CN114522278A - 一种长效抗凝血涂层及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗凝血涂层，包括器械材料、白蛋白层和抗凝血材料层，该抗凝血涂层具有长期抗凝血效果。

Description

一种长效抗凝血涂层及其制备方法

技术领域

本申请涉及医用生物材料领域，特别是涉及一种与血液接触的医疗器械表面的抗凝血处理的涂层及其制备方法。

背景技术

临床上与血液接触的医疗器械产品在使用时容易激发凝血机制并形成血栓。血液接触器械表面后，血小板和纤维蛋白原会黏附在器械表面，形成血栓。血栓容易随血液进入人体并阻塞血管，导致严重的疾病甚至致死。因此，血栓的形成严重影响器械使用的安全性，与血液长时间接触的医疗器械表面的抗凝血处理是非常有必要的。

目前临床上通常使用注射抗凝剂的方式来预防器械表面的血栓形成。然而抗凝剂的使用剂量过大可能会造成系统性的出血并发症。可见，抗凝血功能的涂层对于长期使用的血液接触医疗器械是非常重要的。以体外膜肺氧合(ECMO)为例，进行ECMO治疗的病人需要借助血泵和氧合器代替心脏和肺的功能，血液与血泵及氧合器、循环管路不仅接触面积大，而且接触时间长，如果不对器械表面进行抗凝处理，治疗过程中仅依靠注射抗凝药物非常容易产生血栓。

目前已有的抗凝血涂层，主要采用肝素作为抗凝因子，将肝素通过物理吸附或者化学结合的方法固定在材料表面。采用物理吸附的方法，肝素容易流失，抗凝血效果不长；将肝素通过共价键与聚合物结合，聚合物存在生物相容性的问题。目前还没有一种具有长期抗凝血效果的生物涂层。

发明内容

发明要解决的问题

为了解决上述现有技术问题，本申请提供一种具有长期抗凝血效果的生物涂层，以及改进的涂层制备方法。

用于解决问题的方案

一方面，本申请提供一种凝血涂层，包括器械材料、白蛋白层和抗凝血材料层。

另一方面，本申请提供一种抗凝血涂层的制备方法，其包括以下步骤：

1)配制含有白蛋白的缓冲液；

2)器械材料浸泡在步骤1)配制的白蛋白缓冲液中，调整溶液pH和/或温度；

3)配制含有抗凝血材料缓冲液，并加入缩合剂；

4)将步骤2)处理的器械材料浸泡在步骤3)抗凝血材料缓冲液中反应；

5)反应后清洗，干燥，得到具有抗凝血涂层的器械材料；

本申请的有益效果：

(1)通过调整缓冲液pH或温度，使得白蛋白构型改变，疏水基团暴露，促进蛋白表面更多的吸附和更不可逆的吸附，进而得到均匀的、牢固的以白蛋白为基底的涂层；

(2)优化的抗凝血涂层制备步骤，通过将器械材料先后浸泡于含有白蛋白的缓冲液、含有缩合剂和肝素钠的缓冲液，得到酰胺键结合的白蛋白-肝素抗凝血涂层，该制备工艺快速简便，适合工业化生产，所得到的白蛋白-肝素抗凝血涂层可以解决抗凝血涂层牢固度差及生物相容性不好的问题。

