DE102008057186A1

DE102008057186A1 - Verfahren zur Herstellung mineralisierter Proteinhohlkörper

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Publication number: DE102008057186A1
Application number: DE200810057186
Authority: DE
Inventors: Hans-Lothar Prof.Dr. Fuchsbauer; Martina Mainusch; Ulrike Dipl.-Ing. Becher (FH); Jutta Dipl.-Ing. Speda (FH)
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2010-05-20

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neutartiges Verfahren zur Herstellung mechanisch und biologisch stabiler Hohlkörper als künstlicher Wachstumsraum von Zellen, Enzymreaktor oder Transport- und Freisetzungssystem von pharmazeutischen Wirkstoffen, Farbstoffen und anderen Materialien. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen Hohlkörpers im Milli-, Mikro- und Nanometermaßstab ohne Beeinträchtigung der chemischen oder biologischen Funktion des eingeschlossenen Materials zu entwickeln. Weiterhin ist dafür zu sorgen, dass der fertiggestellte Hohlkörper chemisch, biologisch und mechanisch stabil ist. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass tierische und pflanzliche Zellen, Bakterien, Sporen, Enzyme, pharmazeutische Wirkstoffe, Farbstoffe oder anderes Material unter sterilen und nichtsterilen Bedingungen in sphärische Partikel unterschiedlicher Größe mit Durchmessern von 10-3 bis 10-9 Meter eingeschlossen werden. Nach Beschichtung der Kugeln mit Protein und enzymatischer Vernetzung wird der innere Kern aufgelöst und durch Waschen entfernt. Überraschenderweise entstehen bei diesem Verfahren labile Proteinhohlkugel, die sich so mineralisieren lassen, dass die chemische und biologische Funktion des eingeschlossenen Material erhalten bleibt. Die Mineralisierung reguliert die Porengröße der Proteinhülle, schützt vor chemischem und biologischem Abbau und stabilisiert mechanisch das fertige Produkt ...

Description

Der Einschluss von biologischem und chemischem Material in stabile Körper aus anorganischen, organischen und biologischen Bausteinen ist eine wichtige Methode, um lebendem Gewebe, Zellverbänden oder einzelnen Zellen einen Schutzraum für ungestörtes Wachstum zu schaffen, die Wiederverwendbarkeit von Enzymen zu ermöglichen, Substanzen kontrolliert freizusetzen, biologische und chemische Abbauprozesse zu verzögern, einen zielgerichteten Transport zu gewährleisten oder visualisierbare Effekte zu erzielen. Das eingeschlossene Material und die geplante Anwendung des Produkts bestimmen im wesentlichen Form und Größe des Körpers sowie die notwendige Porosität.
Beispielsweise wird es bei der Herstellung eines Containers für tierische, pflanzliche oder bakterielle Zellen darauf ankommen, dass das Verfahren steril durchführbar ist, die weiteren Reaktionsbedingungen die Vitalität der Starterkultur nicht beeinträchtigen und der Innenraum des Körpers ausreichenden Platz für die Vermehrung bietet. Tierische Zellen oder multizelluläre Bakterien benötigen beispielsweise Hohlräume mit Innendurchmessern von 10^–4 bis 10^–3 Metern. Die Außenhülle des Containers muss für Nährstoffe und Produkte hinreichend durchlässig sein und gleichzeitig die Scherkräfte in einem Fermenter mechanisch überstehen. Zusätzlich sind über Tage hinweg die eingeschlossenen Zellen und ihre Produkte vor abbauenden Mikroorganismen, Enzymen und oxidativen Prozessen zu schützen.
Demgegenüber wird mit dem Einschluss eines pharmazeutischen Wirkstoffs meist eine kontrollierte oder verzögerte Freisetzung beabsichtigt. Dies wird in der Regel dadurch erreicht, dass die Diffusion aus der inneren Matrix und durch die äußere Membran eines Containers langsam verläuft oder Matrix und Außenhülle durch Enzyme der umgebenden Flüssigkeit abgebaut werden. Dabei hat die Herstellung sphärischer Nanopartikel (Durchmesser von 10^–9 Meter) in den vergangenen Jahren eine zunehmende Bedeutung erlangt.
Die Prozesse zur Herstellung großer, dauerhafter Zellcontainer und kleiner, sich auflösender Wirkstoffkapseln sind die Gegenpole eines breiten Spektrums von Einschlussverfahren. Beide Beispiele offenbaren die Anforderungen an ein Verfahren für Produkte mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften:

(1) Die verwendeten Bausteine zur Herstellung einer Kapselmatrix und Außenhülle müssen eine Hitzesterilisierung ohne Einbuße wesentlicher Eigenschaften tolerieren.
(2) Das Herstellungsverfahren muss vom Materialeinschluss bis zur Produktfertigstellung unter sterilen Bedingungen durchführbar sein.
(3) Die Funktionalität des Einschlussguts muss während des Einschlussverfahrens erhalten bleiben.
(4) Der Abbau der verwendeten Bausteine muss durch Körperflüssigkeiten möglich sein, um die Freisetzung eingeschlossener Wirkstoffe zu gewährleisten.
(5) Eine definierte Durchlässigkeit der äußeren Membran muss sich gezielt einstellen lassen. Entsprechend muss wenigstens ein Verfahrensschritt die Porosität des Materials regulieren.
(6) Das fertige Produkt muss eine hohe mechanische Festigkeit aufweisen.

