FI75737B - Foerfarande foer framstaellning av icketrombogenisk apyras baerande protesplastmaterial och produkter erhaollna daerav. - Google Patents

Description

1 75737

Menetelmä ei-trombogeenisen apyraasia kantavan pro-teesimuovimateriaalin valmistamiseksi ja menetelmän avulla valmistetut tuotteet Förfarande för framställning av icketrombogenisk 5 apyras bärande protesplastmaterial och produkter er- hällna därav

Keksinnön kohteena on menetelmä ei-trombogeenisen apyraasia kantavan proteesimuovimateriaalin valmistamiseksi.

10 Keksinnön kohteena ovat myös tuotteet, jotka on valmistettu tätä menetelmää soveltaen.

Mahdollisuus antaa biosopeutuvia ominaisuuksia erityyppisille materiaaleille on nykyään käytännössä erittäin tärkeää. On olemassa materiaaleja, joita hyvien mekaanisten 15 työstö- ja lujuusominaisuuksiensa ansiosta ja myrkyttömyy-tensä takia voitaisiin välittömästi käyttää proteeseja valmistettaessa keskipitkää tai pitkää käyttöä varten implan-taatio- eli siirretarkoituksiin, tai konstruoitaessa elementtejä apukoneita varten, joita käytetään kehon ulkopuolella 20 tapahtuvaa kiertoa varten, esim. munuaisten dialyysilaitteis-sa tai sydän-keuhkokoneissa.

Tähän tarkoitukseen voitaisiin käyttää materiaaleja, jotka hyvin laajoissa rajoissa kuuluvat alifaattisen tai poly-amidi-polymeraattien, polyestereiden, polykarbonaattien, po-25 lyuretaanien ja polyvinyylikloridien sekä erikoisten metal- 1ilejeerinkien joukkoon. Näiden materiaalien käyttöä rajoittaa kuitenkin valitettavasti niiden yleensä huono biosopeutu-vuus. Näin on asianlaita, koska heti kun vierasta materiaalia sijoitetaan verenkiertoon, aiheuttaa tämä materiaali välit-30 tömästi tukosten muodostumista käynnistämällä erittäin monimutkaisen prosessin. Luullaan, että ensin tapahtuu verihiutaleiden kiinnitarttumista vieraan materiaalin pintaan, minkä seurauksena verihiutaleissa vapautuu adenosiinifosfaattia (ADP) ja seorotiinia, mikä puolestaan aiheuttaa verihiutaleiden ka-35 sautumista. Tämä verihiutaleiden kasautuminen on puolestaan tukosten muodostumisen perusvaihe, koska se aiheuttaa fosfoli-pidien vapautumista. Nämä fosfolipidit ovat oleellisia veren 2 75737 hyytymisprosessissa, koska ne edistävät fibrinogeenin muuttumista fibriiniksi. ADP:n vaikutus verihiutaleiden kasautumisen aiheuttajana ja täten tukosten muodostumisprosessin käynnistäjänä on yleisesti tunnettu, kts. esim. perusteosta, jon-2 ka ovat laatineet A. Gaarder ja A. Helien julkaisussa Nature 192, 531, (1961). On näin ollen ilmeistä, että sellaisen entsyymin kuten apyraasin sitominen sellaisen materiaalin pintaan, joka saatetaan kosketukseen veren kanssa, voi estää verihiutaleiden kasautumisen ja täten tukosten muodostumisen. 10 Tällainen entsyymi on apyraasi, joka kykenee muuttamaan adeno-siinimonofosfaatiksi (AMP) ja adenosiiniksi sen adenosiinidi-fosfaatin (ADP), joka kehittyy verihiutaleiden tarttuessa tällaisen materiaalin pintaan. Tässä yhteydessä on todettu, että apyraasin sitominen trombogeenisten materiaalien pintaan an-15 taa näille materiaaleille tyydyttäviä biosopeutuvia ominaisuuksia, ja tämä onkin keksinnön kohteena.

