NL8004068A - Werkwijze voor de bereiding van biologisch verdraagzame materialen door immobilisatie van apyrase op het opper- vlak. - Google Patents

Description

v 803242/vdV/hh

Korte aanduiding: Werkwijze voor de bereiding van biologisch verdraagzame materialen door immobilisatie van apyrase op het oppervlak.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van biologisch verdraagzame polymeren en niet-polymere materialen door het immobiliseren van apyrase op het oppervlak.

Apyrase is een enzym dat adenosinedifosfaat (ADP) katalytisch in 5 adenosinemonofosfaat (AMP) en vervolgens in adenosine omzet. De uitvinding heeft eveneens betrekking op de onder toepassing van de onderhavige werkwijze vervaardigde produkten.

De mogelijkheid allerlei materialen biologisch verdraagzaam te maken is thans van enorme praktische betekenis. Er bestaan mate-10 rialen die door hun goede mechanische eigenschappen, mechanische bewerkbaarheid, sterkte en gifvrijheid zondermeer voer de vervaardiging van meer of minder langdurig ingeplante prothesen of bij de constructie van onderdelen van hulpapparaten voor buitenlichamelijke circulatie, bijvoorbeeld renale dialyse of hart-longapparaten, 15 gebruikt zouden kunnen worden.

Hiervoor kunnen sterk uiteenlopende materialen gebruikt worden, van alifatische of aromatische polyamidepolymeren, polyesters, poly-carbonaten, polyurethanen en PVC tot speciale metaallegeringen.

Helaas wordtde toepassing van deze materialen in sterke mate belemmerd 20 door hun in het algemeen geringe biologische verdraagzaamheid. De oorzaak hiervan is dat zodra vreemde materialen in de bloedsomloop tercht komen onmiddellijk door het op gang komen van uiterst ingewikkelde processen bloedstolsels ontstaan.

Aangenomen wordt dat de bloedplaatjes zich eerst aan het 25 materiaaloppervlak hechten, waardoor de plaatjes ADP en serotonine gaan agscheiden en stolling plaatsvindt. Het klonteren van de plaatjes op zichzelf vormt de eerste fase van de vorming van thrombi, omdat hierbij fosfolipiden vrijkomen die essentieel zijn bij het 8004053 - * Γ - 2 - bloedstollingsproces, doordat ze de omzetting van fibrinageen in fibrine bevorderen.

De rol van ADP als veroorzaker van het samenklonteren van bloedplaatjes, en dos als inleider van de thrombivorming is 5 algemeen bekend. Zie o.a. het fundamentele werk van A. Gaarder en A.Hellem in Nature 192, 531 (1961). Het is dus duidelijk dat door de immobilisatie van een enzym, zoals apyrase, dat het door hechting van de plaatjes aan het met bloed in aanraking gebrachte oppervlak van het^klonteren van plaatjes wordt tegengegaan en de vorming van 10 thrombi wordt verhinderd. Men heeft nu gevonden dat het volgens de onderhavige uitvinding mogelijk is apyrase op het. oppervlak van thrombogene materialen te immobiliseren waardoor laatstgenoemden biologisch verdraagzaam worden.

Deze eigenschappen zijn onafhankelijk van het systeem dat voor 15 het immobiliseren van het enzym wordt toegepast en kunnen worden verkregen door adsorptie en vervolgens verknoping op het oppervlak van polymeren of zelfs metaaloppervlakken, bijvoorbeeld het oppervlak van naalden die voor arterieveneuze verbindingen bij buiten-lichamelijke circulatie worden gebruikt.

20 Verder kan men apyrase covalent binden aan de functionele groepen op het oppervlak van de materialen, waarvan de biologisch verdraagzaamheid verhoogd moet worden. Het is zelfs mogelijk het materiaal van tevoren te activeren door reactieve groepen op het 25 oppervlak die voor het immobiliseren van apyrase gebruikt kunnen worden, vrij te maken.

Men kan bijvoorbeeld het enzym covalent aan de amino- (of carboxyl)-groepen van alifatische of aromatische polyamiden, die aan een milde oppervlakte-hydrolyse zijn onderworpen, binden.

