JPH04503311A - 血栓抑制性の生体適合性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血栓抑制性の生体適合性物質 免豆立１１ この発明の技術分野はプロテーゼ（補綴）血管材料であり、特に、生体適合性の 血栓抑制性（ｔｈｒｏａ＋ｂｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の血管物質及びそれら の製造方法である。

血液を人工表面にさらすと、普通、内因性の凝固システムの活性化を伴う粘着性 血小板の層の沈着を導き、遂には血栓を生じる。事実、プロテーゼ動脈移植片を 一回通すだけで重大な血液−物質相互作用が起こり得る。最初に人工表面に吸着 又は結合される血液蛋白質の型は接触凝固に関係する蛋白質を含むであろう、接 触凝固又は外因性経路の凝固は、フィブリン形成、血小板及び補体の活性化、走 化性、キニン生成及び繊維素溶解性成分の活性化を導く生化学的事象の複雑な経 路である。更に、これらの各事象は、しばしば正又は負のフィードバックループ により制御される後続の生化学経路を増大させる。従って、人工物質との接触に より導かれる血栓症は人工の血管及び臓器などの体内人工器官（１ｎｔｅｒｎａ ｌｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）及び体外装置の開発及び利用の主要な障害である。

血栓抑制性の程度が異なる材料が血管プロテーゼに利用されたが、限定的にしか 成功していない、これらの材料は、腐食性（自己清浄性）金属、ポリジメチルシ ロキサン、テフロン、アクリレート、及びメタクリレート（ダクロン、エレクト レット、アニオン共重合体及びヒドロゲル）などの合成ポリマーを含む（総説と しては、Ｓａｌｚｍａｎら　（１９８７）　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔ ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｒ＋ Ｌｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（Ｃｏ１ｍａｎら編）Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏ ｔｔ　Ｃｏ、、Ｐｈｆｌａ、、ＰＡ　１３３５−１３４７頁を見よ）。

長期にわたるこのような人工材料との接触による血栓症の機会を減らすために、 患者は抗凝固、抗血小板及び繊維素分解性の薬剤の全身投与により治療された。

これらは、プロスタサイクリン合成に影響を与えずにトロンボキサン合成を選択 的に阻害し、血小板の粘着性並びに凝集及び遊離に影響を与え、血管のＰＣｌ、 産生を増大し、そして／又はトロンビン及びトロンボキサン媒介性の血小板凝集 の両者を阻害する任意の化合物を含む。そのような化合物はアスピリン、スルフ ィンピラゾン、ジビリダモール、チクロピジン及びスロクチジンを含む。

しかしながら、これらの薬剤での治療はしばしば、全身の出血及び身体の至る所 で必要な凝固を開始し完成することができな（成ることを含む好ましくない副作 用を引き起こす。

この人工材料の血栓抑制性を改良するために、血栓崩壊性、抗凝血性、血栓形成 阻害性及び／又は血小板阻害性を有する生物的に活性な分子がそれらと結合され た。

例えば、ヘパリンは様々な内因性凝固システムの阻害物質の活性化によって凝固 を軽減するために人工表面に結合された（　Ｓａｌｚｍａｎら（１９８７）　Ｈ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ＴｈｒｏＩ！１ｂｏｓｉｓ　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ ｎｃｉ　Ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ第２版（Ｃｏ１ ｍａｎら！りＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、Ｐｈ１ｌａ、、ＰＡ　１３３５− １３４７　頁）　。

しかしながら、ヘパリンは、血小板のＡＤＰ又はコラーゲンなどの刺激に対する 応答を増大し、人工表面に対する２つの有害な初期血液応答：血小板の付着及び 凝集を促進する。更に、たとえ表面結合したヘパリン／抗トロンビン複合体が血 小板に対して作用しないとしても、内皮細胞成長因子との相互作用、平滑筋増殖 の阻害及びリボ蛋白質リパーゼの活性化に対する非常に多様な影響が長期間の内 に有害な影響を導くかも知れないので、疑問を生じさせる。

ＰＧＥ、、ＰＧＩａ　（実験用の使用のみ）、環状ＡＭＰ及びアスピリンなどの 抗血小板物質も又固体ポリマー表面に付着された。これらの物質は、血管移植片 の近くでの有害な治癒応答を刺激する血小板因子の遊離を止めさせる。それらは 血小板補助による血栓形成をも、血小板付着の阻害により軽減する。

多（の人工表面を血管と接触させる前にアルブミンにさらすとその結果、血小板 との反応性が減少した（ＮＩＨ発表Ｎｏ、８５−２１８５．１９８５年９月、ｌ ９−６３頁）。それ故、アルブミンは、心肺バイパス外科手術の前に体外の表面 を被覆するために用いられた。しかしながら、長期間の血栓抑制性は、この処置 では達成されていない。

繊維素溶解活性を有するストレプトキナーゼ及びウロキナーゼが、ＫｕＳＳｅｒ ＱＷらにより、単独で又はヘパリンと組み合わせて人工物表面に付着された（Ｔ ｒａｎｓ。

Ａｍ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎ（１９７１）１７：ｌ　 ）　ｏこれらの酵素は過度のフィブリン沈着及び／又は血栓症による閉塞を軽減 する。しかしながら、それらの人工表面に血栓抑制性を与える能力の長期間にお ける評価は決定していない。　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８などの界面活性剤も 又人工物表面に固定されたが、長期間の血液適合性を提供することはないようで ある（Ｓａｌｙｅｒら、　（１９７１）ＭｅｄｉｃａｌＡ　１ｉｃａｔｉｏｎｓ 　ｏｆ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ、Ｂｉｏａ＋ｅｄ、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｒｅｓ、Ｓ ｙｍ、　（Ｇｒｅｇｏｒ、　４Ｉ　）Ｎｏ、　１．１０５頁）。

それ故、必要なものは、長期間にわたって血栓抑制性であり、その活性成分が有 害な副作用を起こさない、より良い生体適合性の材料である。

この発明の目的は、体液と接触する移植可能な及び体外の装置にとって有用な合 成の生体適合性の血栓抑制性の材料を提供することである。

他の目的は、生物的に活性な固定化された血栓形成阻害物質及びその製造方法を 提供することである。

この発明の更に別の目的は、移植片又はプロテーゼと血液の界面の限局された部 位における血小板凝集、血小板因子の遊離及び血栓形成を阻害する方法を提供し 、それにより抗血小板及び抗血栓症薬剤の全身的な影響を避けることである。

免豆立ｌ互 血液と接触する移植可能な又は体外の装置の構成要素として有用な生体適合性の 血栓抑制性の物質を供給するための材料と方法がここに開示される。

合成の生体適合性の材料が、基底被膜層としてヒルディン（ｈｉｒｕｄｉｎ　） 又はその活性なアナログ又はフラグメント以外の血栓形成阻害物質をそれに固定 化することにより血栓抑制性の物質に成り得、そのような方法によってその血栓 形成阻害活性は弱まることはないということが発見された。　“血栓形成阻害物 質”　（ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ）という用語は、 ここでは、血栓の形成を邪魔するか又は阻害する分子を記述するために用いられ る。そのような分子は、内因性及び外因性のシステム、血小板の付着、凝集又は 因子放出又は活性化、並びに組織因子の遊離又は活性化を邪魔もしくは阻害する ものを含む。血栓の形成を邪魔及び阻害できる合成又は組換え蛋白質又はそれら の活性なアナログ、フラグメント、誘導体又は融合産物、及びそれらの混合物が 含まれる。特に有用な血栓形成阻害物質は自然状態において膜結合性の蛋白質（ 例えば、トロンボモジュリン（ＴＭ）　、アデノシントリホスファターゼ（ＡＴ Ｐアーゼ）、アデノシンジホスファターゼ（ＡＤＰアーゼ）及び３°−ヌクレオ チダーゼ）及び普通イン・ビボで可溶性のもの（例えば組織プラスミノーゲンア クチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）及びストレプトキナーゼ（ＳＫ ））を含む、しかしながら、他の血栓形成阻害物質の活性を阻害又は邪魔する分 子も又有用である。

この発明により意図された合成材料は、好ましくは、ポリエチレンテレフタレー ト（即ち、ダクロン又はアミラー）、ナイロン、ポリウレタン、架橋されたコラ ーゲン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸及びそれらの混合物な どの高分子材料が良く、最も好ましい高分子材料は織られたポリエチレンテレフ タレートである。他の合成材料も又用いられ得るであろう。

