22 53 41 - Telegramme Zumpat · Telex 5 29979 Case 1240 14/10/WE Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von biologisch verträglichen Materialien, dadurch gekennztichnet, daß man an polymeren oder Metallträgern ein geeignetes biologisches Mittel immobilisiert, das zur Eliminierung von ADP in dem Blut befähigt ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Mittel das Enzym Apyrase ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Mittel an dem Träger durch eine Absorptions- und Ouervernetzungsmethode immobilisiert wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Mittel an dem Träger durch die Bildung einer xovalenten Bindung zwischen dem biologischen Mittel und auf bzw. an dem Träger vorliegenden funktioneilen Gruppen immobilisiert wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der polymere Träger ausgewählt wird untv^r mild dzw. schwach hydroIy-sierten aliphatischen und aromatischen Polyamiden, Polyestern, und Zellulosepolymeren.

6. Biologisch verträgliche prostethische Erzeugnisse, Sonden, Rohre bzw. Schläuche, Nadeln, Membranen, verschiedenartige Prothesen und künstliche Organe, hergestellt gemäß einem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche.

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