SE448820B - Sett att framstella biokompatibla material genom immobilisering av apyras pa deras yta - Google Patents

Description

15 20 25 30 .35 _av kolorimetriskt prov genom att ringarna, efter att ha 448 820 i Nature 192, 531 (1961). Det är därför klart att imobi- lisering av ett enzym, exempelvis apyras, som kan omvandla på grund av blodplättarnas adhesion till en i kontakt med blod varande materialyta bildat ADP till AMP och adenosin kan'inhibera efterföljande blodplättaggregation och därmed blockera trombbildningen. ' Det har nu visat.sig, och utgör föremål för före- liggande uppfinning, att immobiliseringen av apyras på ytan av trombogena material ger dessa tillfredsställande biokompatibla egenskaper.

Dessa egenskaper är inte beroende av det system, som används för immobilisering av enzymet. Detta kan ske genom adsorption med efterföljande bryggbildning på det polymera materialets yta eller till och med metallytor, exempelvis på ytan av nålar som används för de arterio- venösa förbindelserna i extrakorporell cirkulation.

Alternativt kan apyrasen kovalent bindas till funk- tionella grupper på ytan av material, vilkas biokompati- bilitet skall ökas. Det är sålunda till och med möjligt, om så erfordras, att på förhand aktivera materialet så att reaktiva grupper frigörs på dess yta, vilka kan använ- das för immobilisering av apyrasen.

Så exempelvis kan enzymet bindas kovalent vid amino- (eller karboxyl-) grupper hos alifatiska eller aromatiska polyamider, som utsätts för mild ythydrolys. Pâ sama sätt kan karboxylgrupper hos ythydrolyserade polyestrar användas; Uppfinningen framgår närmare i detalj av följande exempel, vilka emellertid inte är begränsande.

'Exempel 1 Nylon-6-ringar med längden 9 mm, innerdiametern 4 mm och ytterdiametern 5 mm framställdes, varvid tillsågs att kanterna blev mjukt rundade. Utmed mitten på ringens utsida gjordes ett 0,25 mm djupt spår över hela omkretsen.

Ringarna hydrolyserades i 3,5 N HCl vid 37° C under l h.

. Genomförandet av ythydrolysen på nylonet bekräftades n? *in blivit tvättade med vatten, dränktes i en lösning inne- _ hållande 0,1 % (vikt-volym) trinitrobensensulfonsyra i - 10 15 20 25 30 '35 448 820 mättat tetraborat.

Efter omkring 1 h bekräftade bildningen av en orange färgning på nylonytan att hydrolysen hade skett. Därefter dränktes ringarna i en 2,5 %-ig glutaraldhydlösning och hölls i denna under 3,5 h vid 40 C. Ringarna tvättades därefter snabbt i isvatten och lades i en 0,01 M fosfat- bufferlösning innehållande 8 mg/ml apyras (specifik akti- vitet 3,4 I.E./mg, med användning av ADP som substrat).

Reaktionen fick fortgå vid 4° C under ett dygn, varefter ringarna tvättades i destillerat vatten och prov utfördes beträffande enzymatisk aktivitet. En ring infördes i 50 ml av en 0,1 M tris' HCl bufferlösning med pH 7,4 innehållande 0,25 mg/ml ADP och 0,5 mg/ml CaCl2.

Blandningen hölls under omröring vid 25° C. 1 ml prov togs ut med intervall på 30 minuter och analyserades för bestämning av oorganiska fosfat enligt den metdd som angivits av Fiske och Subbarrow (C.H.wFiske, Y. Subbarrow:“ J. Biol. Chem. 66, 375 (1925)). En enzymatisk aktivitet på 4,5 umol oorganiska fosfat frigjorda under en reaktions- timme mättes på ringarna.

Nylonringarna med apyrasen bunden kovalent till ytaminogrupperna utsattes för ett "in vivo" biokompati- bilitetsprov genom att ringarna infördes i höftvenen hos hundar av genomsnittlig storlek.

Inoperationen skedde under allmän anestesi och när ringen införts i venen fästes den med en silkestrâd. Såret suturerades och antibiotika administrerades djuret.

För jämförelse inopererades en liknande obehandlad nylonring på samma sätt.

Efter l5 dygn togs ringarna ut och undersöktes.

Ringen med apyras var fullständigt öppen, medan jämförelse- ringen var helt tilltäppt av trombbildning..

Mätning på den från hunden uttagna ringen med apyras visade omkring 4 umol oorganiska fosfat-frigjorda på en timme. _f Exempel 2 _ Nylon-6-ringar liknande dem som beskrivits i exempel 1, tillverkades och dränktes i en 0,01 M fosfatbufferlös-I ning med pH 7 innehållande 8 mg/ml apyras.

Efter 4 h tillsattes dubbla volymen av en 2,5 ä-ig 10 15 20 25 30 'ss 448 820 glutaraldehydlösning i en 0,01 M fosfatbufferlösning vid pH 7.