具体实施方式

为使本申请的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。

具体而言，本申请一方面提供一种抗凝血涂层，包括器械材料、白蛋白层和抗凝血材料层，其中器械材料与白蛋白层直接接触，抗凝血材料层与白蛋白层通过化学键结合。

在一些实施方案中，所述抗凝血材料选自肝素、水蛭素、硫酸葡聚糖。

在一些实施方案中，所述抗凝血材料与白蛋白通过化学键结合，例如酰胺键。

另一方面，本申请提供一种抗凝血涂层的制备方法，其包括以下步骤：

1)配制含有白蛋白的缓冲液；

2)器械材料浸泡在步骤1)配制的白蛋白缓冲液中，调整溶液pH和/或温度；

3)配制含有抗凝血材料缓冲液，并加入缩合剂；

4)将步骤2)处理的器械材料浸泡在步骤3)抗凝血材料缓冲液中反应；

5)反应后清洗，干燥，得到具有抗凝血涂层的器械材料。

在一些实施方案中，所述步骤1)白蛋白缓冲液pH为6-10，优选pH为7-9。

在一些实施方案中，所述步骤1)白蛋白缓冲液中白蛋白浓度为1-200mg/ml，优选50-150mg/ml。

在一些实施方案中，所述步骤1)白蛋白缓冲液为含有白蛋白的TBS缓冲液，含有白蛋白的Tris缓冲液，或含有白蛋白的PBS缓冲液。

在一些实施方案中，所述步骤2)调整溶液pH至2-10，优选溶液pH 4-8。

在一些实施方案中，所述步骤2)调整温度为20-100℃，优选温度为30-50℃。

在一些实施方案中，所述步骤3)抗凝血材料选自肝素、水蛭素、硫酸葡聚糖，优选为肝素。

在一些实施方案中，所述步骤3)含有抗凝血材料缓冲液选自含有抗凝血材料2-吗啉乙磺酸缓冲液，或含有抗凝血材料Tris缓冲液。

在一些实施方案中，所述步骤3)含有抗凝血材料缓冲液pH为1-7，优选pH为3-7。

在一些实施方案中，所述步骤3)缩合剂选自DCC，DIC，EDCI，BOP，NHS，EDC，4-ppy或其组合，可选的，所述缩合剂可以加入酰化催化剂或活化剂，例如DMAP、HOBt。

在一些实施方案中，所述步骤4)反应温度为0-45℃，优选为30-40℃。

在一些实施方案中，所述步骤4)反应时间为0.1-24h，优选为5-60min。

在一些实施方案中，本申请抗凝血涂层的制备方法包括以下步骤：

1)配制含有白蛋白的缓冲液，其中白蛋白浓度为1-200mg/ml，缓冲液pH为6-10；

2)器械材料浸泡在步骤1)配制的白蛋白缓冲液中，调整溶液pH为2-10，调整温度为20-100℃；

3)配制含有抗凝血材料缓冲液，并加入缩合剂；所述缓冲液pH为1-7；

4)将步骤2)处理的器械材料浸泡在步骤3)抗凝血材料缓冲液中反应；所述反应时间为0.1-24h，所述反应温度为0-45℃；

5)反应后清洗，干燥，得到具有抗凝血涂层的器械材料。

优选的，步骤1)白蛋白浓度为50-150mg/ml；

优选的，步骤1)白蛋白缓冲液为含有白蛋白的TBS缓冲液，含有白蛋白的Tris缓冲液，或含有白蛋白的PBS缓冲液；

优选的，步骤1)缓冲液pH为7-9；

优选的，步骤2)调整溶液pH至4-8；

优选的，步骤2)调整溶液温度至30-50℃；

优选的，步骤3)含有抗凝血材料缓冲液是指含有抗凝血材料2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，或含有抗凝血材料Tris缓冲溶液；

优选的，步骤3)缓冲液pH为3-7；

优选的，步骤3)缩合剂选自DCC，DIC，EDCI，BOP，NHS，EDC，4-ppy或其组合，可选的，所述缩合剂可以加入酰化催化剂或活化剂，例如DMAP、HOBt。

优选的，步骤4)反应温度为30-40℃；

优选的，步骤4)反应时间为5-60min。

在一个优选的实施方案中，本申请抗凝血涂层的制备方法包括以下步骤：

1)配制含有白蛋白的缓冲液，其中白蛋白浓度为50-150mg/ml，缓冲液pH为7-9；所述缓冲液选自TBS缓冲液，Tris缓冲液，或PBS缓冲液；

2)器械材料浸泡在步骤1)配制的白蛋白缓冲液中，调整溶液pH为7.4，调整温度为37.5℃，反应0.1h～10h取出，用去离子水清洗，干燥；

3)配制含有抗凝血材料缓冲液，并加入缩合剂；所述缓冲液为2-吗啉乙磺酸缓冲溶液；所述缓冲液pH为3-7；所述缩合剂选自DCC，DIC，EDCI，BOP，NHS，EDC，4-ppy或其组合，可选的，所述缩合剂可以加入酰化催化剂或活化剂，例如DMAP、HOBt；

