WO2023041275A1 - Besiedelung von oberflaechen mit biologischen zellen - Google Patents

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WO2023041275A1
WO2023041275A1 PCT/EP2022/072853 EP2022072853W WO2023041275A1 WO 2023041275 A1 WO2023041275 A1 WO 2023041275A1 EP 2022072853 W EP2022072853 W EP 2022072853W WO 2023041275 A1 WO2023041275 A1 WO 2023041275A1
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biological cells
hfm
azide
dbco
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PCT/EP2022/072853
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Meltem AVCI-ADALI
Denis Canjuga
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet
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    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a surface that can be colonized with biological cells, a device with a surface that can be colonized with biological cells, and a method for colonizing a surface with biological cells.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • extracorporeal membrane oxygenation is performed by continuously pumping the patient's blood through a gas-permeable membrane oxygenator (artificial lung) that mimics the gas exchange process of the lungs.
  • Standard blood oxygenators consist of bundles of microporous hollow fiber membranes (HFM), most commonly made of polypropylene (PP) or polymethylpentene (PMP), with a large surface area ( ⁇ 2 m 2 ) to achieve clinically required O2 and CO2 transport rates.
  • HFM microporous hollow fiber membranes
  • PP polypropylene
  • PMP polymethylpentene
  • heparin [Pappalardo, F., et al., Bioline heparin-coated ECMO with bivalirudin anticoagulation in a patient with acute heparin-induced thrombocytopenia: the immune reaction appeared to continue unabated. Perfusion, 2009. 24(2): pp. 135-137] or poly-2-methoxyethyl acrylate (PMEA) [Eisses, MJ, et al., Effect of polymer coating (poly 2-methoxyethyl acrylate) of the oxygenator on hemostatic markers during cardiopulmonary bypass in children. J Cardiothorac Vase Anesth, 2007. 21(1): pp. 28-34.].
  • the coating of surfaces with polydopamine is known, for example, from CN 110545754, and the coating with polymers from US Pat. No. 6,309,660. However, both approaches have not proven themselves in practice.
  • heparin The most common approach is to coat the surfaces with heparin, as described for example in WO 2020/190214.
  • the heparin can detach from the surface and lead to the formation of thrombi.
  • long-term exposure to heparin carries the risk that the patient will develop heparin-induced thrombocytopenia (HIT).
  • HIT heparin-induced thrombocytopenia
  • PF4 platelet factor 4
  • cRGD Moller, L, et al., Towards a biocompatible artificial lung: Covalent functionalization of poly(4-methylpent-1-ene) (TPX) with cRGD pentapeptide. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2013. 9: pp. 270-277] or fibronectin [Cornelissen, CG, et al., Fibronectin coating of oxygenator membranes enhances endothelial cell attachment. Biomed Eng Online, 2013. 12:p.7] to aid in endothelialization.
  • a method for producing a surface that can be colonized with biological cells in which the disadvantages of the prior art are avoided or at least reduced.
  • a surface should be provided that can be populated with biological cells in such a way that a high degree of biocompatibility is achieved.
  • This object is achieved by a method for producing a surface that can be colonized with biological cells, which has the following steps:
  • a “surface” includes any area that is to be populated with biological cells, for example endothelial cells. This includes, but is not limited to, surfaces of medical products or medical devices, such as artificial lungs of oxygenators, e.g. the walls of membranes where gas exchange takes place. Plastic or metal surfaces are also included according to the invention.
  • biological cells means any type of cell, such as endothelial cells, but also stem cells, including mesenchymal stem cells, and progenitor cells thereof or cells derived therefrom, such as endothelial progenitor cells (EPCs) or endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells (“iPSC-derived endothelial cells”).
  • EPCs endothelial progenitor cells
  • iPSC-derived endothelial cells induced pluripotent stem cells
  • “Silanization” in step 2 of the method according to the invention is understood as meaning the chemical attachment of a silane compound to the surface. This can be done, for example, but not exclusively, by reacting the free hydroxyl groups with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES).
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • step 3 of the method of the invention the reactant capable of reacting in a copper-free click reaction with azides, such as, but not limited to, dibenzocyclooctyne (DBCO), is conjugated to the silanized surface using methods known to those skilled in the art.