Blandningen fick reagera vid 4° C under ett dygn, varefter ringarna tvättades och provades på enzymatisk aktivitet pâ samma sätt som vid exempel l.

Den enzymatiska aktiviteten var omkring 2 umol oorganiska fosfat frigjorda på en timma av en enda ring.

Biokompatibilitetsprovet "in vivo" genomfördes genom att ringar med apyras och jämförelseringar inope- rerades på samma sätt som enligt Exempel 1, och togs ut efter 15 dygn.

Ringarna med apyras var öppna och den mätta enzy- matiska aktiviteten motsvarade omkring 2 umol oorganiska fosfat frigjorda på en timme, medan jämförelseringarna var fullständigt igensatta.

Exempel 3 Polyetentereftalatringar liknande dem som beskri- vits i Exempel 1 framställdes. Ringarna hydrolyserades i 1 M Na0H vid 50° C under 5 h. Ringarna tvättades därefter och dränktes i 50 ml av en lösning innehållande 8 mg/ml apyras och 10 mg/ml N-etyl-N'(3-dimetylaminopropylkarbo- diimid) i en 0,1 M fosfatbuffer vid pH 6,8. Reaktionen I genomfördes vid 40 C under natt. Pâ detta sätt bands apyrasen till underlaget genom bildning av en aminobind- ning mellan äs-aminolysingrupper av enzymet och karboxyl- grupperna hos den ythydrolyserade polyestern. Det enzy- matiska aktivitetsprovet på ringarna, som genomfördes på sama sätt i Exempel 1, gav värden på omkring 4 umol oorganiska fosfat frigjorda under timme per ring. Bio- kompatibilitetsprovet "in vivo" genomfördes genom infö- rande av polyesterringar med apyras och obehandlade ringar i höftvenen på experimentdjur på samma sätt som vid före- gående exempel. Efter 15 dygn togs ringarna ut och det vi- sade sig att referensringen var fullständigt tillsatt, medan ringen med apyras var öppen med blott spår av tromb- bildning.

Det enzymatiska aktivitetsprovet på ringen efter ' "in vivo"-provet visade omkring 3 umol oorganiska fosfatf frigjorda på en timme. ä» _ 10 15 20 25 30 448 820 Exempel 4 Polyetentereftalatringar liknande dem som beskrivits i Exempel l framställdes. Apyras bands till dessa ringar genom bryggbildning på samma sätt som vid Exempel 2. Efter immobilisering var den enzymatiska aktiviteten per ring omkring 3 umol inorganiska fosfat frigjorda på en timme.

Biokompatibilitetsprovet "in vivo" på hundar genomfördes på samma sätt som beskrivet i Exempel 1 och gav positiva resultat för ringarna med tvärbindningsbunden apyras, vilka visade sig vara öppna och nästan fullständigt fria från trombbildningar, medan referensringarna var helt tilltäppta. Den kvarvarande enzymatiska aktiviteten hos ringarna var omkring 2,5 umol oorganiska fosfat frigjorda på en timme.

Exempel 5 C 50-stålringar, utförda på samma sätt som de 1 Exempel 1 beskrivna. framställdes och apyras applicerades på en del av dem genom bryggbildning med glutaraldehyd-på samma sätt som beskrivits i Exempel l. Den på varje ring immobiliserade aktiviteten mättes och visade sig vara om- kring 1,5 umol oorganiska fosfat frigjorda på en timme.

Biokompatibilitetsprov in vivo genomfördes på experiment- djur på samma sätt som tidigare beskrivits.

Efter 15 dygn togs ringarna ut och undersöktes.

Referensringarna visade sig vara tilltäppta, medan ringarna med tvärbindningsbunden apyras visade sig vara öppna med blott obetydlig trombbildning på insidan. Den kvarvarande aktiviteten hos de med apyras behandlade ringarna efter provet visade sig vara 0,9 umol oorganiska fosfat fri- gjorda per timme.

Claims (4)

PATENTKRAV

1. ___ Sätt att göra material biokompatibelt, speciellt non-trombogent vilke:t material pa grund av sina mekaniska egenskaper, bearbetning- och hallfasthetsegenskaper och sin frånvaro av giftighet är lâmpat för användning i proteser, implantat eller apparater och delar därav och andra element för användning vid extrakorporell cirkulation, t.ex. dialysapparater eller hjärt- -lung-maskiner, k ä n n e t e c k n a t därav att man immobiliserar apyras pa ett underlag av materialet och att materialet är ett metalliskt eller polymert material, varvid polymeren utgöres av aromatiska polyamider, alifatiska polyamider och polyestrar, vilka är milt hydrolyserade.

2. Sätt enligt krav l, k 'a' n n e t e c k n a t därav att apyras immobi- liseras pa ett underlag av polyetentereftalat.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav att apyras immobiliseras på underlaget medelst ett adorptions- eller bryggbildnlngsför- farande.

4. Sätt enligt krav 1 eller 2, k å n n e t e c k n a t därav att apyras immobiliseras på underlaget genom bildning av en kovalent bindning mellan apyras och funktionella grupper pa underlagets yta. i.,