Die Herstellung von Produkten mit den in (1) bis (6) beschriebenen Eigenschaften ist eine große Herausforderung und bis heute nicht zufriedenstellend gelöst.
So ist die Ausfällung funktionalisierter Polymere mit Ca²⁺ oder anderen mehrwertigen Ionen unter Einschluss des gelösten oder suspendierten organischen oder biologischen Materials eine seit langem bekannte und häufig angewandte Einschlussmethode. Die verwendeten Polymere können natürlichen oder synthetischen Ursprungs (Alginsäure, Carageen, Pectin, Fulvinsäure, Polyacrylsäure, succinylierter Polyvinylalkohol etc.) sein. Sie müssen lediglich Carboxylgruppen oder andere Funktionen tragen, die in Wasser mit geeigneten Kationen schwer lösliche Salze bilden. Sehr häufig werden Alginsäure oder κ-Carageen aus Algen für die Immobilisierung verwendet, wobei in der Regel eine Mischung aus Polymer und Einschlussgut in eine CaCl₂-Lösung eingetragen wird (siehe beispielsweise: Prakash und Martoni (2006) Appl. Biochem. Biotechnol. 128, 1–22). Über den Eintrag und die Rührgeschwindigkeit lassen sich Teilchengrößen mit einem Durchmesser von 10^–9 bis 10^–3 Meter erzielen. Vorteilhaft sind auch das schonende Einschlussverfahren und die Biokompatibilität der verwendeten Polymersäuren, nachteilig hingegen die geringe Stabilität der Partikel. Beispielsweise lösen sich die vernetzenden Salzbrücken bereits in Natriumcitratpuffer sehr einfach auf.
Dreidimensionale Netzwerke entstehen auch aus Polymersäuren mit Polyaminen und Zuckerpolymeren mit Borsten, die jedoch wegen ähnlicher Stabilitätsprobleme spezifische Anwendungsprofile benötigen (De Stefano et al. (2006) Biophys. Chem. 122, 221–231; An und Lo (2001) J. Environ. Sci. Health: A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 36, 101–115).
Noch ältere Verfahren nutzen gelierende Bausteine wie Agarose oder Gelatine, die beim Abkühlen des erhitzten Sols unter sehr schonenden Bedingungen labiles Material in die sich bildende Gallerte einschließen (siehe beispielsweise: Jen et al. (1996) Biotechnol. Bioeng. 50, 357–364; Rao (1995) J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 7, 623–645). Grundsätzlich gilt, dass bei der höheren Soltemperatur thermolabiles Material Vitalität und Funktionalität einbüßen kann. Außerdem lösen sich Hydrogele auf, wenn die Schmelztemperatur überschritten wird. Vernetzungsmoleküle wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd stabilisieren durch Aufbau kovalenter Netzwerke; wegen ihrer hohen Penetrationsfähigkeit und Reaktivität sind sie für jedes lebende und funktionale Einschlussgut problematische Chemikalien.
Einschlussimmobilisate werden dadurch stabilisiert und abgedichtet, dass eine Außenhülle um die oben beschriebene Kernmatrix mit dem Einschlussgut aufgebaut wird. Das wichtigste Verfahren ist der Aufbau ultradünner Filme mit amphiphilen Molekülen und ebenfalls Stand der Technik. Drei Verfahren sind im Wesentlichen zu unterscheiden:

(1) die Herstellung dünner Filme nach Langmuir und Blodgett, auch Langmuir-Blodgett-Filme (LB-Verfahren) genannt,
(2) Die Herstellung selbst-geordneter Monoschichten (self-assembled monolayers, SAM-Verfahren) und
(3) Schicht-für-Schicht-Aufbauverfahren (layer by layer assembly, LBL-Verfahren).

