DE10138580B4 - Nährstoffhaltiges Kompositmaterial - Google Patents
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Abstract
Nährstoffhaltiges
Kompositmaterial, gekennzeichnet durch ein aus einem Nanogel hergestelltes,
anorganisches Xerogel, das in homogener Verteilung mindestens einen
Nährstoff
enthält,
der die Adhäsion
und das Wachstum von Mikroorganismen fördert.
Description
- Die Erfindung betrifft ein nährstoffhaltiges Kompositmaterial. Das Material kann insbesondere zur Besiedlung mit und Immobilisierung von Mikroorganismen in der medizinischen Diagnostik, in der Biotechnologie und im Umweltschutz eingesetzt werden.
- Mikrobielle Stoffumwandlungen werden in zunehmendem Maße in trägerfixierter Form in der medizinischen Diagnostik, Biotechnologie und im Umweltschutz genutzt. Beispielsweise werden immobilisierte Hybridzellen zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet, eine Reihe organischer Säuren (Gluconsäure, Zitronensäure, Essigsäure) und Enzyme (Proteasen, Amylasen) durch Verfahren gewonnen, bei denen die entsprechenden Mikroorganismen auf einem festen Träger fixiert sind, und trägerfixierte Mikroorganismen werden im großem Umfang in Umlaufreaktoren zur Entsorgung hoch belasteter Abwässer der Celluloseindustrie sowie in der Abluftreinigung eingesetzt. Fixierte oder eingekapselte Mikroorganismen ermöglichen, die Verweilzeit von Biokatalysator und Reaktanten zu entkoppeln und dadurch die Produktausbeute zu optimieren, sowie die Produktaufarbeitung und Abtrennung des Biokatalysators zu erleichtern. Die Fixierung und Vermehrung von Mikroorganismen auf einem Träger sind darum von großem praktischen Interesse. Die Fixierung der Mikroorganismen erfolgt gegenwärtig, sieht man von speziellen Varianten der chemischen Vernetzung untereinander oder mit dem Schichtträger ab, auf zwei unterschiedliche Weisen:
- (a) Einbettung
in eine poröse
organische oder anorganische Matrix, beispielweise in polymere Gele
(
US 4450233 ), z.T. gemischt mit pflanzlichen Polymeren (US 5595893 ), in Alginat/Polyethylenglykol/Polyethylenimid- (US 6153416 ) bzw. Alginat/SiO2-Mischungen (US 4797358 ), in Polyvinylakohol (US 5290693 ) oder in Polysaccharid-Gele, vernetzt durch Polykationen (US 4996150 ). Der Vorteil dieser Variante besteht in einer vollständigen Immobilisierung der Mikroorganismen verbunden mit einer guten Handhabbarkeit (z.B. gut dosierbar, gut filtrierbar, meist wiederverwendbar). Die Nachteile dieser Methode bestehen darin, dass zur Verkapselung die einzubettenden Mikroorganismen in isolierter, hochkonzentrierter Form vorliegen müssen (was häufig nicht der Fall ist) sowie in der meist geringen biokatatytischen Aktivität (z. B. durch teilweise Zerstörung der Mikroorganismen während des Einkapselungs-/Trocknungsprozesses oder verringerte Zugänglichkeit der Reaktanten). - (b) Adsorption der Mikroorganismen an einer Trägeroberfläche, beispielsweise
an offenporigen Sintermaterial (
US 4987068 ), natürlichen Keramiken wie Sericit (JP 10057053 US 5939294 ) oder Baumwoll-Gewebe (US 4450233 ). Die Vorteile einer hohen Reaktivität der Mikroorganismen und des Einsatzes verdünnter Suspensionen, z. T. in natürlicher Umgebung (z.B. Schlamm- und Bodenwässer), stehen häufig Nachteile wie geringe Haftung, geringe Konzentration und damit geringe Lebensdauer gegenüber. Es gibt darum Bemühungen, Träger für Zellkulturen dadurch zu verbessern, dass an kolloidalen anorganischen Pigmenten wie SiO2 Haftschichten aus Chitosan (GB 218 3674) bzw. an SiO2- und Al2O3-Partikeln Nährstoffe adsorbiert werden (GB 825480,EP 0354748 , WO 9218623). Diese Varianten haben sich aber bislang nicht bewährt, da zum einen durch die Adsorption der Additive auf den porösen anorganischen Trägern Haftstellen für die Mikroorganismen blockiert werden, zum anderen die genannten Additive gut wasserlöslich sind und bei der (in der Regel in wässrigen Medien stattfindenden) Nutzung zusammen mit den Mikroorganismen schnell heruntergelöst werden. -
GB 825 480 - In der Zeitschrift Env. Sci. Technol. 2000, 34, 3235–3241, wird die Immobilisierung von Mikroorganismen an Silicapartikel mit Teilchendurchmessern von mehr als 10 μm beschrieben. Ein nährstoffhaltiges Kompositmaterial auf Basis von Nanoteilchen wird nicht offenbart.
- Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Träger für biologische Zellen, Zellgruppen oder Zellkulturen (z. B. Mikroorganismen) zu entwickeln, der eine gute und dauerhafte Haftung der Zellen ermöglicht, dabei das Wachstum fördert und zu einer hohen biologischen Aktivität der immobilisierten Zellen führt.
- Diese Aufgabe wird durch ein Kompositmaterial und ein Verfahren zu dessen Herstellung mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 oder 8 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
- Die Grundidee der Erfindung ist es, ein Kompositmaterial als Träger für die Ansiedlung von ein- oder mehrzelligen Mikroorganismen bereitzustellen, das unter der Oberfläche über Nährstoff verfügt, die den Mikroorganismen zugänglich sind, wobei das Kompositmaterial auf einem aus einem Nanogel hergestellten anorganischen Xerogel basiert, in dem mindestens ein Nährstoff homogen verteilt angeordnet ist. Überraschenderweise konnte die Aufgabe erfindungsgemäß insbesondere dadurch gelöst werden, dass das Kompositmaterial durch die inkorporierten Nährstoffe für die Zellen als Träger zum Anhaften und Wachstum attraktiv gemacht wird. Vorteilhafterweise wird damit ein biologisches Wachstums- und Vermehrungsprinzip technisch umgesetzt. Zahlreiche Organismen in der Natur (z. B. Saprophyten, Parasiten) siedeln sich auf bestimmten Oberflächen (Blättern, Früchten) bevorzugt an, wenn ihnen dadurch Nährstoffe zugänglich sind, welche aus dem Inneren durch die Epidermis des Wirts diffundieren. Dieses Prinzip technisch zu nutzen und Träger für die Ansiedlung von Mikroorganismen attraktiv zu machen, bedeutet, Träger zu entwickeln, die unter der Oberfläche über zugängliche Nährstoffe verfügen. Die technische Realisierung gelingt durch die Nutzung der Sol-Gel-Technik, indem eine wässrige Lösung eines Nährstoffgemisches mit einem wässrigen oder wässrig-alkoholischen Nanosol, das aus Nanopartikeln von reinen und organisch modifizierten anorganischen Oxiden der 3.–5. Gruppe des Periodensystems wie SiO2, R-SiOn, R2SiOn, Al2O3, TiO2 oder deren Gemischen besteht, wobei R = H, Alkyl, Aryl, Epoxy-alkyl, Aminoalkyl und n = 1.5 oder 1 sein kann, gemischt, geliert und getrocknet wird, wodurch poröse nährstoffhaltige Kompositmaterialien in Form von Pulvern, Granulaten oder Schichten gebildet werden, die in homogener Verteilung die eingesetzten Nährstoffe in immobilisierter Form enthalten.
- Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein nährstoffhaltiges Kompositmaterial bestehend aus einem anorganischen Xerogel, das aus einem Nanogel hergestellt ist und in homogener Verteilung mindestens einen Nährstoff, vorzugsweise jedoch ein Nährstoffgemisch enthält, welches die Adhäsion und das Wachstum von Mikroorganismen auf der Materialoberfläche fördert. Die moderne Sol-Gel-Technik ermöglicht die Einbettung unterschiedlicher Biomaterialien, z.B. von Proteinen und sogar lebenden Zellen in eine anorganische Oxidmatrix. Vorteile dieser Technik sind: die Bioaktivität bleibt erhalten, die poröse Struktur ermöglicht die weitgehend ungehinderte Ein- und Ausdiffusion kleiner Moleküle, die Nutzung kann in unterschiedlichen Applikationsformen z.B. als Pulver, Granulat oder Beschichtung erfolgen.
- Als anorganischer Xerogel können reine und organisch modifizierte anorganische Oxide der 3.–5. Gruppe des Periodensystems wie SiO2, R-SiOn, R2SiOn, Al2O3, TiO2 oder deren Gemische verwendet werden, wobei R = H, Alkyl, Aryl, Epoxy-alkyl, Aminoalkyl und n = 1.5 oder 1 sein kann. Die Xerogele werden aus den entsprechenden Nanosolen durch einen Sol-Gel-Prozeß (vgl. J.C.Brinker, G.W.Scherer, Sol-Gel Science, Academic Press, London 1990) nach folgendem Schema (Beispiel SiO2-Schichten) hergestellt:Schema 1: Herstellung nährstoffhaltiger Kompositmaterialien (am Beispiel SiO2-Gele)
- Für die Herstellung der nährstoffhaltigen Kompositmaterialien werden vorzugsweise Nanosole verwendet, die durch saure Hydrolyse der entsprechenden Precursoren (Silicium- oder Metall-alkoxyde, -halogenide bzw. Metallsalze wie Acetate, Nitrate) in wässrigalkoholischer Lösung hergestellt werden. Die sauren, alkoholhaltigen Nanosole haben den Vorteil, dass sie beim Beschichten sehr gut haftende transparente Filme bilden. Im Falle bestimmter Nährstoffe (z.B. Proteine, Polysaccharide) können sich Probleme ergeben, wenn diese Stoffe sich aufgrund ihrer geringen Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln nicht in den wässrig-alkoholischen Nanosolen lösen. In diesem Falle ist es zweckmäßig, den Alkohol durch vorsichtiges Ausblasen mit Luft und gleichzeitiger Wasserzugabe (adäquat zur verflüchtigten Alkoholmenge) zu entfernen und die resultierenden rein wässrigen Nanosole einzusetzen.
- Zur Herstellung des nährstoffhaltiges Kompositmaterials werden wässrige Lösungen von einem oder mehreren Nährstoffen oder von Nährstoffgemischen (meist in einem Phosphat-Puffer) eingesetzt, die die folgenden Bestandteilen aufweisen:
- (1) lösliche Kohlenhydrate als Kohlenstoffquelle, z.B. Glucose, Dextrine, Stärke, Malzextrakt,
- (2) lösliche organische oder/und anorganische Stickstoff-Verbindungen wie Proteine, Peptone, Sojamehl, Hefeextrakt bzw. Ammoniumverbindungen,
- (3) Salze der Spurenelemente, vorzugsweise von Mangan, Molybdän, Zink, Kupfer, Kobalt, und/oder
- (4) Wachstumsfaktoren, z.B. Vitamine wie Vitamin B1, B4, B12, Biotin, ungesättigte Fettsäuren bzw. spezielle Glykoproteine.