この発明に従って、血栓形成阻害物質は、合成材料の少なくとも一つの表面に付 着する基底被膜層を介して合成材料上に固定される。基底被膜層は、血栓形成阻 害物質とその阻害物質の生物活性を弱めることな（結合し得る成分を含む、その ような血栓形成阻害物質結合性の基底被膜成分の例は、蛋白質、ペプチド、リボ 蛋白質、糖蛋白質、グリコサミノグリカン、ヒドロゲル、合成ポリマー及びそれ らの混合物を含む。この発明の好ましい面において、基底被膜層は、血清アルブ ミン、フィブロネクチン又はこれらの蛋白質の混合物、及び特にヒト血清アルブ ミン又はヒトフィブロネクチンなどの蛋白質成分を含む。

この発明の好ましい面において、合成材料は、それに付着する基底被膜層を得る 前に、その基底被膜層への結合性を強めるために活性化される。この発明の横範 的な面において、合成材料は、その材料中にあって二官能性の架橋剤（例えば、 カルボジイミド）と結合性の少なくとも一つの化学的に活性な基（例えば、カル ボン酸基）を利用可能にする溶液と接触させられる。こうして処理された材料は 、それから、架橋剤を含む溶液に、化学的に活性な基がその試薬に結合できるだ け十分な時間接触させられる。この活性化ステップの前に、合成材料は、それら の内部及び／又は表面の不純物を取り除（溶液に接触させても良い。

固定化ステップは、最初に血栓形成阻害物質を少なくとも一分子の二官能性架橋 剤と、その薬剤を阻害物質と架橋させるのに十分な時間接触させ、それから、血 栓形成阻害物質と結合した薬剤を合成材料に付着した基底被膜層に結合させるこ とにより行われる。血栓形成阻害物質はその血栓形成阻害活性をその薬剤に結合 したときに保持する。

”二官能性の架橋剤”という用語は、ここでは、例えば、１分子上の又は２つの 別個の分子上の２つの反応性の基と結合し、それにより架橋する能力を有する分 子として定義される。もしこの二官能性架橋剤が２つの異なるタイプの基に結合 するならば、それは“ヘテロニ官能性”架橋剤である。しかしながら、もしこの 二官能性架橋剤が２つの類似の基にのみ結合するならば、それは“ホモニ官能性 ”である。有用な二官能性架橋剤は任意の数の既知のへテロニ官能性又はホモ三 官能性薬剤、又は両者の混合物を含む。

結合ステップの前に、血栓形成阻害物質と結合した架橋剤は、それに混入してい る不純物を取り除（ためにクロマトグラフィー処理されても良い。

この発明の一つの面において、合成材料に付着した基底被膜は、少なくとも１分 子の二官能性架橋剤に結合されるであろう、この具体例において、その方法は、 更に血栓形成阻害物質に結合した薬剤を基底被膜に結合された薬剤に結合せ、そ れによって血栓形成阻害物質を基底被膜層を付着した合成物質に架橋結合するこ とを含む。

この発明の他の面において、基底被膜層と架橋した薬剤は、結合ステップの前に 、還元される。還元は、阻害剤と架橋した二官能性薬剤と、ジスルフィド結合を 形成する置換反応により反応できるスルフヒドリル基の形成を基底被膜層と架橋 した薬剤上にもたらすが、そのジスルフィド結合により、血栓形成阻害物質が基 底被膜層に共有結合的に架橋される。

この発明の他の具体例において、血栓形成阻害物質は合成材料上での固定化の前 に、基底被膜物質に架橋される。

この発明は、次に、ある図解された具体例に関して述べられるであろう、しかし ながら、様々な変更、追加及び削除が、この発明の趣旨又は範囲から離れずに行 われ得ることは明らかであろう。

の　ｔ　ｔ　日 この発明の前述の及び他の目的、それらの様々な特徴は、それらの発明と同様に 、下記の記述を、付随する図面と共に読むことにより、より十分に理解されるで あろう。

図１は、凝血に関係する経路の図解である。

図２は、蛋白質Ｃの活性化及び発現に関係する経路の図解である。

図３は、血栓形成に関係する血小板の図解である。

図４は、自然のトロンボモジュリンのアミノ酸配列の図式である。

図５は、５ＰＤＰにより誘導体化されたＴＭの活性のグラフである。

図６は、固定化ＴＭ又はＢＳＡを含む移植片の活性の図７は、ＴＭ−又はＢＳＡ −固定化移植片の活性のグラフである。

１１２１１朋 この発明は、血管系に接触する移植可能な及び体外の装置に有用な生体適合性の 血栓抑制性の物質、及びそれらの製造方法を提供する。

この発明により提供される物質は、その合成材料の表面に付着した生体適合性の 基底被膜層を介してそれに架橋した血栓形成阻害物質を有する生体適合性の合成 物質を含む。

人工器官の体外の又は移植可能な装置において有用な材料は、任意の、生体適合 性の１合成の、好ましくは、血液循環の過酷な作業に耐えるために十分な引っ張 り強さを持ち、基底被膜層が直接又は間接に結合し得る基を有する高分子材料か ら成るであろう。そのような合成材料の例は、ポリテトラフルオロエチレン（テ フロン）、ポリエチレンテレフタレート（ダクロン又はアミラー）、ナイロンな どである。この材料は、用いられる目的に応じて適切な寸法を取り得るであろう 。例えば、それは、移植された心臓弁又は血液透析や心肺バイパス外科手術に有 用な体外の装置の不可欠な部分であり、又はカテーテルを被覆したり移植血管の 内側を裏打ちするのに用いられるであろう。

この合成材料は、得られたときには、様々な非共有結合的に付着した不純物で被 覆され又はそれらを含み、それらの除去が基底被膜層の付着の前に必要であろう 。例えば、商業的品質で織られたポリエチレンテレフタレート上の潤滑剤は、ポ リエチレンテレフタレートを、例えば、様々な洗浄剤、溶剤又は塩を含む溶液に 接触させることにより除かれ得るが、それらは不純物を解離させ、そして／又は 可溶化する。

表１及び２は、生体適合性の血栓抑制性の物質の代表的な製造方法のあらましを 示す。ここに、“Ｄａ”は、織られたポリエチレンテレフタレート繊維から成る 合成材料を、”ＨＳＡ”は、ヒト血清アルブミンを、”ＥＤＣ”は、カルボジイ ミドを、“５ＰＤＰ”は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）− プロピオネートを、“Ｐ−２−Ｔ″は、ピリジン−２−チオンを、そして“阻害 物質”は、トロンボモジュリン又はその活性なフラグメント又はアナログのこと を言う。

及ニ ステップ １）　Ｄａ　＋　ＮａＯＨ−−−−＞　Ｄａ−ＣＯＯＨ２）　Ｄａ−ＣＯＯＨ＋ 　ＥＤＣ−−−−＞　Ｄａ−ＥＤＣ３）　Ｄａ−ＥＤＣ＋　ＨＳＡ　−−−−＞ 　Ｄａ−ＨＳＡ十尿素４）　Ｄａ−ＨＳＡ　＋　５ＰＤＰ　−−−−＞　Ｄａ− ＨＳＡ−ＳＰＤＰ５）　Ｄａ−）ＩＳＡ−ＳＰＤＰ　＋　ＤＴＴ　−−−−＞　 Ｄａ−ＨＳＡ−ＳＨ＋　Ｐ−２−Ｔ６）　阻害物質＋５ＰＤＰ−−−−＞阻害物 質−３ＰＤＰ７）　Ｄａ−ＨＳＡ−３Ｈ十阻害物質−−−一〉Ｄａ−ＩＳＡ−３ −Ｓ−阻害物質＋Ｐ−２−Ｔステップ １）　ＨＳＡ　＋　５ＰＤＰ　−−−−＞　ＨＳＡ−３ＰＤＰ２）　ＨＳＡ−Ｓ ＰＤＰ　＋　ＤＴＴ　−−−−＞　ＨＳＡ−３）Ｉ　＋　Ｐ−２−Ｔ３）　阻害 物質÷５ＰＤＰ−−−−＞阻害物質−３ＰＤＰ４）　）ＩＳＡ−ＳＪ（＋　阻害 物質−−−−＞ＨＳＡ−５−Ｓ−明答物質＋　Ｐ−２−Ｔ ５）　Ｄａ　＋　ＮａＯＨ−−−−＞　Ｄａ−ＣＯＯＨ６）　Ｄａ−ＣＯＯＨ＋ 　ＥＤＣ−−−−＞　Ｄａ−ＥＤＣ７）　Ｄａ−ＥＤＣ＋　ＨＳＡ−Ｓ−３−阻 害物質−−−−＞　Ｄａ−ＨＳＡ−３−Ｓ−十　尿素最初に、合成材料は基底被 膜層の結合を増大させるように活性化することが出来る。この活性化ステップは 合成材料中の化学的に活性な基の数を増す。例えば、アルカリ性の加水分解は、 カルボジイミドなどの二官能性の架橋剤が結合するポリエチレンテレフタレート 中の反応性のカルボン酸基の数を増すように行われる。最後に、基底被膜層が、 合成材料上に結合したカルボジイミド基に付着する。しかしながら、この方法は 注意して行われなければ成らない。なぜなら、アルカリ性の加水分解は部分的に 、ポリエチレンテレフタレートを分解し、その結果この材料の繊維をすり減らす からである。少なくとも一つの基底被膜層は、合成材料の少なくとも一つの面に 付着する。