4)将步骤2)处理的器械材料浸泡在步骤3)抗凝血材料缓冲液中反应；所述反应时间为10min；

5)反应后清洗，干燥，得到具有抗凝血涂层的器械材料。

本申请所述器械材料，是指任何直接与动物或人血液接触的器械材料，包括但不限于植入或介入动物体或人体的支架，导管，导丝，或ECMO的氧合器、血泵、循环管路等。

实施例1：一种抗凝血功能的蛋白-肝素涂层制备

将牛血清白蛋白溶于10mM的pH 9的TBS缓冲液中，牛血清白蛋白的浓度为100mg/mL；

调整溶液pH为7.4，将溶液升温至37.5℃保持10min；

将待涂层的材料浸泡在白蛋白溶液中10min，将样品冲洗干净，待用；

将白蛋白溶液浸泡过的样品浸泡在含有EDC/NHS的肝素钠溶液中10min，将样品冲洗干净，干燥后即得到带有抗凝血涂层的样品。

实施例2：一种抗凝血功能的蛋白-肝素涂层制备

将牛血清白蛋白溶于10mM的pH 7.4的Tris缓冲液中，牛血清白蛋白的浓度为100mg/mL；

将溶液升温至37.5℃保持10min；

将待涂层的材料浸泡在白蛋白溶液中10min，将样品冲洗干净，待用；

将白蛋白溶液浸泡过的样品浸泡在含有EDC/NHS的肝素钠溶液中10min，将样品冲洗干净，干燥后即得到带有抗凝血涂层的样品。

实施例3：一种抗凝血功能的蛋白-肝素涂层制备

将牛血清白蛋白溶于10mM的pH7.4的PBS缓冲液中，牛血清白蛋白的浓度为100mg/mL；

将溶液升温至37.5℃保持10min；

将待涂层的材料浸泡在白蛋白溶液中10min，将样品冲洗干净，待用；

将白蛋白溶液浸泡过的样品浸泡在含有EDC/NHS的肝素钠溶液中10min，将样品冲洗干净，干燥后即得到带有抗凝血涂层的样品。

实施例4：抗血小板黏附实验

将血液离心后得到含有血小板的血浆PRP(富血小板血浆)，以未处理的聚氯乙烯管材作为对照，将实施例1制得的样品和对照样品浸没在PRP中，37℃，2小时。然后用生理盐水漂洗样品，然后用戊二醛固定，再用乙醇/水梯度脱水，最后用电子扫描显微镜观察血小板在管材内表面的黏附情况。根据检测结果可知，将未经处理的聚氯乙烯管材浸没至血浆PRP 2h后，其表面会黏附有大量的血小板；而本申请制备得到的样品表面则几乎是没有血小板黏附，由此可以看出本申请制备得到的产品具有优异的抗血小板黏附功效。

实施例5：涂层牢固度实验

材料表面涂覆抗凝血涂层后，由于材料表面基团的变化，水接触角会发生一定的变化。将实施例1制备的样品和未涂层的样品进行水接触角的测试，然后将实施例1制备的样品放在超声波清洗机中超声10min，再次进行接触角测试，检测结果显示，涂层后材料表面接触角发生了变化，说明涂层成功涂覆在材料上；超声清洗前后接触无明显变化，说明本申请制备得到的产品具有优异的牢固度，能够避免血液冲刷造成涂层脱落的风险。

实施例6：动物实验

根据本申请制备抗凝血涂层的方法，在氧合器、血泵、循环管路等产品表面进行涂层，灭菌后在健康的12个月大的猪身上进行为期6天的动物实验。实验发现，带涂层的产品表面几乎无血栓形成，说明本申请制备得到的产品具有优异的抗凝血的作用。

应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (10)

1.一种抗凝血涂层的制备方法，其包括以下步骤：

1)配制含有白蛋白的缓冲液；

2)器械材料浸泡在步骤1)配制的白蛋白缓冲液中，调整溶液pH和/或温度；

3)配制含有抗凝血材料缓冲液，并加入缩合剂；

4)将步骤2)处理的器械材料浸泡在步骤3)抗凝血材料缓冲液中反应；

5)反应后清洗，干燥，得到具有抗凝血涂层的器械材料；

所述步骤2)调整溶液pH至2-10；

所述步骤2)调整温度为20-100℃。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗凝血材料选自肝素、水蛭素、硫酸葡聚糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)蛋白缓冲液具有任选的以下一个或多个特性：

a)白蛋白缓冲液pH为6-10，优选pH为7-9；

b)白蛋白浓度为1-200mg/ml，优选50-150mg/ml；和/或

c)白蛋白缓冲液为含有白蛋白的TBS缓冲液，含有白蛋白的Tris缓冲液，或含有白蛋白的PBS缓冲液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)缓冲液选自2-吗啉乙磺酸缓冲液，或Tris缓冲液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)缓冲液pH为1-7。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)缩合剂选自DCC，DIC，EDCI，BOP，NHS，EDC，4-ppy或其组合，可选的，所述缩合剂可以加入酰化催化剂或活化剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)反应温度为0-45℃，反应时间为0.1-24h。

8.根据权利要求1-7任意一项制备方法得到的抗凝血涂层。

9.一种抗凝血涂层，其特征在于，包括器械材料、白蛋白层和抗凝血材料层，其中器械材料与白蛋白层直接接触，抗凝血材料层与白蛋白层通过化学键结合。

10.根据权利要求9所述的抗凝血涂层，其特征在于，所述抗凝血材料选自肝素、水蛭素、硫酸葡聚糖，所述抗凝血材料层与白蛋白层通过酰胺键结合。