Keksintö tunnetaan siitä, että hydrolysoidaan muovi-materiaalin pinta, joka on joko polyamidipolymeeria tai poly-etyleenitereftalaattipblymeeria, käsitellään hydrolysoitua 20 muovikanninta upottamalla se puskuroituun liuokseen ristisil-loitusväliainetta, joka on glutaraldehydi tai N-etyyli-N'-(3 -dimetyy1iaminopropyy1i)karbodi-imi di, ja puskuroituun apy-raasiliuokseen, ja antamalla muovimateriaa1ikantimen olla upotettuna tarpeeksi kauan, jotta sen pintaan sitoutuu kovalent-25 tisesti apyraasia.

Ominaisuudet eivät riipu järjestelmästä, jota käytetään entsyymin sitomiseen. Tämä voidaan tehdä absorboimalla ja sitten ristisilloittamalla entsyymi polymeraattimateriaalien pintaan.

Vaihtoehtoisesti voidaan apyraasi sitoa kovalenttises-ti niiden biosopeutuudeltaan parannettavien materiaalien pinnassa oleviin funktionaalisiin ryhmiin. On itse asiassa tarpeen vaatiessa mahdollista ennalta aktivoida tällainen materiaali apyraasin sitomiseksi sopivien reaktiivisten ryhmien va-25 pauttamiseksi materiaalin pintaan.

Niinpä entsyymi voidaan liittää kovalenttisesti lievän pinnallisen hydrolyysin kohteena olleiden alifaattisten tai aromaattisten polyamidien amino (tai karboksyyli-) ryhmiin.

n 3 75737

Seuraav/at esimerkit kuvaavat yksityiskohtaisesti keksintöä, mutta eivät silti rajoita tätä:

Esimerkki 1

Valmistettiin renkaita nylonista 6 (pituus 9 mm, si-5 sähalkaisija 4 mm, ulkohalkaisija 5 mm), jolloin koneistuksen yhteydessä renkaiden reunat huolellisesti viistotettiin ja pyöristettiin. Renkaan ulkosivun keskustaa pitkin tehtiin koko renkaan ympäröivä 0,25 mm syvä ura.

Renkaat hydrolysoitiin 3,5 N suolahapossa tunnin ajan 10 37 °C:ssa. Nylonin pinnan hydrolysoituminen todistettiin kolorimetrisella kokeella, jossa vedellä pestyt renkaat upotettiin liuokseen, jossa oli 0,1¾ (paino-tilavuus) trinitro-bentseenisulfonihappoa kyllästetyssä tetraboraatissa.

Noin tunnin kuluttua esiintyi nylonin pinnassa orans-15 sin väriä osoituksena siitä, että hydrolyysiä oli tapahtunut. Tässä vaiheessa renkaat upotettiin 2,5-prosenttiseen glutar-aldehydiliuokseen ja pidettiin upotettuina 3,5 tuntia 4 °C:ssa. Tämän jälkeen renkaat pestiin nopeasti jäävedessä ja upotettiin 0,01 M fosfaa11ipuskuri liuokseen, jossa oli 8 mg/ml apy-20 raasia (ominaisaktiviteetti 3,4 U.l./mg, käyttämällä substraattina ADP:a). Reaktion annettiin edistyä 4 °C:ssa vuorokauden ajan. Reaktion päättyessä renkaat pestiin tislatussa vedessä ja kokeiltiin niiden entsymaattinen aktiviteetti. Renkaat upotettiin 50 ml:aan 0,1 M tris-HCl-puskuriliuokseen, 25 jonka pH = 7,4, ja jossa oli 0,25 mg/ml ADP:a ja 0,5 mg/ml CaC^^a. Seosta sekoitettiin 25 °C:ssa. Poistettiin 30 minuutin välein 1 ml:n näytteitä, jotka analysoitiin epäorgaanisten fosfaattien määrittämiseksi soveltamalla menetelmää, jonka ovat esittäneet Fiske ja Subbarrow (C.H. Fiske; 30 Y. Subbarrow; J. Biol. Chem. 66, 375 (1925)). Renkaista mitattiin tunnin reaktion seurauksena vapautunut epäorgaanisten fosfaattien 4,5 ^umoolin suuruinen entsymaattinen aktiviteetti .