この材料に層として付着した又は結合していない基底被膜材料はそれらへの付着 物の血栓形成阻害物質の成分を提供する。そのような成分は、阻害物質のための 結合部位を合成材料単独よりも多く提供し、それによって、結合し得る阻害物質 の量を増大させる。有用な成分は、蛋白質、ペプチド、リボ蛋白質、糖蛋白質、 グリコサミノグリカン、合成ポリマー及びそれらの混合物を含む。

血清アルブミン及びフィブロネクチンなどの蛋白質はそれら自身が抗血栓形成特 性を持つことが知られているので基底被膜成分として特に望ましい（Ｌｙｍａｎ ら、　（１９６５）Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、　Ｓｏｃ、Ａｒｔｉｆ、　Ｉｎｔｅｒｎ 、　Ｏｒｇａｎｓ、　１１巻：３０１頁；　Ｆ　ａ、　ｌ　ｂら（１９７１）Ｆ ｅｄ、Ｐｒｏｃ、、３０巻、１６８８頁）。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳ Ａ）分子は、阻害物質結合部位として利用できる６５アミノ基を有する。

人工材料の表面への基底被膜層の付着は、自然には、共有結合であろう。蛋白質 のポリエチレンテレフタレートへの共有結合の方法は、架橋剤の遊離の反応性ス クシンイミドエステル基の蛋白質上の一級アミノ基への攻撃を含む。表１の例に 示されるように、基底被膜層をポリエチレンテレフタレートに共有結合的に付着 させるために、ポリエチレンテレフタレートは、最初に、０．５ＮＮａＯＨで処 理され、そして、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中においてＨＳＡ　（基底被膜） で被覆される前に微酸性条件下でカルボジイミドと反応される。

血栓形成阻害物質は、それから、その成分を介して共有結合的に基底被膜層に付 着され、阻害物質で被覆された物質を生じる。阻害物質で被覆された物質は、亘 接血液と接触する移植可能な装置において用いるのに理想的である０例えば、血 管の代用に用いられるバイパス移植片は、しばしば、血液の塊即ち血栓で満たさ れ、その結果、血流が制限される。阻害物質で被覆された物質は血液の塊に抵抗 するので、その使用は血栓症及び続いて起こるバイパス移植片の閉塞を防ぐであ ろう。同様に、カテーテルが診断又は治療目的で血管系に入れられると、血塊が しばしばカテーテルの外側に形成される。血塊は血流によりカテーテルから洗い 落とされるか又はカテーテル操作により揺すり落とされ、塞栓症及び生体器官へ の循環の閉塞の可能性を増す。阻害物質で被覆された物質は、人工の心臓弁、大 動脈内バルーンポンプ、全心臓即ち人工心臓、又は心臓補助装置、大静脈内装置 、及び血流と接触する任意の装置に同様の利点を与える。更に阻害物質で被覆さ れた装置は、腹腔内透析用カテーテル及び皮下移植片などの腔内装置に利点を与 え、血栓形成による炎症反応が減少する。

これらの目的に有用な血栓形成阻害物質は、血栓形成を邪魔又は阻害する分子を 含む。これらは、トロンボモジュリン、ＡＴＰアーゼ、ＡＤＰアーゼ、５°−ヌ クレオチダーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンア クチベーター、抗凝固物質、血小板阻害物質（例えば、プロスタサイクリン及び アスピリン）、並びに、活性なアナログ、フラグメント、誘導体及びそれらの融 合産物、又はそれらの混合物を含む。

トロンボモジュリンは、凝固の制御に関与する内皮又は他の細胞の表面に見出さ れるレセプター蛋白質であるが、その様々な経路は図１に示されている。それは 、約６０．３ｋＤの分子量の糖蛋白質であり、約５７５のアミノ酸を持つ（Ｅｓ ｍｏｎ　（１９８８）　Ｐｒｏｇ、）ｌｅｍｏｓｔ、Ｔｈｒｏｍｂ、、９巻、　 ２９−５５頁）。トロンボモジュリンはトロンビンに結合し、そうして、トロン ビンによる蛋白質Ｃの活性化における補助因子として作用するが、それはトロン ビンの不活性型の蛋白質Ｃへの結合を促進しく図２）、それにより、活性化され た蛋白質Ｃを形成する。活性化された蛋白質Ｃは、抗凝固及び血栓崩壊活性の両 方を示す。それは、活性型の凝固因子の酵素的開裂により凝固カスケードをＶ及 びＶＩＩＩ因子のレベルで阻害し、血栓崩壊活性を持つ蛋白質であるプラスミノ ーゲンアクチベーターの産主に参加する。トロンボモジュリンは又、非結合トロ ンビンに触媒される不活性フィブリノーゲンのフィブリンへの開裂を阻害するこ とにより（Ｅｓｍｏｎら（１９８２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７巻、　 ７９４４−７９４７頁を見よ）及びトロンビンの活性血小板を活性化する能力を ブロックすることにより血小板の凝集を阻害することにより血液凝固を阻害する （例えば、Ｍｕｒａｔａら、　（１９８ｇ）、Ｔｈｒｏｏ＋ｂｏｓｉｓＲｅｓ、 　、５０巻、　６４７−６５６頁及びＥｓｍｏｎら、　（１９８３）、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　２０巻、　１２２３ｇ−１２２４２頁を見よ）。

未変°性のトロンボモジュリンはヒトの肺及び胎盤から得られるが、その単離手 順は当業者には知られている（例えば、ＥＰ０２３９６４４及びＳａｌｅｍら、 （１９８４）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　、　２５９巻、　１２２４６−１２２５１頁を見 よ）。トロンボモジュリンは又、培養ヒト謄静脈内皮細胞などの培養内皮細胞か らも得られるであろう（Ｍｕｒａｔａら、　（１９８８）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ ｓ　Ｒｅｓ、、５０巻、　６４７−６５６頁）。或は、そのアミノ酸配列（図３ ）が知られているので、合成及び組換え型のトロンボモジュリンが既知の手順に より産生し得る（例えばＷＯ３８１０９８１１及びＥＰＯ２９０４１９を見よ） 。

ＡＤＰアーゼは、ＡＤＰを分解することにより血小板凝集を減少させる。ＡＤＰ は、血小板の高密度顆粒（ｄｅｎｓｅ　ｇｒａｎｕｌｅｓ）中に蓄えられ、トロ ンビン、エピネフリン、コラーゲン及び他の刺激物により遊離され得る。遊離さ れたときは、ＡＤＰは、血小板のレセプターの二つの凝固に不可欠の蛋白質であ るフィブリノーゲン及びｖ。

ｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子に対する結合を促進し、それから、トロンボキサ ン合成、血小板凝集、更なるＡＤＰの遊離を促進し、そして、このようにして、 血小板凝集を自己増進させる。

ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰのＡＤＰへの変換を触媒するが、それは、上記のように ＡＤＰアーゼにより作用され得る。

５°−ヌクレオチダーゼ（ＡＭＰアーゼ）は、ＡＤＰアーゼと同様にＡＤＰを分 解する。それは又、ＡＤＰのレセプター結合に対する競合的拮抗物質であるＡＭ Ｐを、血小板阻害物質であるアデノシンに分解する。アデノシンは、細胞内の環 状ＡＭＰのレベルを上昇させることにより血小板凝集を阻害する。高レベルの環 状ＡＭＰはカルシウムイオンの血小板貯蔵プールからの移動を阻害する。血小板 内の遊離のカルシウムイオンは、余分のＡＤＰの血小板高密度顆粒からの遊離を 刺激し、血小板凝集に必要であり、従って血栓形成に必要である（図３を見よ） 。