Beim Langmuir-Blodgett-Verfahren wird mit einem oder mehreren Tensiden ein monomolekularer Film auf einer Wasseroberfläche hergestellt und auf eine feste Oberfläche übertragen (siehe beispielsweise: Dynarowicz-Łatka et al. (2001) Adv. Colloid Interface Sci. 91, 221–293). Obwohl Schichtdicke und Architektur kontrollierbar sind, ist die thermodynamische Stabilität der übertragen Monoschicht begrenzt. Der zu beschichtende Körper muss bereits eine Festigkeit bzw. Steifigkeit besitzen, die die meisten Einschlussimmobilisate nicht aufweisen.
Beim SAM-Verfahren entstehen Monoschichten mit geordneter Architektur direkt auf einer festen Oberfläche durch Assemblierung individueller Moleküle. Häufig werden Goldoberfächen verwendet, die mit unterschiedlichen Thiolverbindungen modifiziert werden (Shin et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 423–429; Lehn (2002) Science 295, 2400–2403). SAM sind thermodynamisch stabiler als LB-Monoschichten, aber wie diese weniger für die Beschichtung labiler Körper geeignet.
Labile Partikel wie Calciumalginatkugeln werden erfolgreicher nach dem LBL-Verfahren abgedichtet und stabilisiert. LBL bedeutet Aufbau von Multischichten mit Polyelektrolyten entgegen gesetzter Ladung direkt auf der Oberfläche über elektrostatische Anziehung und Wechselwirkung. Durch wiederholte Aufbringung kationischer und anionischer Moleküle entstehen übereinander liegende Filme mit alternierender Ladung, deren Schichtdicke 10^–8 bis 10^–6 Meter betragen kann. Die Technik eignet sich zur Verkapselung von Makromolekülen und kleinen Verbindungen und hat eine breite medizinische Anwendung für die Modifikation von Zelloberflächen, die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen, die Bildung von Hohlkörpern oder die Herstellung von Nanobioreaktoren gefunden (siehe beispielsweise: Ai et al. (2003) Cell Biochem. Biophys. 39, 23–43). Da die Wechselwirkung zwischen den einzelnen Filmschichten ausschließlich elektrostatischer Natur ist, ist die Stabilität 181-beschichteter Körper von pH und Salzgehalt einer Lösung abhängig. Auch hat die Löslichkeit der verwendeten Polyelektrolyte in Wasser Einfluss auf die Beständigkeit des fertigen Produkts.
LBL-beschichtete Kapseln wurden auch zur Herstellung von Hohlkörpern verwendet. Das Deutsche Patent DE 102004013637 A1 beschreibt ein Verfahren, bei dem die Matrix der beschichteten Partikel wieder aufgelöst wird.
Hohlkörper lassen sich auch herstellen, indem zunächst nach dem SCL-Verfahren (SCL, shell cross-linked micelles) Partikel mit einem inneren Kern und einer äußeren Schale aus unterschiedlichem anorganischem oder organischen Material synthetisiert werden (siehe beispielsweise: Thurmond et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 7239–7240 (1996). Anschließend erfolgt die Auflösung der Kernmatrix. Bei einem Verfahren wird auf einem Kieselgelkern Polystyrol radikalisch synthetisiert, wobei ko-polymerisierte funktionale Gruppen für die nachfolgende Vernetzung sorgen. Anschließend erfolgt die Zersetzung des Kieselgelkerns mit Flusssäure ohne Zerstörung der resistenten Polymerhülle (Blomberg et al. (2002) J. Polym. Sci. 40, 1309–1320). Die Reaktionsbedingungen des SCL-Verfahrens lassen in der Regel nur den Einschluss von inertem Material zu, bei dem ein Verlust der Funktionalität nicht zu erwarten ist.
Hohlkörper aus organischem Material entstehen auch aus Übergangsmetallen (Pt, Pd) und mehrzähnigen organischen Liganden (Sun et al. (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 757–764).
Auch biologische Bausteine, die zur Selbstassemblierung befähigt sind, wurden als Einkapselungs- oder Beschichtungsmaterial beschrieben. Beispielsweise bilden bakterielle Oberflächenproteine, sog. S-Layer-Proteine, zweidimensionale Kristalle und lassen sich entsprechend als biomimetische Membranen nutzen (Schuster et al. (2005) Methods Mol. Biol. 300, 101–123). Bionanokapseln entstehen aus dem Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus und den Lipiden einer Wirtszelle (Yu et al. (2006) IUBMB Life 58, 1–6). Nach diesen Verfahren hergestellte Produkte lassen sich wegen der Antigenität nur bedingt in Mensch und Tier anwenden.
Insgesamt gesehen lassen sich mit den bekannten Verfahren Hohlkörper herstellen, die nur teilweise die geforderte chemische, biologische und mechanische Stabilität und Kompatibilität aufweisen. Deshalb ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren bereitzustellen, das den oben genannten Anforderungen (1) bis (6) genügt. Wegen der unterschiedlichen Größe und Eigenschaften des Einschlussguts (tierische und pflanzliche Zellen, Einzeller und multizelluläre Bakterien, Enzyme, pharmazeutische Wirkstoffe, Farbstoffe etc.) müssen mit dem Verfahren Partikelgrößen mit Durchmessern von 10^–3 bis 10^–9 Metern erzielbar, die Durchführung unter sterilen Bedingungen möglich und die Porosität der äußeren Membran einstellbar sein. Außerdem soll die Außenhülle bei Bedarf biologisch abbaubar sein.
Die Aufgabe wird durch ein neuartiges 5-Stufen-Verfahren gelöst, das ausschließlich biologisch abbaubare und sterilisierbare Materialien für den Aufbau der Einschlussmatrix und die Konstruktion der Außenhülle verwendet.
In der ersten Verfahrensstufe wird durch Ausfällung polymerer Carbonsäuren mit zweiwertigen Kationen das Einschlussgut ionotrop ausgefällt. Dafür eignet sich besonders eine 0,5–2% (w/v) wässrige Lösung mit einer polymeren Zuckersäure wie Alginat und Carageen, die in eine 1–5% wässrige Calciumchlorid-Lösung unter Rühren eingebracht wird. Für ein Verfahren unter sterilen Bedingungen werden die Lösungen zuvor autoklaviert. Durch Einsprühen der Zuckerlösung zu einer bei mindestens 10.000 rpm gerührten Calciumchlorid-Lösung entstehen Nanopartikel (Durchmesser von 10^–9 Meter). Größere Calciumalginatkugeln (Durchmesser von 10^–6 bis 10^–3 Meter) werden durch Eintropfen der Zuckerlösung in eine gerührte Calciumchlorid-Lösung hergestellt. Dabei bestimmen der Auslassquerschnitt der verwendeten Eintropfvorrichtung, die Zutropf- und Rührgeschwindigkeit die Größe der Kugeln. Überschüssiges Material (Matrixbausteine und Einschlussgut) wird mit 2 mM CaCl₂ in einem geeigneten Puffer durch zwei- bis dreifaches Waschen entfernt. Dabei wird gleichzeitig ein pH von 6–8 eingestellt. Bei der Immobilisierung von Zellen und Sporen kann erfindungsgemäß ein essentieller Nährstoff mit eingeschlossen werden, dessen Fehlen das Wachstum unerwünschter Keime im Nährmedium behindert.