- Für zahlreiche Anwendungen können auch fertige Nährstoff-Konzentrate eingesetzt werden, die von verschiedenen Herstellern kommerziell angeboten werden. Im Falle komplexer Kulturmedien, die z.B. durch Hydrolyse von Casein, Rindfleisch, Soja, Hefe erhalten werden, kann auf die Zudosierung von Spurenelementen verzichtet werden. Allerdings ist es für die Ansiedlung bestimmter Mikroorganismen notwendig, dass hinreichende Mengen bestimmter Makronährstoffe (K, Na, Mg, Ca, Fe, P und S) vorhanden sind, wobei durch die Verwendung entsprechender Pufferlösungen ein Teil der genannten Elemente ausreichend abgedeckt wird. Hierbei wird berücksichtigt, dass unterschiedliche Mikroorganismen unterschiedliche Anforderungen an ein optimales Nährstoffgemisch stellen.
- Der Anteil des Nährstoffgemisches beträgt im allgemeinen 5 bis 50 Gew.-% bezogen auf die Kompositmenge.
- Entspechend Schema 1 erhält man durch die Mischung der wässrigen oder wässrig-alkoholischen Nanosole mit den Nährstofflösungen klare Komposit-Lösungen, die in folgender Weise weiterverarbeitet werden können:
- (a) nach Neutralisation und/oder Erwärmen auf ca. 60°C gelieren die Lösungen zu transparenten Lyogelen. Die Gelierung verläuft um so schneller, je höher der Feststoffgehalt der Komposit-Lösung ist. Das Lyogel wird zerkleinert und dann an der Luft, später im Trockenschrank, bei maximal 100°C in Abhängigkeit von der thermischen Stabilität der organischen Bestandteile getrocknet. Man erhält Xerogele in Form von Granulaten, die sich zur Füllung von Kolonnen eignen. Lässt man durch so gefüllte Kolonnen Suspensionen strömen, die Mikroorganismen enthalten, findet eine schnelle Beladung statt. Wenn man die Oberfläche des nährstoffhaltigen Kompositmaterials (und damit die Reaktivität) vergrößern möchte, kann man die Granulate vorsichtig mörsern oder mahlen und sieben, woraus Komposit-Pulver mit gewünschter Teilchengröße resultieren.
- (b) durch Beschichten beliebiger fester oder flexibler Träger, z.B. aus Glas, Metall, Kunststoff, Textilien, durch konventionelle Beschichtungstechniken wie Tauchen, Sprühen Streichen und Trocknen an der Luft, später im Trockenschrank, bei maximal 100°C (in Ab hängigkeit von der thermischen Stabilität der organischen Bestandteile) erhält man beschichtete Träger, die wiederum mit Suspensionen, die Mikroorganismen enthalten, beladen werden können.
- Prinzipiell ist es in speziellen Fällen auch möglich und vorteilhaft, bereits den nährstoffhaltigen Kompositsolen Mikroorganismen in fester Form oder als wässrige Suspension zuzusetzen und nach der Gelierung direkt im Innern der porösen Kompositgele zu immobilisieren.
- Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des nährstoffhaltigen Kompositmaterials. Das Verfahren zeichnet sich durch die folgenden Schritte aus:
- (1) Herstellung eines anorganischen Nanosols, welches reine oder organisch modifizierte anorganische Oxide der 3.-5. Gruppe des Periodensystems wie SiO2, R-SiOn, R2SiOn, Al2O3, TiO2 oder deren Gemische enthält, wobei R = H, Alkyl, Aryl, Epoxy-alkyl, Aminoalkyl und n = 1.5 oder 1 sein kann, durch saure oder alkalische Hydrolyse der entsprechenden Silicium- und/oder Metallalkoxide in einem wässrigen, organischen oder gemischten Lösungsmittel,
- (2) Zumischung der wässrigen phosphathaltigen Lösung eines Nährstoffgemisches aus löslichen Kohlenhydraten, Stickstoff-Verbindungen, Salzen von Spurenelementen und Wachstumsfaktoren,
- (3) Gelierung der Mischung durch Neutralisieren oder Erwärmen, oder durch Beschichten auf einen Träger und Verdunstung des Lösungsmittels
- (4) Trocknen des Kompositgels, bspw. an der Luft, und Verfestigung durch anschließendes Erwärmen auf maximal 100°C.