血栓形成阻害物質は直接又は間接に基底被膜上に、二官能性架橋剤の使用により 固定化される。特に、線形分子の各末端に二つの異なる反応性の基を持ち、それ 故、他の分子上の又は同じ分子の異なる領域の二つの異なる反応性の基に結合で きるヘテロニ官能性の架橋剤は、二官能性架橋剤として最も好ましい、有用なヘ テロ三官能性試薬としては、多くのものの内、５ＰＤＰ及びスクシンイミジル４ −（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ ）がある。更に、スルホスクシンイミジル２−（ｍ−アシド−Ｏ−ニトロ−ベン ザミド）−エチル−１，３゛−ジチオ−プロピオネート（ＳＡＮＤ）及びＮ−ス クシンイミジル−６−（４−アゾイド−２゛−ニトロフェニル−アミノ）ヘキサ ノエート（ＳＡＮＰＡＨ）などの光反応性の架橋剤は光化学カップリングにより 基底被膜のＣ−Ｈ結合に直接挿入し得る光反応性の基を持つが、他方、他の基は 蛋白質への結合のために遊離のままでいる。有用な架橋試薬及びそれらの特性は 表３に列挙されている。各試薬に対して記された“二重薬剤番号”は、その試薬 をＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ｌ１ｌｉ ｎｏｉｓ）から購入するための商品名である。

轟旦 里」Ｌ剤 ２１５５１　ＡＮＢ−ＮＯＳ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２０１０６　ＡＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２０１０７　ＡＰＧ　Ｘ　Ｘ ２１５５９　ＡＰＴＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５７９　ＢＳ’　Ｘ　Ｘ ２２３１９　８ＭＨＸ　Ｘ ２１５５４　Ｂ５０ＣＯＥＳ　Ｘ　Ｘ ２１５２４　ＤＦＤＮＢ　Ｘ　Ｘ ２００４７　ＤＩＤＳ　Ｘ　Ｘ ２０６６４　ＤＭＡ　Ｘ　Ｘ ２０６６６　ＤＭＰ　Ｘ　Ｘ ２０６６８　ＤＭＳ　Ｘ　Ｘ ２２５８５　ＤＳＰ　Ｘ　Ｘ ２］５５５　ＤＳＳ　Ｘ　Ｘ ２０５９０　ＤＳＴ　Ｘ　Ｘ ２０６６５　ＤＴＢＰ　Ｘ　Ｘ ２２５９０　ＤＴＢＰＡ　Ｘ　Ｘ ２１５７７　ＤＴＳＳＰ　Ｘ　Ｘ ２１５５０　ＥＡＤＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５６５　ＥＧＳ　Ｘ　Ｘ ２３７００　ＦＮＰＡ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５６０　Ｈ３ＡＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ 表１」旦皇り 区」Ｌ泗 ２６０９５　ＭＡＢＩ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２２３１０　ＭＢＳ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２７７１５　ＮＨＳ−ＡＳＡ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２０６６９　ＰＮＰ−ＤＴＰ　Ｘ　Ｘ 　Ｘ２１５５２　５ＡＤＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５４９　５ＡＮＤ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２２５８８　５ＡＮＰＡＨＸ　Ｘ　Ｘ ２７７１６　５ＡＳＤ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２２３２５　５ＩＡＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２３２０　ＳＭＣＣＸ　Ｘ　Ｘ ２２３１５　ＳＭＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５５７　５ＰＤＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５５６　５ｕｌｆｏ− ＢＳＯＣＯＥＳ　Ｘ　Ｘ ２０５９１　５ｕｌｆｏ− ＤＳＴ　Ｘ　Ｘ ２１５５６　５ｕｌｆｏ− ＥＧＳ　Ｘ　Ｘ ２２３１２　Ｓｕｌｆｏ− ＭＢＳ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２１５５３　５ｕｌｆｏ− ＳＡＤＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２２５８９　５ｕｌｆｏ− ＳＡＮＰＡＨＸ　Ｘ　Ｘ ２２３２７　５ｕｌｆｏ− ＳＩＡＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２２３２２　Ｓｕｌｆｏ− ＳＭＣＣＸ　Ｘ　Ｘ ２２３１７　Ｓｕｌｆｏ− ＳＭＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２６１０１　ＴＲＡＵＮＴ’Ｓ　Ｘ　Ｘ架橋剤は、所望の結合部位密度が達成さ れるような量で基底被膜に加えられる。結合部位密度は、基底被膜に結合して表 面の融合性範囲を与える架橋剤のモル／ｇ合成材料による量である。

阻害物質を基底被膜へ結合するために、架橋剤が最初に基底被膜及び阻害物質に 結合出来る。阻害物質の動力学定数（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）が、 その処理のそれらの動力学定数に対する影響を評価するために、結合の前と後と で比較される。阻害物質は結合の後で生物的に活性であるべきである。それ故、 固定化される阻害物質に特異的な標準的活性試験が、その能力を評価するために 標準トロンビン溶液を用いて行われる。

別法として、基底被膜の蛋白質成分は、合成材料への付着に先立って血栓形成阻 害物質に結合されて複合体を形成し、その複合体は、表２に示されるように合成 材料に結合され得る。未結合の血栓形成阻害物質複合体は、生物活性を保持し、 それ故、それは容易に腎臓で除去されないので、循環において増大された半減期 を持つ薬剤として用いられ得る。更に、血栓形成阻害物質の、基底被膜の蛋白質 成分又は他の蛋白質又は化合物による誘導体の生成は、阻害物質の活性を制御す るために用いられ得る。

５ＰＤＰは、末端並びにニブシロンアミノ基と反応するであろうが、末端アミノ 基の誘導体生成が生物的に活性な蛋白質を不活性化できるので、Ｔ−ＢＬＯＣＫ （Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ１ｌｉｎｏ ｉｓ　）が、５ＰＤＰ−誘導体生成においてその基をブロックするのに用いられ るであろう、Ｔ−ＢＬＯＣＫは、それから、生物活性を回復させるための誘導体 生成の後で除去される。

本発明は、下記の非制限的な実施例によって、更に、理解されるであろう。

医ＪＪ乱１ ・　クロンの　゛ Ａ、　ダクロンの前処理と活性化 ダクロン移植材料（Ｍｅａｄｏｘ　Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ、、０ａｋｌａｎｄ 。

ＮＪ）を、１．Ｏｃｍ長に分割する。織物の表面及び内部の潤滑・剤は、四塩化 炭素で１時間１回及び１００％ＣＨＩ　ＯＨで２回洗うことにより除去する。メ タノールを水で何度も洗い、次にりん酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７，４中で １回洗うことにより除去する。

この移植材料を、それから、利用できるＣ０ＯＨ基を増すためにアルカリで加水 分解する。この材料を、０゜５　Ｎ　ＮａＯＨで、５０℃で、１時間処理し、そ れから、ＨｓＯで繰り返し洗う、活性化された材料を、脱イオン水中の、１００ ．０ｍｌの１０ｍＭ水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）ｐＨ４，６−５，０中に、 定速で攪拌しながら、１時間、室温に置（、この材料を取り出し、そしてＰＢＳ 中で洗い、過剰の未結合ＥＤＣを除去する。

Ｂ、　基底被膜の塗布 基底被膜をダクロン移植材料の内腔に塗布する。誘導体生成されたダクロン材料 を、ＰＢＳ中の５％ＨＳＡ溶液中で、ｌ　ｍ　ｌ　／　ｃ　ｍ　”移植材料で、 室温で、定速攪拌しながら、２４時間インキュベートする。その移植片を取り出 し、非特異的に結合したＨＳＡを除去するためにＰＢＳ中で洗う、ダクロン１ｍ ｇ当たり約２０μｇの蛋白質が共有結合する。

ＨＳＡ−結合ダクロン材料を、それから、ＰＢＳ中の５ＰＤＰの１．０ｍＭ溶液 、ｐＨ７，４中でインキュベートし、５ＰＤＰをＨＳＡに結合させる（１００ｍ ＭＳ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　／　ｃ　ｍ　”基底被膜）、インキュベーションを室温で３ ０−４０分後に停止する。移植片をＰＢＳで洗い非特異的に結合した５ＰＤＰを 除去する。

Ｃ０基底被膜上の５ＰＤＰの活性化及び結合部位密度の測定 ５ＰＤＰ架橋された材料を乾燥し、重量測定してその絶対重量（ａｂｓｏｌｕｔ ｅ　ｗｅｉｇｈｔ　）を得る。それを、それから、酢酸緩衝液、ｐＨ４，５中の ５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液中に、室温で置く。この反応は、ピ リジン−２−チオン（Ｐ−２−Ｔ）を結合した５ＰＤＰから遊離させ、同時に、 遊離のスルフヒドリル（ＳＨ）基を基底被膜上に形成する。遊離されたＰ：２− 丁を、吸光係数（Ｅ＝８．０８ＸＩＯ”　）を用いて。