30 Op dezelfde wijze kan men de carboxylgroepen van aan het oppervlak gehydrolyseerde polyesters gebruiken^..

De uitvinding zal nu aan de hand van de volgende geen beperking inhoudende voorbeelden nader worden toegelicht. p ' materiaal, gevormde ADP in AMP en adenosine kan omzetten, het 8004068 3*- - 3 -

VOORBEELD I

Men vervaardigt,,Nylon 6"-ringen (lengte 9 mm, inwendige diameter 4 mm, uitwendige diameter 5 mm) waarvan men tijdens de mechanische bewerking de randen afvlakt en afrondt.

Aan de buitenkant van de ring brengt men langs de gehele 5 omtrek in het midden een 0,25 mm diepe gleuf aan.

Men. hydrolyseertde ringen 1 uur bij 37°C in 3,5 N HC1. De oppervlaktehydrolyse van nylon wordt colorimetrisch aangetoond door de ringen na wassen met water in een oplossing onder te dompelen die 0,1$ (gewicht-volume) trinitrobenzeensulfonzuur in een verzadigde 10 tetraboraatoplossing bevat.

Na ongeveer 1 uur blijkt uit het ontstaan van een oranje kleur op het nylonoppervlak, dat hydrolyse heeft plaats gehad. Vervolgens dompelt men de ringen 3,5 uur bij 4°C onder in een 2,5$-ige giutaartsldehyde-oplossing. <1sn was~ de ringen vervolgens snel in 15 ijswater en dompelt onder in een 0,01 M fosfaatbufferoplossing die per ml 8 mg apyrase bevat (soortgelijke werkzaamheid 3,4 U.I./mg met ADP als substraat). Men laat een dag en een nacht bij 4°C reageren. Daarna worden de ringen in gedestilleerd water gewassen en de enzymewerking vastgesteld. Men dompelt één ring onder in 50 ml van 20 een 0,1 M tris HCl-bufferoplossing met pH 7,4 die 0,25 mg/ml CaC^ bevat.

Men roert het mengsel bij 25°C. Elke 30 minuten worden monsters van 1 ml getrokken en geanalyseerd ter bepaling van de anorganische fosfaten volgens de methode van Fiske en Subbarow (C.H.Fiske; 25 Y. Subbarrow? J.Biol.Chem. 66, 375, (1925)). De ringen bezitten een enzymatische werkzaamheid van 4,5 pmol vrijgekomen anorganische fosfaten per uur.

Men onderwerpt de nylonringen met de covalente aan de amino-groepen op het oppervlak gebonden apyrase aan een biologische ver-30 ^raccgaamheidsproef "in vivo” door inplanten in de femoraie ader ' 3004068 4r - 4 - van honden van gemiddelde grootte.

Het inplanten vindt onder algemene anaesthe sie plaats waarbij de ring na het inplanten in de ader met zijden draden wordt bevestigd. De wond werd gehecht en antibiotica aan het dier toegedierld, 5 Eenzelfde onbehandelde nylonring wordt ter vergelijking op dezelfde wijze ingeplant.

Na 15 dagen worden de ringen verwijderd en onderzocht. a apyrase bleek open te zijn terwijl de blanco-ring r

De ring met/de uit de hond verwijderde apyrase-ring toonde dat per uur ongeveer 4pmol anorganische fosfaten vrijkomen.

1° VOORBEELD II

Men vervaardigt de in voorbeeld I beschreven Nylon 6-ringen die men in een 8 mg/ml apyrase bevattende 0,01 M fosfaatbufferoplossing met pH 7 onderdompelt.

Na 4 uur voegt men een dubbele hoeveelheid van een 2,5^-ige 15 gLutaaraldehyde-oplossing in een 0,01 M fosfaatbufferoplossing met pH = 7 toe.

Men laat het mengsel een dag en een nacht bij 4°C reageren, wast de ringen en beproeft de enzymewerking volgens de in voorbeeld I beschreven methode.

20 De enzyme-activiteit bedraagt ongeveer 2 pmol per uur en per ring vrijkomende anorganische fosfaten. De biologische verdraagzaam-heidsproeven voert men "in vivo" uit door de apyraseringen en blanco-ringen in de femorale ader van honden van gemiddelde grootte in te planten.

25 De hierbij toegepaste methode is* in voorbeeld I beschreven. Na 15 dagen worden de ringen verwijderd. De ring met apyrase bleek open te zijn en een enzymwerking te bezitten van ongeveer 2 pmol vrijgekomen anorganische fosfaten per uur.

De blanco-nylonring was volledig verstopt.