Nylonrenkailla, joiden pinnan aminoryhmiin oli kova-35 lenttisesti sitoutunut apyraasia, suoritettiin "in vivo" biosopeutuvuuskoe sijoittamalla renkaat keskikokoisten koirien reisilaskimoon. Renkaat sijoitettiin täysnukutusta käyttäen ja laskimoon sijoitettu rengas kiinnitettiin pai- 4 75737 kalleen silkkilangan av/ulla. Haava ommeltiin ja eläimelle annettiin antibiootteja. Samanlainen käsittelemätön nylon-rengas sijoitettiin koe-eläimeen vertailun vuoksi samaa mene-temää soveltaen.

5 Oltuaan paikallaan koe-eläimessä 15 vuorokautta ren kaat poistettiin ja tutkittiin. Apyraasilla käsitelty rengas todettiin läpipäästäväksi, kun taas tukokset olivat täydellisesti sulkeneet vertailurenkaan. Mittaus, joka tehtiin koirasta poistetulla renkaalla, jota oli käsitelty apyraa-10 silla osoitti, että oli vapautunut noin ^umoolia epäorgaanisia fosfaatteja tunnin kuluessa.

Esimerkki 2

Valmistettiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla samanlaisia renkaita nylonista 6, ja nämä renkaat upotettiin 0,01 M 15 fosfaattipuskuriliuokseen, jonka pH = 7, ja jossa oli 8 mg/ml apyraasia. Neljän tunnin kuluttua lisättiin kaksinkertainen tilavuus 2,5-prosenttista glutaraldehydiliuosta 0,01 M fosfaat-tipuskuriliuoksessa, pH = 7.

Seoksffi annettiin reagoida vuorokauden 4 ^C:ssa, min-20 kä jälkeen renkaat pestiin ja niiden entsymaattinen aktiviteetti kokeiltiin soveltamalla esimerkissä 1 selitettyä menetelmää. Entsymaattisen d<tiviteetin todettiin olevan noin 2 yumoolia epäorgaanisia fosfaatteja, jotka yksi rengas oli vapauttanut tunnin kuluessa. "In vivo" biosopeutuvuuskoe 25 suoritettiin sijoittamalla apyraasilla käsiteltyjä renkaita ja vertailurenkaita keskikokoisten koirien reisilaskimoon esimerkissä 1 esitettyä menetelmää soveltaen. Renkaiden oltua paikallaan 15 vuorokautta ne poistettiin. Apyraasilla käsitelty rengas todettiin läpipäästäväksi, ja mitattu ent-30 symaattinen aktiviteetti vastasi noin 2 ^umoolia epäorgaani-si fosfaatteja, jotka olivat vapautuneet tunnin kuluessa. Vertausrenkaat todettiin sen sijaan täydellisesti sulkeutuneiksi.