３４３ｎｍにおける吸光分光分析（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　５ｐｅｃｔｒ。

ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）により定量するが、それは、結合した５ｐＤＰ又は結合 部位の量に直接比例する。結合部位の数を計算し、部位のモル数／ダクロンのｇ 数で表す。この材料を、それから、ＰＢＳ中で５回、ｄＨ□ｏ中で４回洗う。

或は、スルフヒドリル（ＳＨ）基を血清アルブミン被覆された移植片に、Ｔｒａ ｕｎｔ試薬を用いて共有結合的に導入する。このＳＨ基導入方法は、５ＰＤＰ以 上の量の基底被膜に結合したＳＨ基を提供する。しかしながら、この方法は、最 終的に結合したＳＨ基の数の定量が困難ということで制限される。

１１■ユ トロンボモジ上１ン　ＴＭ　のダクロンに・　した１１Δ旦星１ Ａ、　架橋剤を用いたＴＭの誘導体生成凍結乾燥されたＴ　Ｍ　（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃｏ、、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、　Ｎ、　Ｊ、　 ）を脱イオン化されたＨｔＯに、１０部ｇ／ｍｌ（又はＩＵ／ｍｌ）に再懸濁す る。ＳＰＤＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ　）を１００ ％ＥｔＯＨに１０ｍＭに溶解する。１部のＴＭを４部の５ＰＤＰに混合しくモル ：モル）、室温で３０分インキュベートする。誘導体化されたＴＭは早く溶出す るので、５ＰＤＰ結合ＴＭを遊離の５ＰＤＰ及び反応副産物からＧ−２５カラム 上で分離する。

５ＰＤＰのＴＭへの結合は、ピリジン−２−チオン（Ｐ−２−Ｔ）をＴＭに結合 した５ＰＤＰから遊離させるＤＴＴの添加により定量できるが、それは３４３ｎ ｍにおいて分光測光により測定出来る。この測定から、ＴＭに結合した５ＰＤＰ のモル数を計算出来る。遊離されるＰ−２−Ｔの量は、基底被膜のＳＨ基とＳＰ ＤＰ−ＴＭとの間に起きた５ＰＤＰ置換反応（共有結合）の数に直接比例する。

１モルのＴＭは、この研究において、１．０モル以上の５ＰＤＰと結合する様で ある。ＴＭ：５ＰＤＰの誘導体生成のモル：モルの比は単なる推定であるが、し かし、結果は、ＴＭがＰ−２−Ｔの定量の分光測光法を生化学的に邪魔すること を示唆し、特異性は見かけ上、５ＰＤＰによるＴＭの誘導体生成に固有である。

Ｂ、　誘導体化されたＴＭの基底被膜への架橋（ＤＴＴでの還元又は丁ｒａｕｎ ｔ試薬での処理により利用可能な遊離のＳＨ基を持つ）基底被膜を（ＤＴＴ又は Ｔｒａｕｎｔ試薬を除去するために）ＰＢＳで洗う。５ＰＤＰを結合されたＴＭ を、それから、移植片に約４．０μｇ　／　ｃ　ｍ　”ダクロンで加える。その 溶液を、−晩、室温で、ＳＰＤＰ−ＴＭをダクロン移植片上のＳＨ基に結合させ るためにインキュベートする。このＴＭが共有結合的に固定化されたダクロン材 料を、それからＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中に保存する。

Ｃ，ＴＭ活性試験 下記の試薬を調製した：　（１）ＴＭ　（ＴＭ）：　１０μｇ（ＩＵバイアル、 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ、、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、 　ＮＪ）を１ｍｌのｄＨ，Ｏで戻した。（２）蛋白質Ｃ（ＰＣ）：　１００μｇ の蛋白質（ＩＯＰＥＵ／バイアルＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　 Ｃｏ、）を１ｍｌのｄ　Ｈ２０で戻しく＝０．１μｇ／μＩＰＣ保存溶液）、１ ０μｍの保存溶液を、試験で用いるために１９０μｍのＴＭ緩衝液（２０ｍＭ） リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，０，−１５ＭＮａＣ１，１０ｍＭＣａＣ１，，０， １％ＢＳＡ）中に希釈した。、（３）トロンビン（Ｔ）：　１０００／ｍｌの保 存溶液をＴＭ緩衝液で１：４に希釈して２５　Ｕ　／　ｍ　１溶液を調製した。

（４）ヒルディン（Ｈ）　：　２ｍｇ　（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ、　Ｓｕｍｍｉ ｔ、　ＮＪ）を１．９１３ｍ１のＴＭ緩衝液で戻した（１１５００Ｕ／ｍｌ）。

（５）Ｓ−２２６６：４ｍＭ溶液を、２．３１８ｍｇを１ｍｌのｄＨＨＯ２混ぜ ることにより調製した。（６）試験用緩衝液は２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ ，０，０，１５ＭＮａＣ１である。

希釈されたｐｃ溶液２００ｕｌ、２５　Ｕ　／　ｍ　ｌのＴ５μｌ及び丁Ｍ保存 溶液５０μｍを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。５つのＴＭを含 まないコントロール用の試料をも又作り、３７℃で３０分間インキュベートした 。

インキュベーションの後、１０μｍの保存Ｈ溶液及び７４０μｍの試験用緩衝液 を過剰のトロンビンを阻害するために、それから、加えた。その試料を表４に示 す。

表１ １＊　２００　μ　１　５　μ　１　−−　５０　μ　１　１０μ　１２＊　２ ００　μ　１　５　μ　ｌ　−−６０μ　ｌ　−−３＊−−５μ　ｌ　−−２５ ０μ　１　１０　μ　１４＊　−−５μ　１　−−２６０　μ　ｌ　−−５＊　 ２００　μ　１−−−−６５　μ　１　−−ｓ＊＊　２　ｏｏ　μ　１　５　μ 　１　５０μ１−−１０　μ　ｌ＊　コントロール試料 ＊本試験用試料 これらの溶液を３７℃で、３分間インキュベートした。それらを、それから、キ ュベツトに移し、５０μｍの４ｍＭＳ−２２６６をそれぞれに加えた。Ａ　４０ ６の吸光度を、各１３秒の読みで、５分間測定した。ΔＡ／分も又計算した。Ｔ Ｍ試験用試料（＃６）の吸光度Ａ４゜５／分の変化は、どのコントロール用試料 よりも大きく、ＴＭ活性を示した。ＴＭ試験用試料のΔＡ／分は安定でかつ不変 であった。５０μｌのＴＭ保存溶液（ＩＵ／ｍｌ）は約０．０６のΔＡ／分を与 え、０．０５単位のＴＭは、４０５ｎｍで、これらの条件下で１色素Ｓ−２２６ ６を用いて、０．０６のΔＡ／分を表す。

この試験の機構は： （１）ＴＭ　＋　Ｔ　−−−＞　ＴＭ−Ｔ複合体（３）Ｓ−２２６６＋　活性化 ＰＣ −−−−＞増大されたＡ　４６Ｂ である。

Ｄ、５ＰＤＰ誘導体化されたＴＭの活性２００μｌの保存７Ｍ溶液をキュベツト に入れた。

１０μｌの１１．０μＭの５ＰＤＰ　（ＴＭ緩衝液及びＥｔＯＨ中）を加え、５ ＰＤＰ添加の前後でＡｓ４５を測定した。その溶液を室温で約３０分間インキュ ベートした。ＴＭ温溶液約３０分間放置してから、５０μｍを、（Ｃ）で述べら れたのと同様の手順で活性を試験した。

ΔＡ／分の値から及び図５に示されるように、ＴＭ−３ＰＤＰ試料（＃６）は活 性（即ち、トロンビンの存在下で、ＰＣを活性化する能力）を示した。

Ｅ、　固定化され、誘導体化されたＴＭ（＃１）の活性前もって、実施例１で述 べられたようにして調製し、りん酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）＋アジ化ナトリウム中 に保存した６つの移植片を、ＰＢＳ中で２回、ＰＢＳ＋ドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）で１回洗った。それらをそれから、超音波処理し、ＰＢＳ中で３回洗 った。移植片をきれいな試験管に入れ、ＰＢＳ緩衝液中で２０ｍＭＴｒａｕｎｔ 試薬と共に約２時間室温でインキュベートした。