- Die so erhaltenen nährstoffhaltiges Kompositmaterialien zeigen, wie auch die folgenden Beispiele ausweisen, eine vorteilhaften Besiedlung und Immobilisierung von Mikroorganismen. Die mit Mikroorganismen besiedelten Schichten zeigen eine hohe biologische Aktivität bei guter Haftung auf unterschiedlichen Trägern, guter mechanischer Stabilität und langzeitiger bioaktiver Wirkung.
- Derartige nährstoffhaltiges Kompositmaterialien können darum vor oder nach der Besiedlung mit Mikroorganismen vorteilhaft in der medizinischen Diagnostik (z.B. als immobilisiertes Nährmedium für Mikroorganismen auf Folien oder Mikrotiterplatten), in der Biotechnologie und im Umweltschutz (als Füllkörper bzw. zur Beschichtung inerter Füllkörper für Bioreaktoren) sowie aufgrund ihrer hohen Biokompatibilität als Beschichtung für medizinische Implantate genutzt werden.
- Gegenstand der Erfindung ist auch ein nährstoffhaltiges Kompositmaterialien mit den o.a. Eigenschaften, das mit Mikroorganismen besiedelt ist.
- Ausführungsbeispiele
- A. Herstellung der Metalloxid-Nanosole
- 1. Wässrig-alkoholisches SiO2-Nanosol A
- 50 ml Tetraethoxysilan, 200 ml Ethanol und 100 ml 0,01n zugetropfte Salzsäure werden 20 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende Sol hat einen SiO2-Gehalt von ca. 4.2 Gew-% in ca. 70 % Alkohol.
- 2. Wässriges SiO2-Nanosol B
- 50 ml Nanosol A wird mit 40 ml dest. Wasser verrührt und solange ein kräftiger Luftstrom durch die Lösung geleitet, bis das Volumen wieder 50 ml beträgt. Das rein wässrige SiO2-Sol hat einen Feststoffgehalt von ca. 4.2 % und ist im Kühlschrank ca. 1 Woche haltbar.
- B. Herstellung von nährstoffhaltigen Kompositbeschichtungen
- Folgende 5 Beschichtungslösungen wurden hergestellt:
- Damit wurden Glasplatten beidseitig beschichtet (tauchbeschichtet mit 30 cm/min, 1h bei 60°C getrocknet).
- C. Untersuchungen zum Bakterienwachstum auf nährstoffhaltigen Kompositbeschichtungen
- Es wurden Wachstumsversuche mit Bacillus sphaericus JG-A12 durchgeführt. Bakteriensuspension = eine 1:100 verdünnte JG-A 12 Kultur (22h, NB-Medium 30°C).
- Die beschichteten Objektträger wurden zur vorherigen Desinfektion kurz in 70 vol% Ethanol eingetaucht und anschließend für 3 min. mit 1 ml der Bakteriensuspension überschichtet. Nach 3 Minuten wurde die Lösung abgeschüttelt und die Objektträger sofort in 50ml Greiner-Röhrchen überführt. Die Röhrchen enthielten feuchtes Filterpapier und wurden im Bereich des Filterpapiers in ein 40°C warmes Wasserbad eingetaucht, so dass die Röhrchen mit Luftfeuchtigkeit gesättigt waren. Alle 2-3 Tage wurde überprüft, ob sich Merkmale für einen deutlichen Bewuchs der Oberfläche zeigten (Trübung, Koloniebildung).
- Nach drei Wochen wurden die Oberflächen mit je 5 ml physiologischer NaCl abgespült und die KBE bestimmt.