In der zweiten Verfahrensstufe werden die beladenen Metallcarboxylatkugeln mit einem basischen Protein beschichtet. Dazu werden beispielsweise auf 4–5°C gekühlte Calciumalginatkugeln in einer 1–5% (w/v) Gelatinelösung (Gelatinetyp A) unter leichtem Schütteln 10–30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Ein pH von 5–9, vorzugsweise von 6–8, wird dabei mit einem geeigneten Beschichtungspuffer, der 2 mM CaCl₂ enthält, konstant gehalten. Man entfernt den Überstand durch Dekantieren und wäscht die Kugeln ggf. mit Beschichtungspuffer.
In der dritten Verfahrensstufe erfolgt die Proteinvernetzung mit Transglutaminase, Laccase, Peroxidase, Sortase, Lysyloxidase oder einem anderen proteinvernetzenden Enzym. Typischerweise werden gelatinebeschichtete Alginatkugeln in Beschichtungspuffer mit 0,1–1 mg gereinigte Transglutaminase je Gramm feuchter Partikel wenigstens 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird der Überstand durch Dekantieren entfernt. Chemische Vernetzungsmittel wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd sind nicht geeignet, weil sie die Vitalität von lebendem Material beeinträchtigen sowie die Bausteine der inneren Matrix und das Einschlussgut mit den Bausteinen der äußeren Hülle irreversibel verbinden.
Die Verfahrensstufen zwei und drei werden wenigstens dreimal, für die Erzielung engporiger Proteinhüllen mehrfach abwechselnd wiederholt. Dabei kann auch der Beschichtungsproteintyp variiert werden. Eine alternierende Verwendung von basischen und sauren Proteinen, die bei dem verwendeten Beschichtungs-pH positiv bzw. negativ geladen sind, begünstigt wie beim LBL-Verfahren eine dichte Packung der Proteinketten auf der Alginatoberfläche. Ganz besonders eignet sich dafür das Faserprotein Gelatine, das aus Haut- und Knochenkollagen über ein saures oder basisches Aufschlussverfahren technisch gewonnen wird. Deshalb ist Gelatine erhältlich, die bei neutralem pH positiv oder negativ geladen ist. Nachteilig ist, dass bei Gelatine aus basisch behandeltem Kollagen ein Teil der ursprünglich vorhandenen Glutaminreste hydrolysiert ist. Deshalb ist die Vernetzbarkeit dieses Gelatinetyps durch Transglutaminase eingeschränkt.
Nach Abschluss des Beschichtungsverfahrens werden die beladenen Kapseln mit Beschichtungspuffer mehrfach gewaschen, um überschüssiges Beschichtungsprotein und Vernetzungsenzym vollständig zu entfernen. In der vierten Verfahrensstufe folgt dann die Auflösung und Entfernung der Metallcarboxylatmatrix. Dazu werden die sphärischen Partikel in 50 mM Citratpuffer pH 6,0 mit 0,5 M Natriumchlorid eine Stunde bei Raumtemperatur vorsichtig bewegt. Überraschenderweise bleiben durchsichtige, mechanisch labile Proteinhohlkugeln zurück, die nicht zerfließen, in Lösung ihre sphärische Form bewahren und nur durch die enzymatisch hergestellten Querbrücken zusammengehalten werden. Bei Kugeln mit einem Durchmesser von 1–3 Millimeter ist der Inhalt mit dem bloßen Auge sichtbar. Die labilen Proteinkörper mit dem Einschlussgut werden gewaschen und in der Pufferlösung gelagert.
Im fünften Verfahrensschritt werden die labilen Proteinhohlkörper durch Mineralisierung chemisch, biologisch und mechanisch stabilisiert. Dabei wird auch die Erkenntnis genutzt, dass die Tripelhelix von Kollagen ein biologisches Templat für den Aufbau kristalliner Strukturen von Hydroxylapatit, Tricalciumphosphat, Calciumcarbonat, Calciumsilicat, Calciumfluorid oder anderer unlöslicher Mineralsalzzusammensetzungen in Zähnen, Knochen, Knorpel etc. ist (siehe beispielsweise Siegmund et al. (2008) J. Biomech. 41, 1427–1435). Deshalb ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren Kollagen bzw. dessen wasserlösliches Partialhydrolysat Gelatine das bevorzugte Beschichtungsmaterial von Metallcarboxylatkapseln mit dem Einschlussgut. Der Aufbau kristalliner Mineralschichten um die vernetzten Kollagenketten herum ist nach dem Beschichtungsverfahren eine zweite Verfahrensstufe, mit der die Durchlässigkeit und Porosität der äußeren Proteinmembran eingestellt wird. Die Proteinmineralisierung verhindert außerdem die chemische und enzymatische Hydrolyse der Kollagenpeptidbindungen und trägt somit entscheidend zur chemischen und biologischen Stabilität des beladenen Hohlkörpers bei. Andererseits ist auch ein Kollagenkomposit im Körper nach langsamer Auflösung der Mineralsalze abbaubar, entsprechend auch mineralisierte Hohlkörper.
Das Wachstum einer kristallinen Hydroxylapatitschicht auf den vernetzten Gelatineketten der labilen Hohlkörper beginnt bei pH 5,0 in einer wässrigen Lösung von 0,5 M Ca(NO₃)₂ und 0,5 M (NH₄)₂HPO₄ (Volumenverhältnis 5:3). Nach Anheben des pH auf 8–10 durch langsame Zugabe von 25% Ammoniumhydroxid werden die Kapseln 0,5–2 Stunden bei Raumtemperatur bewegt. Zur Verstärkung der Hydroxylapatitschicht und Verengung der Poren kann der Vorgang mehrfach wiederholt werden. Die mineralisierten Hohlkörper werden mehrfach mit 50 mM Ammoniumcitratpuffer pH 6,0 gewaschen und beispielsweise in Tris-Acetat-Puffer pH 6 bei –18°C oder –80°C gelagert. Die Lagerung von feuchten bzw. lyophilisierten Partikeln bei tiefen Temperaturen ist ebenfalls ein geeignetes Aufbewahrungsverfahren.
Beschreibung der Abbildungen
1: Mineralisierter Kollagenhohlkörper (100fache Vergrößerung) mit multizellulären Streptomyceten. Das Wachstum erfolgte in einem flüssigen Stärke-Mineralsalzmedium bei 28°C.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel I
Herstellung von Agarplatten mit festem Nährmedium
4 g Glucose, 4 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt, 2 g CaCO₃ und 15 g Agar-Agar werden in 1 L entsalztem Wasser gelöst. Anschließend stellt man den pH mit NaOH auf 7.2 ein. Man sterilisiert bei 1 bar Überdruck (121°C) für 20 min, gießt 25 ml unter sterilen Bedingungen in jeweils eine Petrischale und lässt abkühlen.
Beispiel II
Gewinnung von Sporen von Streptomyces mobaraensis
Substratmycel einer wenigstens 30 Tage alten Stammhaltungskultur von Streptomyces mobaraensis werden auf festem Nähragar ausgestrichen und 15–21 Tage bei 28°C inkubiert. Anschließend gibt man 20 ml einer sterilen wässrigen 0,5% TWEEN 20-Lösung zu und löst die Sporen mit einer ausgeglühten Animpföse mechanisch ab. Nach Filtration der Sporensuspension durch einen Wattepfropfen am Ausgang einer sterilen Spritze wird das Filtrat mit einem gleichen Volumen an sterilem Glycerin versetzt, aliquotiert und bei –80°C gelagert. Die Anzahl keimfähiger Sporen wird durch Ausplattieren dekadisch verdünnter Glycerinsuspensionen auf Nähragarplatten und Kultivierung bei 28°C für 2 Tage bestimmt.
Beispiel III
Sterilisierte Reagenzien für die Herstellung von mineralisierten Hohlkugeln mit eingeschlossenen Sporen von Streptomyces mobaraensis und Kartoffelstärke