ＴＭ−ＳＰＤＰ溶液を、５００ＩＬｌの保存用ＴＭ　（ＩＵ／ｍｌ）をｌｏμｆ の２２．０μＭＳＰＤＰと混合することにより作成した。その溶液を室温で約３ ０分間インキュベートした。それを、それから、Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ　）上で、ＴＭ−ＳＰＤＰを遊離の５ＰＤ Ｐから分離するために精製した。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＳＰＤＰを、ＴＭ結合されたダクロン移植片の 評価におけるコントロールとして調製した。ＢＳＡ−ＳＰＤＰ溶液を、２ｍｌの １％ＢＳＡを６２ｕｌの２０ｍＭ５ＰＤＰと混合することにより作成した。その 溶液を、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｅｔａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 ＮＪ　）上で精製する前に、室温で３０分間インキュベートした。各試料の最初 のピークを採取した。ｌ：５希釈したもののＡ、４．を、溶液１ｍｌ当たりに５ ０ｕｌの１００ｍＭＤＴＴを加える前及び５分後に測定した。

移植片を、Ｔｒａｕｎｔ試薬で処理した後、ＰＢＳ中で５回洗った。０．５μｌ のＴＭ−ＳＰＤＰ溶液を移植片＃１及び＃２に、０．５μｌのＢＳＡ−ＳＰＤＰ 溶液を移植片＃３及び＃４に加えた（表５を見よ）。この移植片を、ＴＭを試験 用移植片上に、そしてＢＳＡをコントロールの移植片上に固定化するために室温 で一晩インキュベートした。

■ 往１ｕ虹笠　−！丘１−−− １　固定化ＴＭ　ＰＣ＋　Ｔ　＋　Ｈ ２固定化ＴＭ　ＰＣ＋　Ｔ　＋　Ｈ ３固定化ＢＳＡ　ＰＣ＋　Ｔ　＋　Ｈ ４固定化ＢＳＡ　ＰＣ＋　Ｔ　＋　Ｈ 移植片を、それから、ＰＢＳ中で２回洗い、７Ｍ緩衝液中で３回洗った。それら をきれいなポリプロピレンチューブに入れて、活性を試験した。２００μｌのＰ Ｃ（０，１μｇ／μｍ）を各移植片に加え、続いて５μｌのトロンビン（２５Ｕ ／ｍｌ）を加えて混合した。それらを３７℃で３０分間インキュベートした。１ ０μｌの１１．５００Ｕ／ｍｌのＨ及び７４０ｕ　ｌの試験用緩衝液を各チュー ブに加え、それから、３７℃で３分間インキュベートした。各試料を、それから 、キュベツトに入れた。５０ｕｌの４ｍＭＳ−２２６６を加え、Ａｌａｓを５分 間測定した。

図６に示されるように、ＴＭを固定化された移植片はこの試験において、コント ロールとしてのＢＳＡを固定化された移植片と比較した場合、より強い活性を示 した。ＴＭ移植片に対する大体のΔＡ／分は０．００４であり、ＢＳＡ移植片に 対しては０．００１であった。ＴＭ移植片に対するΔＡ１５分は０．０１３であ り、ＢＳＡ移植片に対しては０．００５であった。ＴＭ移植片はＰＣ試験におい て、ＢＳＡ移植片の活性を上回る活性の増大を示したが、これはＴＭが移植片に 固定化されて、その活性を保持することを示す。

Ｆ、　固定化され、誘導体化されたＴＭ（＃１）の活性４００μｌのＴＭを、１ ０μｍのＥｔＯＨ中の２２μＭＳＰＤＰで誘導体生成した。その溶液を精製する ためにＧ−２５カラムを通し、３０分後に停止した。最初のピークの画分を採取 し、プールしなかった。１．０ｍｌのＰＢＳ中の１％ＢＳＡを、コントロールの 移植片を作るために３１μｌのＥｔＯＨ中の２２μＭＳＰＤＰと混合した。３０ 分後に、その溶液をＧ−２５カラムを通した。最初のピークの画分を採取し、プ ールした。

５つの移植片を５回ＰＢＳで洗い、それから、非共有結合的に結合したアルブミ ンの除去を確実にするためにＰＢＳ＋０．１％ＳＤＳ中で超音波処理した。各移 植片を、室温で、約２時間、１ｍｌのＰＢＳＴ　（ＰＢＳ緩衝液＋〇、１％Ｔｗ ｅｅｎ２０）中の２０ｍＭＴｒａｕｎｔ試薬中でインキュベートした。その移植 片をＰＢＳＴ中で２回、ＰＢＳ中で３回洗った０表５に示されているように、移 植片＃１を、０．５ｍｌのＴＭ−ＳＰＤＰピーク（Ａ１．。＝Ｑ、１４２）の最 初の画分とインキュベートシた。移植片＃２を約０．４ｍｌの第２画分のＴＭ− ＳＰＤＰ溶液（Ａ８．。＝Ｑ、０３６）とインキュベートした。そして、移植片 ＃３及び＃４を０．５ｍｌのＢＳＡ−ＳＰＤＰ溶液とインキュベートした。

各溶液のＡ、４．を、ｔ＝０で、ＰＢＳをブランクとして測定した。その移植片 を、それから、室温で、−晩インキユベートした。各溶液のＡ１１．を７Ｍ固定 化の程度を評価するために測定した。移植片を、非共有結合的に結合したＴＭを 除去するために、ＰＢＳ中で２回、７Ｍ緩衝液中で３回洗った。移植片の活性を 、基本的には（Ｅ）で述べられたようにして、Ｔ（３０μｍ＋２１０μＩＴＭ緩 衝液）の前にＰＣ（５０μｍ＋９５０μＩＴＭ緩衝液）を加えて試験した。Ａ４ ゜襲を１０分間以上測定した。

１互 往１口虹皇　−蔓■五玉− １固定化ＴＭ　ＰＣ＋Ｔ＋Ｈ ２固定化ＴＭ　ＰＣ＋Ｔ＋Ｈ ３固定化ＢＳＡ　ＰＣ＋Ｔ＋Ｈ 図７に示されるように、ＴＭ固定化移植片（＃１及び＃２）は、ＢＳＡ固定化移 植片（＃３）を上回る活性を示した。陽性コントロールとして溶液中に遊離のＴ Ｍを伴う移植片＃４は有意の活性を示さなかった。ＴＭ移植片＃１を、移植片＃ ２の場合の約３倍のＴＭ−ＳＰＤＰを含む溶液中でインキュベートした。固定化 ＴＭ移植片＃ｌは、固定化ＴＭ移植片＃２より２倍大きい活性を示したが、これ はその移植片へのＴＭの結合に比例的に増加する関係があることを示している。

ＴＭ移植片＃１及び＃２は（それぞれ）ＢＳＡブロックされた移植片＃３の５倍 及び２倍のΔＡを有した。

これらの結果は、ＴＭがうまくダクロン移植材料の表面に固定化され得ること、 固定化されたＴＭが血栓形成阻害活性を保持すること、加えられたＴが固定化さ れたＴＭにより結合され得ること、及びＴＭと結合したＴが蛋白質Ｃの活性化能 を有することを示す。活性化された蛋白質Ｃは、Ｖａ及び　ＶＩＩＩａ因子を分 解し、それにより、血栓の形成を抑制する。

良１去旦 ストレプトキナーゼ（ＳＫ　のダクロンに・　した１１Δ立呈１ Ａ、ＳＫの架橋剤による誘導体形成 アルブミンを含まないＳ　Ｋ　（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、 Ｓｗｅｄｅｎ　）をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ、　ＮＪ）を用いて、不純物及びアミノ酸防腐剤を除去し、ＳＫをＯ，Ｉ ＭＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，５中に移スタメにフィルタートランスファーにかけた 。０．５ｍｌずつの画分を採取し、２８０ｎｍの吸光度を記録し、そして所望の 画分をプールした。プールされたＳＫのモル濃度をその２８０ｎｍでの吸光係数 （Ａｚａｏ　１　、０％／１、Ｏｃｍ＝７．５）を用いて決定する。プールされ たＳＫの濃度を、それから、ＰＢＳ緩衝液中で約０．１ｍＭに調整する＊　２０ 　ｍ　Ｍの５ＰＤＰを使用の直前に純粋エタノール中で調製し、ＳＫを様々なモ ル比（即ち、１：１０）で混合する。その混合物を３０分間、２３℃でインキュ ベートする。それを、それから、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，５中に、ＰＢＳ緩衝液 で平衡化されたＰＤ−１０カラムを用いて、フィルタートランスファーするａ　 Ｏ−５ｍ　ｌの画分を採取し、２８０ｎｍでの吸光度測定を記録し、そして所望 の画分（即ち、Ａａ、。が１．８以上）をプールする。そのプールは、２−ピリ ジンジスルフィドに結合されたＳＫ　（ＳＫ−２−ＰＤ）をＰＢＳ緩衝液、ｐＨ ７，５中に含む。