- Ergebnisse:
- Zellzahl der verwendeten Bakteriensuspension = 1,6·106/ml KBE abgelöster Bacillus sphaericus Zellen nach 3 wöchiger Inkubation
- D. Untersuchungen zum mikrobiellen Abbau-Verhalten durch Nutzung nährstoffhaltiger Kompositbeschichtungen
- Trägermaterial in Form von Quarzglasrohren (20 cm Länge, 18 mm Durchmesser) wurde mit den nährstoffhaltigen Kompositbeschichtungs-Lösungen A-E beidseitig durch Tauchbeschichtung (Ziehgeschwindigkeit 30 cm / min) beschichtet und erst an der Luft, dann 1 Std. bei 60°C getrocknet. Alle Proben wurden anschließend einer Belebtschlammprobe kommunalen Abwassers unter aeroben Bedingungen bei Raumtemperatur ausgesetzt. Nach 11 Tagen erfolgte die Prüfung anhand des CSB-Wertes (Chemischer Sauerstoffbedarf). Der CSB-Wert ist ein Summenparameter für die gesamtorganische Belastung des Abwassers. Seine Verringerung dokumentiert das mikrobielle Abbauvermögen im System, das in direktem Zusammenhang zum Bakterienbewuchs auf dem jeweiligen Träger steht.
- Ergebnisse:
- CSB-Werte des Abwassers nach 11 Tagen (Startwert 301 mg/l)
Claims (10)
- Nährstoffhaltiges Kompositmaterial, gekennzeichnet durch ein aus einem Nanogel hergestelltes, anorganisches Xerogel, das in homogener Verteilung mindestens einen Nährstoff enthält, der die Adhäsion und das Wachstum von Mikroorganismen fördert.
- Kompositmaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als anorganisches Xerogel reine oder organisch modifizierte anorganische Oxide der 3.–5. Gruppe des Periodensystems insbesondere SiO2, R-SiOn, R2SiOn, Al2O3, TiO2 oder deren Gemische verwendet werden, wobei R = H, Alkyl, Aryl, Epoxyalkyl, Aminoalkyl und n 1,5 oder 1 sein kann.
- Kompositmaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das anorganische Xerogel mehrere Nährstoffe als Nährstoffgemisch enthält.
- Kampositmaterial gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Nährstoffgemisch eine Mischung aus (1) löslichen Kohlenhydraten, (2) löslichen Stickstoff-Verbindungen, (3) Salzen der Spurenelemente und (4) Wachstumsfaktoren enthalten ist.
- Kompositmaterial gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, das der Anteil des mindestens einen Nährstoffes oder Nährstoffgemisches 5 bis 50 Gew.-% bezogen auf die Kompositmenge beträgt.
- Kompositmaterial gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kompositmaterial als Pulver, als Granulat oder als Beschichtung auf einem festen oder flexiblen Träger gebildet ist.
- Kompositmaterial gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kompositmaterial zur vorteilhaften Besiedlung und Immobilisierung von Mikroorganismen in der medizinischen Diagnostik, Biotechnologie oder im Umweltschutz eingesetzt wird.
- Verfahren zur Herstellung des nährstoffhaltigen Kompositmaterials gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (1) Herstellung eines anorganischen Nanosols, welches reine oder organisch modifizierte anorganische Oxide der 3.–5. Gruppe des Periodensystems wie oder deren Gemische enthält, durch saure oder alkalische Hydrolyse der entsprechenden Silicium- und/oder Metalloxide in einem wässrigen, organischen oder gemischten Lösungsmittel, (2) Zumischung der wässrigen phosphathaltigen Lösung mindestens eines Nährstoffes oder Nährstoffgemisches aus löslichen Kohlenhydraten, Stickstoff-Verbindungen, Salzen von Spurenelementen und Wachstumsfaktoren, (3) Gelierung der Mischung durch Neutralisieren oder Erwärmen, oder durch Beschichten auf einen Träger und Verdunstung des Lösungsmittels, und (4) Trocknen des Kompositgels.
- Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Oxide der 3.–5. Gruppe des Peridensystems SiO2, R-SiOn, R2SiOn, Al2O3 oder TiO2 sind.
- Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, bei dem das Trocknen des Kompositgels an der Luft erfolgt und eine Verfestigung durch anschließendes Erwärmen auf maximal 100°C vorgesehen ist.
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