a) Herstellung einer sterilen 1% Alginat-Lösung mit 5% Stärke: 10 g Alginsäure-Natriumsalz von Braunalgen (low viscosity, Sigma A-2158, St. Louis, USA) und 50 g Kartoffelstärke werden in 1 Liter Milli-Q-Wasser suspendiert und zum Lösen der Zuckersäure bei 55°C 1 Stunde gerührt. Die milchige Suspension wird bei 1 bar Überdruck 20 Minuten autoklaviert.
b) Herstellung einer sterilen 2% Calciumchlorid-Lösung: 26 g Calciumchlorid-Dihydrat werden in 1 Liter Milli-Q-Wasser gelöst und bei 1 bar Überdruck 20 Minuten autoklaviert.
c) Steriler 50 mM Tris-Acetat-Puffer mit 2 mM CaCl₂ pH 6,0 (Tris-Puffer): Eine Lösung aus 6,06 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan und 294 mg CaCl₂ × 2H₂O in 800 ml Milli-Q-Wasser wird mit Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt, auf 1000 ml aufgefüllt und bei 1 bar Überdruck 20 Minuten sterilisiert.
d) Herstellung einer sterilen 5% Gelatinelösung: 50 g Gelatine (Typ A, 250–300 g Bloom, DGF Stoess AG, Eberbach, Deutschland) lässt man in 1 L 50 mM Tris-Acetat pH 6,0 mit 2 mM CaCl₂ 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, löst unter Rühren bei 60°C und sterilisiert bei 1 bar Überdruck für 20 Minuten.
e) Transglutaminase wird nach dem Verfahren von Gerber et al. ((1994) J. Biochem. 299, 825–829) hergestellt. Vor der Verwendung wird das gereinigte Enzym durch einen Sterilfilter mit Ausschlussgrenze von 0,2 Mikrometern gedrückt.
f) Sterile 0,5 M Natriumchloridlösung in 50 mM Citratpuffer pH 6,0 (NaCl-Puffer): Eine Lösung von 14,7 g Natriumcitrat-Dihydrat und 29,2 g NaCl in 800 ml Milli-Q-Wasser wird mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt, auf 1000 ml aufgefüllt und bei 1 bar Überdruck 20 Minuten sterilisiert.
g) Sterile 0,5 mM Ca(NO₃)₂-Lösung: 118 g Calciumnitrat Tetrahydrat werden in 1 Liter Milli-Q-Wasser gelöst und bei 1 bar Überdruck 20 Minuten sterilisiert.
h) Sterile 0,5 M (NH₄)₂HPO₄-Lösung: 66,0 g dibasisches Ammoniumphosphat werden in 1 Liter Milli-Q-Wasser gelöst und bei 1 bar Überdruck 20 Minuten sterilisiert.
i) Sterile Ammoniaklösung (25%): 25% Ammoniumhydroxid wird bei 1 bar Überdruck 20 Minuten sterilisiert.