５ＰＤＰのＳＫへの結合を、ＳＫに結合された５ＰＤＰからピリジン−２−チオ ン（Ｐ−２−Ｔ）を遊離させるＤＴＴの添加により定量する。Ｐ−２−Ｔは、３ ４３ｎｍで分光測光的に測定可能である。この測定からＳＫに結合された５ＰＤ Ｐのモル数が計算出来る。遊離された各Ｐ−２−Ｔは、５ＰＤＰのＳＫへの一つ の共有結合を表す。この研究において、１モルのＳＫは、１．２モルの５ＰＤＰ に結合する。

Ｂ、　誘導体化されたＳＫの基底被膜への架橋還元された（遊離のＳＨ基を持つ ）　、Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ架橋された基底被膜（実施例１で述べられた様にして調製 された）を、ＤＴＴを除去するためにＰＢＳで洗う。５ＰＤＰを結合されたＳＫ を、それから、５０．０ｍｇ／ｃｍ”ダクロンで、移植片に加える。その溶液を 、５ＰＤＰ−３Ｋをダクロン移植片上のＳＨ基に結合させるために、室温で一晩 インキユベートする。ＳＫを共有結合的に固定化されたダクロン材料を、それか ら、ＰＢＳ中で洗い、保存する。

Ｃ，ＳＫ活性の測定 ＳＫは、ヒトプラスミノーゲンと混合されたとき、色素Ｓ　−２２５１（Ｘａｂ ｉＶｉｔｒｕｍ、Ａ、Ｂ、、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて定量 され得る活性な蛋白質分解性複合体を形成する。標準曲線を、既知の濃度のＳＫ 　（５００−１０゜ＯＯＯ単位／ｍ１）を用いて作る。６０ｍ１の各標準のアリ コートを１２０ｍ１の０．２ｍＭヒトプラスミノーゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ　）に加え、３７℃で１０分 間インキュベートする。ＳＫ−プラスミノーゲン複合体並びに、分析の邪魔にな る遊離の血漿が形成される。この邪魔は、６０ｍ１の２．０ｍｇ／ｍ１大豆トリ プシン阻害剤を加えることにより除去されるがそれは、すべての遊離の血漿を阻 害する。ＳＫ−プラスミノーゲンの定量分析を、４２０ｍ１の５０ｍＭトリス− ＨＣｌ、１２ｍＭＮａＣ１、ｐＨ７，４中の０．８６ｍＭＳ−２２５１の添加及 び４０５ｎｍでの毎分の吸光度の変化を３７℃で測定することにより行う、固定 化されたＳＫが、この試験で標準溶液に置き換えられる。測定されたこの材料の Ｓ−２２５２上の活性は、それから標準曲線と一致することが示された。

見立上Ａ ウロキナーゼ　ＬＩＫ　の　クロンに・　した　へ盆且１ Ａ、ＵＫの架橋剤による誘導体形成 Ｕ　Ｋ　（Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ、Ａｂｂｏｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｃ ｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）から、ＵＫをＳＫに置き換えて、実施例２Ａ に述べられた様にして誘導体を生成する。

Ｂ、　誘導体化されたＳＫの基底被膜への架橋誘導体化されたＵＫを、実施例２ Ｂに述べられた様にしてダクロンに付着した基底被膜に架橋させる。

Ｃ，ＵＫ活性の試験 固定化されたＵＫの活性を、ｌＯ〜１０００単位（ここでは、ＣＴＡ単位）の濃 度の可溶性のＵＫを用いて作成した標準曲線により見積もる。ＵＫ標準の活性を 、４０５ｎｍの吸光度の変化を５０．０ｍＭトリス−ＨＣ１１２，０ｍＭＮａＣ １，ｐＨ８，８中で、３７℃で監視することにより測定するために、色素Ｓ５− ２４４４（ＫａｂｉＶｉｔｒｕ　ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を ０．３ｍＭで用いる。標準曲線を、こうして作成する。固定化された即ち結合さ れたＵＫを伴う材料の切片を同様の条件下で基質中に置き、吸光度の変化を記録 する。固定化されたＵＫの活性を標準曲線の活性と比較することによりめる。

この発明は、その趣旨又は基本的特性から離れずに、他の特定の形態で具体化さ れるであろう、この具体例はそれ故、すべての点で、説明のためのものであり、 制限するものではない、この発明の範囲は、前記の説明よりは、添付される請求 の範囲により示される。そして、その請求の範囲の意図すること及びそれと同等 の範囲内でのすべての変更は、それ故、その中に包含される。