30 VOORBEELD III

Men vervaardigt polyetheentereftalaatrinaen zoals beschreven in voorbeeld I. Men hydrolyseert de ringen 5 uur bij 50°C in ^volkomen mei thrombi verstopt was 80 0 4 0 6-8 - 5 - ·*_ in 1 Μ ΝαΟΗ, wast de ringen en dompelt ze onder in 50 ml van een oplossing die 8 mg/ml apyrase en 10 mg/ml N-ethyl-N'(3-dimethyl-aminopropylcarbodiïmide) in een 0,1 M fosfaatbuffer met pH s 6,8 be-* vat. Men laat gedurende een nacht bij 4°C reageren. Hierdoor wordt 5 de apyrase'door de vorming van een amidobinding tussen de £-amino-lysinegroepen van het enzym en de carboxylgroepen van de aan het oppervlak gehydrolyseerde polyester gebonden. De enzym-werking van deze ringen bedraagt volgens de in voorbeeld I beschreven proeven ongeveer 4 pmol vrijgekomen anorganische fosfaten per uur per ring. 10 Men voert de biologische verdraagzaambeidsproeven "in vivo" uit door de polyesterringen met apyrase en de niet-behandelde ringen in de femorale ader van proefhonden aan te brengen, waarbij men de methode van voorbeeld I toepast. Na 15 dagen worden de ringen verwijderd. De blanco-ring was volledig verstopt .terwijl de ring met 15 apyrase met uitzondering van sooradisch ‘voorkomende thrombi open was.

Het onderzoek van de enzymactiviteit op de ring na de inplanting "in vivo" toonde aan dat per uur ongeveer 3 pmol anorganische fosfaten vrijkomen.

20 VOORBEELD IV

Men vervaardigt polyetheentereftalaatringen zoals beschreven in voorbeeld I en verknoopt apyrase met deze ringen volgens de werkwijze beschreven in voorbeeld II. Na het immobiliseren bedraagt de enzymwerkzaamheid per ring ongeveer 3 pmol vrijgekomen anorganische 25 fosfaten per uur. Bij de "in vivo" uitgevoerde biologische verdraag-zaamheidsproeven met honden volgens de methode beschreven in voorbeeld I zijn de resultaten met de ringen/verknoopte apyrase, die .volledig vrij4 open en vrijwel/van thrombi zijn, positief terwijl de blanco-ringen geheel verstopt zijn. De resterende enzymwerkzaamheid op de ringen 30 bedraagt ongeveer 2,5 nmol per uur vrijgekomen anorganische fosfaten.

VOORBEELD V

Men vervaardigt ringen zoals beschreven in voorbeeld I uit g0C4 0 S3 - ·*· - 6 - C50-staal en fixeert apyrase op een aantal van deze ringen door verknopen met glutaraldehyde volgens de werkwijze beschreven in voorbeeld I. De geïmmoboliseerde werkzaamheid van de ringen blijkt bij meting ongeveer 1,5 pmol vrijgekomen anorganische fosfaten per 5 uur te zijn. De biologische verdraagzaamheidproeven "in vivo" met honden worden op de reeds eerder beschreven wijze uitgevoerd.

Na 15 dagen worden de ringen verwijderd en onderzocht. Terwijl de blanco-ringen verstopt zijn, zijn de met de apyrase verknoopte ringen open met slechts weinig thrombi aan de binnenkant. De reste-10 rende werkzaamheid van de met apyrase behandelde ringen bedraagt na het inbrengen 0,9μπιο1 vrijgekomen anorganische fosfaten per uur.

800 4 0 68

Claims (6)

1. Werkwijze voor de bereiding van biologisch verdraagzame materialen, met het kenmerk, dat men een geschikt biologisch middel, dat in staat is adenosinedifosfaat in het bloed te elimineren, op een polymeer- of metalen drager immobiliseert. 5

' 2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het biologische middel het enzym apyrase is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het biologische middel op de drager door adsorptie en verknopen immobiliseert.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het biologische middel op de drager immobiliseert door de vorming van een covalente binding tussen het biologische middel en functionele groepen op de drager.

5. Werkwijze volgens conclusie 1-4, met het kenmerk, dat de 15 polymeerdrager uit een zwak gehydrolyseerde alifatische of aromatisch polyamide, polyester, cellulosepolymeer enzovoort bestaat,

6. Biologisch verdraagzame protheseartikelen, sondes, buizen, naaiden, membranen, verschillende prothesen en kunstmatige organen in het algemeen vervaardigd onder toepassing van de werkwijze volgens 20 conclusies 1-5. g0040 68