Beispiel IV
Herstellung von Calciumalginatkapseln mit eingeschlossenen Sporen und Kartoffelstärke
200 ml sterile Alginat-Stärke-Suspension werden mit 10 ml Sporensuspension gemischt und in einen sterilen Behälter mit Auslaufhahn gefüllt. Die Mischung wird unter sterilen Bedingungen mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min in 1 Liter einer gerührten Calciumchlorid-Lösung getropft. Man rührt noch 1 Stunde, sedimentiert durch Abstellen des Rührers, dekantiert den Überstand und wäscht einmal mit 500 ml steriler Calciumchloridlösung und zweimal mit je 500 ml sterilem Tris-Puffer pH 6. Gefüllte Alginatkugeln werden in steriler Calciumchloridlösung bis zu einer Woche gelagert.
Beispiel V
Beschichtung von befüllten Calciumalginatkugeln mit Gelatine
Die in 500 ml Tris-Puffer pH 6 suspendierten Alginatkugeln werden unter sterilen Bedingungen für wenigstens 30 min auf 4–5°C gekühlt. Anschließend gibt man 500 ml Gelatinelösung, die bei 30°C flüssig gehalten wird, zu und inkubiert unter leichtem Schütteln für 10–30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Sedimentieren der beschichteten Kugeln entfernt man den Überstand durch Dekantieren.
Beispiel VI
Vernetzung der gelatinebeschichteten Calciumalginatkugeln
Gelatinebeschichtete Calciumalginatkugeln werden unter sterilen Bedingungen in 200 ml Tris-Puffer resuspendiert und mit 0,2–2 mg Transglutaminase versetzt. Man inkubiert 30 min bei 37°C. Nach Sedimentieren der Kapseln wird das Enzym durch Dekantieren entfernt. Anschließend werden das Beschichtungsverfahren mit Gelatine und die Vernetzung mit Transglutaminase wenigstens zweimal wiederholt. Zur Vervollständigung der enzymatischen Proteinvernetzung lagert man nach der letzten Beschichtung die Alginat-Gelatinekugeln mit Transglutaminase über Nacht bei 4°C. Beschichtete und vernetzte Immobilisate sind wenigstens 4 Wochen ohne Einbuße von Sporenvitalität bei 4°C lagerfähig.
Beispiel VII
Herstellung von Proteinhohlkugeln mit eingeschlossenen Sporen und Kartoffelstärke
Die vernetzten Alginatgelatinekapseln werden nach Abdekantieren des Transglutaminasehaltigen Tris-Puffers mit 1 Liter NaCl-Puffer versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur vorsichtig bewegt. In diesem Zeitraum entstehen durchsichtige Hohlkugeln, in denen die Kartoffelstärke in Form weißer Granulate sichtbar wird. Die Hohlkugeln werden einmal mit 500 ml NaCl-Puffer und zweimal mit 500 ml sterilem Wasser gewaschen. Sie können bis zu einer Woche bei 4°C gelagert werden.
Beispiel VIII
Mineralisierung von Proteinhohlkugeln mit eingeschlossenen Sporen und Kartoffelstärke
Feuchte, beladene Hohlkugel werden unter sterilen Bedingungen in 500 ml 0,5 M Ca(NO₃)₂ und 300 ml 0,5 M (NH₄)₂HPO₄ suspendiert. Der pH wird mit 25% Ammoniaklösung von etwa 5.0 auf 9.5 angehoben. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei Raumtemperatur dekantiert man den Überstand und wiederholt zweimal das Verfahren. Am Ende werden die mineralisierten Hohlkugeln mit Citratpuffer pH 6,0 gewaschen und bei 4°C in Tris-Puffer gelagert.
Beispiel IX
Herstellung eines Flüssigmediums zur Kultivierung von immobilisiertem Streptomyces mobaraensis
Zur Herstellung eines Mineralsalz-Medium werden 20 g Pepton, 2 g Hefeextrakt, 1 g K₂HPO₄, 2 g (NH₄)₂SO₄, 1 g MgSO₄ × 7 H₂O und 1 g NaCl in 1 Liter deionisiertem Wasser gelöst. Man stellt mit NaOH den pH auf 7.0 ein.
Beispiel X
Herstellung von Additiven für die Kultivierung von immobilisiertem Streptomyces mobaraensis