Esimerkki 3 35 Valmistettiin esimerkin 1 mukaisia renkaita polyetylee- nitereftalaatista. Renkaat hydrolysoitiin 1 M NaOH-liuok-sessa 5 tuntia 50 °C:ssa, minkä jälkeen lenkaat pestiin ja upotettiin 50 ml:aan liuosta, jossa oli 8 mg/ml apyraasia 11 5 75737 ja 10 mg/ml N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidiä) 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH = 6,8. Reaktio suoritettiin 4 °C:ssa yhden yön kuluessa. Tällä tavoin apyraasi saatettiin sitoutumaan alustaan siten, että muodostui entsyy-5 min ^ -aminolysiiniryhmien ja pinnallisesti hydrolysoituneen polyesterin karboksyyliryhmien välinen amidosidos. Renkaiden entsymaattinen aktiviteetti kokeiltiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla, jolloin todettiin noin 4 ^umoolia epäorgaanisia fosfaatteja vapautuneen tunnin kuluessa rengasta 10 kohden. "In vivo" biosopeutuvuuskoe suoritettiin sijoittamalla koe-koirien reisilaskimoon polyesterirenkaita, joita oli käsitelty apyraasilla sekä käsittelemättömiä polyesteri-renkaita esimerkissä 1 selitettyä menetelmää soveltaen. Oltuaan 15 vuorokautta paikalleen sijoitettuna-'renkaat poistet-15 ttiin. Vertailurengas oli täysin sulkeutunut, kun taas apyraasilla käsitelty rengas oli läpipäästävä ja siinä esiintyi ainoastaan paikallisia tuloksia.

"In vivo" kokeen jälkeen renkaalla suoritettu entsy-maattisen aktiviteetin määritys osoitti noin 3 ^umoolin epä-20 orgaanisia fosfaatteja vapautuneen tunnin aikana.

Esimerkki 4

Valmistettiin esimerkin 1 mukaisia renkaita polyety-leenitereftalaatista. Apyraasia saatettiin ristisilloittu-maan näihin renkaisiin soveltamalla esimerkin 2 mukaista 25 menetelmää. Apyraasin tultua sidotuksi todettiin yhden renkaan entsymaattisesksi aktiviteetiksi noin 3 ^umoolia tunnin aikana vapautuneita epäorgaanisia fosfaatteja. Esimerkissä 1 selitetyllä tavalla koirilla suoritettu "in vivo" -biosopeutuvuuskoe antoi positiivisia tuloksia renkailla, joihin oli 30 ristisilloitettu apyraasia, ja jotka todettiin läpipäästäviksi ja melkein täysin vapaiksi tuloksista, kun taas vertailuren-kaat todettiin sulkeutuneiksi. Renkaiden entsymaattinen jäännösaktiviteetti oli noin 2,5 ^umoolia tunnin aikana vapautuneita epäorgaanisia fosfaatteja.

35

Claims (4)

6 75737

1. Menetelmä ei-trombogeenisen apyraasia kantavan proteesimuovimateriaalin valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että hydrolysoidaan muovimateriaalin pinta, joka on joko polyamidipolymeeria tai polyetyleeniterafta- 5 laattipolymeeria, käsitellään hydrolysoitua muovikanninta upottamalla se puskuroituun liuokseen ristisilloitusväli-ainetta, joka on glutaraldehydi tai N-etyy1i-N'-(3-dimetyyli aminopropyy1i)karbodi-imidi, ja puskuroituun apyraasi-liuokseen, ja antamalla muovimateriaalikantimen olla upo-10 tettuna tarpeeksi kauan, jotta sen pintaan sitoutuu kova-lenttisesti apyraasia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetlmä, tunnettu siitä, että muovimateriaalikannin on polyamidi ja mainittu hydrolyysi on hapan hydrolyysi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että muovimateriaalikannin on polyetylee-nitereftalaatti, hydrolyysi on emäksinen hydrolyysi ja risti si 1 loi tusl iuos on puskuroitu N-etyyli-N'-(dietyyliamino-propyyli)karbodi-imidiliuos, joka yhdistetään apyraasipus-20 kuriliuokseen ennen hydrolysoidun muovimateriaalin upottamista siihen.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän mukaisesti valmistetut ei-trombogeenisesti apyraasia kantavat proteesimuovimateriaaliesineet, tunnettu siitä, 25 että ne ovat muovimateriaalia, joka on polyamidia tai polyetyleenitereftalaattia, jolloin mainittu apyraasi onko-valenttisesti ja pysyvästi sitoutunut niiden pintaan. 30 II