ｔ　＃トロンボモジュリン ｒｔｚ−ｊ／＋炉・誘導体化されたＴｍ（１）ロンビン ｐｃ、蛋白質Ｃ 活性　（Ｉσｆｍ睡匍閏ヒ） 国際調香謡失

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．下記のものを含む、生体適合性の、血栓抑制性の物質： （ａ）合成の、生体適合性の材料； （ｂ）上記の材料の少なくとも１つの面に付着する少なくとも１つの生体適合性 の基底被膜層；及び（ｃ）上記の基底被膜層に、血栓形成阻害物資への結合能を 持つ成分を介して固定化された、ヒルディン並びにそのアナログ又はフラグメン ト以外の血栓形成阻害物質で、上記の固定化された阻害物質が血栓形成阻害活性 を持つ血栓形成阻害物質。
2. ２．上記の血栓形成阻害物質が、トロンボモジュリン、ストレプトキナーゼ、ウ ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＡＴＰアーゼ、ＡＤＰアー ゼ、５′−ヌクレオチダーゼ、並びにそれらの活性フラグメント、誘導体、アナ ログ及び融合蛋白質、並びにそれらの混合物を含む、請求項１に記載の物質。
3. ３．上記の合成材料がポリマーを含む、請求項１に記載の物質。
4. ４．上記のポリマーが、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリウレタン 、架橋されたコラーゲン、ポリグリコール酸、ポリテトラフルオロエチレン及び それらの混合物から成るグルーブから選ばれる、請求項３に記載の物質。
5. ５．上記のポリマーがポリエチレンテレフクレートを含む、請求項４に記載の物 質。
6. ６．上記の基底被膜層が、蛋白質、ペプチド、リポ蛋白質、糖蛋白質、グリコサ ミノグリカン、ヒドロゲル、合成ポリマー及びそれらの混合物から成るグループ から選ばれる成分を含む、請求項１に記載の物質。
7. ７．上記の基底被膜層の上記の成分が蛋白質を含む、請求項６に記載の物質。
8. ８．上記の蛋白質が、血清アルブミン、フィブロネクチン及びそれらの混合物か ら成るクループから選ばれる請求項７に記載の物質。
9. ９．上記の蛋白質がヒト血清アルブミンを含む、請求項８に記載の物質。
10. １０．上記の蛋白質がヒトフィブロネクチンを含む、請求項８に記載の物質。
11. １１．上記の血栓形成阻害物質を上記の基底被膜層に架橋させる二官能性の架橋 剤を更に含む、請求項１に記載の物質。
12. １２．上記の二官能性の架橋剤がヘテロ二官能性の架橋剤を含む、請求項１１に 記載の物質。
13. １３．上記の二官能性の架橋剤がホモ二官能性の架橋剤を含む、請求項１１に記 載の物質。
14. １４． （ａ）少なくとも１つの基底後腹層を、合成の生体適合性の材料の少なくとも１ つの面へ付着させる工程であって、上記の基底被膜層が血栓形成阻害物質に結合 出来る成分を含み、上記の阻害物質がヒルディン並びにその活性なアナログ又は フラグメント以外のものである付着工程； （ｂ）上記の血栓形成阻害物質を上記の基底被膜層へ固定化する工程であって、 この固定化された阻害物質が血栓形成阻害活性を持つものである固定化工程、か ら成る 生体適合性の、血栓抑制性の物質の製造方法。
15. １５．上記の付着のステップが、基底被膜層の上記の材料の少なくとも１つの面 への付着を含み、上記の基底被膜層が、蛋白質、ペプチド、リポ蛋白質、糖蛋白 質、ヒドロゲル、グリコサミノグリカン、合成ポリマー、及びそれらの混合物か ら成るグループから選ばれる成分を含む、請求項１４に記載の方法。
16. １６．上記の付着のステップが、更に、蛋白質を含む基底被膜層の、上記の材料 の少なくとも１つの面への付着を含む、請求項１５に記載の方法。
17. １７．上記の付着のステップが、更に、基底被膜層の、上記の材料の少なくとも １つの面への付着を含み、上記の基底被膜層が、血清アルブミン、フィブロネク チン、及びそれらの混合物から成るグループから選ばれる蛋白質を含む、請求項 １６に記載の方法。
18. １８．上記の付着のステップが、更に、基底被膜層の合成の生体適合性の高分子 材料の少なくとも１つの面への付着を含む、請求項１４に記載の方法。
19. １９．上記の高分子材料が、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリウレ タン、架橋されたコラーゲン、ポリグリコール酸、ポリテトラフルオロエチレン 、及びそれらの混合物から成るグループから選ばれる、請求項１８に記載の方法 。
20. ２０．上記の固定化のステップが、更に、トロンボモジュリン、ストレプトキナ ーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＡＴＰアーゼ、Ａ ＤＰアーゼ、５′−ヌクレオチダーゼ、並びにそれらの活性なフラグメント、ア ナログ及び融合蛋白質、並びにそれらの混合物から成るグループから選ばれる血 栓形成阻害物質の固定化を含む、請求項１４に記載の方法。
21. ２１．上記の付着のステップが、 （ａ）上記の合成材料を活性化して、それへの上記の基底被膜層の結合を増大さ せ、次いで（ｂ）上記の活性化された合成材料を上記の基底被膜層と、上記の基 底按腹層が上記の活性化された合成材料に結合するのに十分な時間接触させるこ とを含む、 請求項１４に記載の方法。
22. ２２．上記の活性化のステップが、 （ａ）上記の合成材料を上記の材料中の少なくとも１つの化学的に活性な基を使 えるようにする溶液で処理し、次いで （ｂ）上記の処理された合成材料を二官能性の架橋剤と、上記の化学的に活性な 基を上記の試薬に結合させるのに十分な時間接触させることを含む、請求項２１ に記載の方法。
23. ２３．上記の処理のステップが、更に、上記の合成材料を、上記の材料中の少な くとも一つの化学的に活性な基を利用可能にする溶液で処理することを含み、上 記の化学的に活性な基がカルボン酸基である、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．上記の固定化のステップが、 （ａ）上記の血栓形成阻害物質を少なくとも１分子の二官能性の架橋剤と、上記 の試薬が上記の血栓形成阻害物質と架橋するのに十分な時間接触させるステップ において、上記の試薬に架橋された血栓形成阻害物質が血栓形成阻害活性を持つ ように接触させ、次いで （ｂ）上記の血栓形成阻害物質に架橋された上記の試薬を上記の基底被膜に結合 させることを含む、請求項１４に記載の方法：
25. ２５．上記の接触のステップが、更に、上記の基底被膜を少なくとも１分子の上 記の二官能性の架橋剤と、上記の薬剤を上記の基底被膜層に架橋させるのに十分 な時間接触させることを含み、かつ 上記の結合のステップが、更に、上記の血栓形成阻害物質に架橋された試薬を上 記の基底被膜に架橋された試薬に結合させることを含む、請求項２４に記載の方 法。
26. ２６．上記の接触のステップが、更に、上記の血栓形成阻害物質を、ヘテロ二官 能性の架橋剤、ホモ二官能性の架橋剤、及びそれらの混合物から成るクループか ら選ばれる少なくとも１分子の上記の二官能性の架橋剤に接触させることを含む 、請求項２４に記載の方法。
27. ２７．上記の接触のステップが、更に、（ａ）上記の基底被膜に架橋された試薬 を、その上にスルフヒドリル基を露出させるために還元し、（ｂ）上記の阻害物 質に架橋された試薬を上記の還元された基底被膜に架橋された試薬に加えること を含み、かつ、 上記の結合のステップが、上記のスルフヒドリル基及び上記の阻害剤に架橋され た試薬を含む置換反応を含み上記の反応の結果、上記の障害物質の上記の基底被 膜層へのジスルフィド架橋を生じる、請求項２５に記載の方法。
28. ２８． （ａ）血栓形成阻害物質を基底被膜材料に架橋させるステップにおいて、上記の 基底被膜材料が上記の血栓形成阻害物質に結合出来る成分を含み、上記の基底被 膜材料に架橋された阻害物質が血栓形成阻害活性を持ち、かつ上記の血栓形成阻 害物質がヒルディン並びにその活性なアナログ又はフラグメント以外のものであ り、次いで、 （ｂ）上記の血栓形成阻害物質を架橋された基底被腹材料を、合成の生体適合性 の材料の少なくとも１つの面に固定化するステップを含む、生体適合性の血栓抑 制性の物質の製造方法。
29. ２９．上記の架橋のステップが、更に、トロンボモジュリン、ストレプトキナー ゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＡＴＰアーゼ、ＡＤ Ｐアーゼ、５′−ヌクレオチダーゼ並びにそれらの活性なフラグメント、誘導体 、アナログ及び融合蛋白質、並びにそれらの混合物から成るグループから選ばれ る血栓形成阻害物質を上記の基底按腹材料に架橋させることを含む、請求項２８ に記載の方法。
30. ３０．上記の固定化のステップが、更に、上記の血栓形成阻害物質を架橋された 基底被膜材料を合成の生体適合性の高分子材料の少なくとも１つの面に固定化す ることを含む、請求項２８に記載の方法。
31. ３１．上記の高分子材料が、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリウレ タン、架橋されたコラーゲン、ポリグリコール酸、ポリテトラフルオロエチレン 及びそれらの混合物から成るグループから選ばれる、請求項３０に記載の方法。
32. ３２．上記の固定化のステップが、 （ａ）上記の合成材料を活性化して、それへの上記の血栓形成阻害物質を架橋さ れた基底被膜材料の固定化を増大させ、次いで、 （ｂ）上記の活性化された合成材料を上記の血栓形成阻害物質を架橋された基底 被膜材料に、上記の基底被膜材料を上足の活性化された合成材料に固定化させる のに十分な時間接触させることを含む請求項２８に記載の方法。
33. ３３．上記の血栓形成阻害物質と結合性の上記の基底被膜材料の成分が、蛋白質 、ペプチド、リポ蛋白質、糖蛋白質、ヒドロゲル、グリコサミノグリカン、合成 ポリマー、及びそれらの混合物から成るグループから選ばれる請求項２８に記載 の方法。
34. ３４．上記の血栓形成阻害物質と結合性の上記の基底被膜材料の成分が蛋白質を 含む、請求項３３に記載の方法。
35. ３５．上記の血栓形成阻害物質と結合性の上記の基底被腹材料の成分が、血清ア ルブミン、フィブロネクチン、及びそれらの混合物から成るグループから選ばれ る蛋白質を含む、請求項３４に記載の方法。
36. ３６．上記の活性化のステップが、 （ａ）上記の合成材料を、上記の合成材料上の少なくとも１つの化学的に活性な 基を結合のために利用可能にする溶液で処理し、次いで、 （ｂ）上記の処理された合成材料を二官能性の架橋剤と、上記の化学的に活性な 基を上記の架橋剤に架橋させるのに十分な時間接触させることを含む請求項３２ に記載の方法。
37. ３７．上記の架橋のステップが、更に、（ａ）上記の血栓形成阻害物置を少なく とも１分子の二官能性の架橋剤と、上記の試薬を上記の血栓形成阻害物質に架橋 させるのに十分な時間接触させ、次いで、 （ｂ）上記の血栓形成阻害物質と架橋された架橋剤を上記の基底被腹材料に付着 させること、を含む請求項２８に記載の方法。
38. ３８．上記の架橋のステップが、更に、（ａ）上記の基底被膜材料を少なくとも １分子の二官能性の架橋剤と、上記の架橋剤を上記の基底被膜材料に架橋させる のに十分な時間接触させ、次いで、 （ｂ）上記の基底被膜と架橋された架橋剤を上記の血栓形成阻害物質に付着させ ること、を含む、請求項２８に記載の方法。
39. ３９．上記の接触のステップが、更に、上記の血栓形成阻害物質を、ヘテロ二官 能性の架橋剤、ホモ二官能性の架橋剤、及びそれらの混合物から成るグループか ら選ばれる少なくとも１分子の二官能性の架橋剤と接触させることを含む、請求 項３８に記載の方法。