a) 5% Glucoselösung: 50 g Glucose werden in 1 Liter Milli-Q-Wasser gelöst.
b) Spurenelementlösung: 4 g CaCl₂ × 2 H₂O, 1 g Eisen(III)citrat × H₂O, 0,2 g MnSO₄, 0,1 g ZnCl₂, 40 mg CuSO₄ × 5 H₂O, 30 mg CoCl₂ × 6H₂O und 60 mg Na₂B₄O₇ werden in 1 Liter Milli-Q-Wasser gelöst.

Beispiel XI
Kultivierung von Streptomyces mobaraensis in mineralisierten Hohlkugeln
1-Liter-Schikanekolben werden mit 110 ml Mineralsalzmedium befüllt, 20 min bei 1 bar Überdruck (121°C) erhitzt und mit jeweils 1 ml Glucose- und Spurenelementlösung über einen Sterilfilter mit Ausschlussgrenze von 0,2 Mikrometer angereichert. Anschließend erfolgt unter sterilen Bedingungen die Zugabe feuchter Sporenkapseln, wobei die Menge in Abhängigkeit vom erzielten Produkt zwischen 5 ml und 50 ml variiert wird. Die Kultivierung erfolgt 30–90 Stunden bei 28–37°C auf einem Rundschüttler mit einer Frequenz von 103/min.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 102004013637 A1 [0013]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Prakash und Martoni (2006) Appl. Biochem. Biotechnol. 128, 1–22 [0006]
- De Stefano et al. (2006) Biophys. Chem. 122, 221–231 [0007]
- An und Lo (2001) J. Environ. Sci. Health: A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 36, 101–115 [0007]
- Jen et al. (1996) Biotechnol. Bioeng. 50, 357–364 [0008]
- Rao (1995) J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 7, 623–645 [0008]
- Dynarowicz-Łatka et al. (2001) Adv. Colloid Interface Sci. 91, 221–293 [0010]
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- Lehn (2002) Science 295, 2400–2403 [0011]
- Ai et al. (2003) Cell Biochem. Biophys. 39, 23–43 [0012]
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- Sun et al. (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 757–764 [0015]
- Schuster et al. (2005) Methods Mol. Biol. 300, 101–123 [0016]
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- Siegmund et al. (2008) J. Biomech. 41, 1427–1435 [0024]
- Gerber et al. ((1994) J. Biochem. 299, 825–829 [0029]

Claims

Mehrstufenverfahren zur Herstellung mineralisierter Proteinhohlkörper mit eingeschlossenem biologischen und chemischen Material dadurch gekennzeichnet, dass die für den Einschluss primär hergestellten Kapseln nach Proteinbeschichtung und enzymatischer Vernetzung wieder aufgelöst und die verbleibenden Proteinhohlkörper mit einem anorganischen Schutzmantel chemisch, biologisch und mechanisch stabilisiert werden.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass tierische und pflanzliche Zellen, Einzeller und multizelluläre Bakterien, Enzyme, pharmazeutische Wirkstoffe, Farbstoffe und anderes biologisches oder chemisches Material durch Ausfällen von polymeren Säuren mit zwei- oder mehrwertigen Metallkationen in die sich bildenden Kapseln eingeschlossen werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass für den Einschluss vorzugsweise natürliche Zuckersäuren wie Alginsäure, Carageen oder Pectin verwendet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass für die Fällung der polymeren Säuren vorzugsweise zwei- und dreiwertige Kationen wie Ca¹ ⁺, Mg² ⁺, Ba² ⁺, Sr² ⁺, Mn² ⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺ oder Al³⁺ verwendet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass sphärische Kapseln mit Durchmesser von 10^–3–10^–9 Meter erzeugt werden.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass durch Eintropfen einer Mischung aus polymerer Carbonsäure und Einschlussgut in eine gerührte Metallionenlösung sphärische Kapseln mit Durchmesser von 10^–3–10^–6 Meter erzeugt werden.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass durch Einsprühen einer Mischung aus polymerer Carbonsäure und Einschlussgut in eine bei 5.000–20.000 rpm gerührten Metallionenlösung Nanopartikel (10^–7–10^–9 Meter Durchmesser) erzeugt werden.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die primären Kapseln mit dem Einschlussgut mit Protein ein- oder mehrfach beschichtet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 8 dadurch gekennzeichnet, dass durch die Anzahl der Beschichtungsverfahren Durchlässigkeit und Porosität der äußeren Kapselhülle grob eingestellt wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 8 und 9 dadurch gekennzeichnet, dass die primären Kapseln bevorzugt mit basischem Protein ein- oder mehrfach beschichtet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 8 und 9 dadurch gekennzeichnet, dass die primären Kapseln besonders bevorzugt abwechselnd mit basischem Protein und saurem Protein mehrfach beschichtet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 8–11 dadurch gekennzeichnet, dass die primären Kapseln mit Gelatine ein- oder mehrfach beschichtet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 8–10 dadurch gekennzeichnet, dass die primären Kapseln bevorzugt mit Gelatine Typ A, die aus sauer aufgeschlossenem kollagenen Material gewonnen wird, ein- oder mehrfach beschichtet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 8, 9 und 12 dadurch gekennzeichnet, dass die primären Kapseln ganz besonders bevorzugt mit Gelatine Typ A und Gelatine Typ B, die aus basisch aufgeschlossenem kollagenen Material gewonnen wird, abwechselnd mehrfach beschichtet werden.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die proteinbeschichteten Kapseln mit dem Einschlussgut enzymatisch vernetzt werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 15 dadurch gekennzeichnet, dass die proteinbeschichteten Kapseln mit Transglutaminasen, Laccasen, Peroxidasen, Sortasen oder Lysyloxidasen vernetzt werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 15 und 16 dadurch gekennzeichnet, dass die proteinbeschichteten Kapseln bevorzugt mit Transglutaminasen vernetzt werden.
Mehrstufenverfahren nach nach den Ansprüchen 1, 15–17 dadurch gekennzeichnet, dass die proteinbeschichteten Kapseln ganz besonders bevorzugt durch Transglutaminase von Streptomyceten vernetzt werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 15–18 dadurch gekennzeichnet, dass die proteinbeschichteten Kapseln mit noch höherem Vorzug durch Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis vernetzt werden.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass durch Auflösen des inneren Kerns der mit Protein beschichteten und enzymatisch vernetzten Kapseln ein labiler Proteinhohlkörper entsteht.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 20 dadurch gekennzeichnet, dass die Auflösung des inneren Kerns und die Bildung von labilen Hohlkörpern mit einwertigen Kationen erfolgt.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 20 dadurch gekennzeichnet, dass die Auflösung des inneren Kerns und die Bildung von labilen Hohlkörpern mit Komplexbildnern von zwei- und mehrwertigen Kationen erfolgt.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 20–22 dadurch gekennzeichnet, dass die Auflösung des inneren Kerns und die Bildung von labilen Hohlkörpern bevorzugt mit EDTA-Natrium bzw. einem Natriumsalz eines löslicheren EDTA-Derivats erfolgt.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 20–22 dadurch gekennzeichnet, dass die Auflösung des inneren Kerns und die Bildung von labilen Hohlkörpern ganz besonders bevorzugt mit Natriumcitrat erfolgt.
Mehrstufenverfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die labilen Hohlkörper durch Aufbau schwer löslicher Kollagen-Mineralsalz-Komposite chemisch, biologisch und mechanisch stabilisiert werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1 und 25 dadurch gekennzeichnet, dass durch Aufbau schwer löslicher Kollagen-Mineralsalz-Komposite die Durchlässigkeit und Porosität der Hohlkörper abschließend eingestellt wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25 und 26 dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mineralsalz-Komposit mit löslichen Ammonium- oder Erdalkalisalzen der Phosphorsäure, Polyphosphorsäure, Kohlensäure, Kieselsäure oder Flusssäure bei pH 7–11 aufgebaut wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25–27 dadurch gekennzeichnet, dass für den Aufbau des schwer löslichen Minerals bevorzugt Calciumsalze verwendet werden.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25–28 dadurch gekennzeichnet, dass zur anorganischen Ummantelung der Kollagenfasern Hydroxylapatit der allgemeinen Formel [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂] aufgebaut wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25–28 dadurch gekennzeichnet, dass zur anorganischen Ummantelung der Kollagenfasern Calcit oder Magnesit der allgemeinen Formeln CaCO₃ und MgCO₃ aufgebaut wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25–28 dadurch gekennzeichnet, dass zur anorganischen Ummantelung der Kollagenfasern Wollastonit der allgemeinen Formel Ca₃[Si₃O₉] aufgebaut wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25–28 dadurch gekennzeichnet, dass zur anorganischen Ummantelung der Kollagenfasern Fluorit der allgemeinen Formel CaF₂ aufgebaut wird.
Mehrstufenverfahren nach den Ansprüchen 1, 25–28 dadurch gekennzeichnet, dass zur anorganischen Ummantelung der Kollagenfasern Mischkristalle aus den in den Ansprüchen 28–32 genannten Mineralien aufgebaut werden.