  • azides such as, but not limited to, dibenzocyclooctyne (DBCO)
  • a “click reaction”, also synonymously referred to as “click chemistry”, means a reaction between azide and alkyne to provide a 1,5-disubstituted 1,2,3-triazole. According to the invention, this takes place without the use of copper or other cytotoxic catalysts under physiological conditions, e.g. in the cell culture medium. This represents a departure from the "click responses" used in the prior art.
  • Cu-AAC copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions
  • the surfaces produced according to the invention are now capable of reacting with azides in a copper-free click reaction and thereby covalently binding structures which expose azide groups (N3) to the surface.
  • azide groups N3
  • endothelial cells can be functionalized in such a way that they have glycoproteins with azide groups on their surfaces. These groups can be covalently conjugated to the reactant such as DBCO in a copper-free click reaction.
  • the method according to the invention thus provides surfaces which can be colonized efficiently and in a targeted manner with azide-modified biological cells. Because this reaction is very specific, only those biological cells that expose azide groups are bound to the surface. This prevents the non-specific binding of undesired cell populations.
  • the method according to the invention can also be used to bind the patient's own endothelial progenitor cells (EPCs) or endothelial cells which are derived from induced pluripotent stem cells (“iPSC-derived endothelial cells”) to desired surfaces of blood-contacting materials.
  • EPCs endothelial progenitor cells
  • iPSC-derived endothelial cells endothelial cells which are derived from induced pluripotent stem cells
  • the reactant of step 3 is selected from the group consisting of: cycloalkyne, cycloalkyne ester, phosphine and phosphine ester.
  • This measure has the advantage that those reactants are used which are suitable for being able to react with azides in a copper-free click reaction and are therefore particularly functional according to the invention.
  • phosphine groups react with the azide groups in a so-called Staudinger reaction.
  • This reaction shows slow reaction kinetics of about 10' 3 M' 1 s' 1 .
  • Cycloalkynes react with the azide groups in a so-called 'strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction' (SPAAC).
  • SPAAC 'strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction'
  • the second-order reaction has a moderate rate constant of 10' 2 — 1 M' 1 s' 1 .
  • the cycloalkyne dibenzocyclooctyne (DBCO) and/or the cycloalkyne ester DBCO-PEG4-NHS ester is used as the reactant.
  • DBCO cycloalkyne dibenzocyclooctyne
  • DBCO-PEG4-NHS ester is used as the reactant.
  • step 1 the surface containing hydroxyl groups is provided by oxygen plasma treatment of a surface.
  • This measure has the advantage that a method is used that is particularly suitable for generating hydroxyl groups on the surface.
  • the surface is one of a medical device, preferably selected from the group consisting of: artificial lung, oxygenator, artificial kidney, prosthesis, vascular prosthesis, stent, artificial heart.
  • This measure has the advantage that the method is used where the colonization of surfaces with biological cells for the functionality and Biocompatibility of the devices is particularly important. When used in patients, it can thus be prevented that the device is recognized as "foreign".
  • the surface is a surface of a hollow fiber membrane (HFM), preferably a polymethylpentene or polypropylene HFM.
  • HFM hollow fiber membrane
  • This measure has the advantage that the method is used for blood-contacting surfaces that are particularly relevant in practice, which are used, for example, in oxygenators.
  • the biological cells are endothelial cells.
  • the biological cells have azide groups (-N3) on their surface.
  • Another object of the invention relates to a device with a surface that can be colonized with biological cells, preferably an artificial lung, an oxygenator, an artificial kidney, a prosthesis, a vascular prosthesis, a stent, an artificial heart or a hollow fiber membrane (HFM) such as a polymethylpentene or polypropylene HFM, wherein the surface has a reactant that reacts with azides in a copper-free click reaction.
  • biological cells preferably an artificial lung, an oxygenator, an artificial kidney, a prosthesis, a vascular prosthesis, a stent, an artificial heart or a hollow fiber membrane (HFM) such as a polymethylpentene or polypropylene HFM, wherein the surface has a reactant that reacts with azides in a copper-free click reaction.
  • HFM hollow fiber membrane
  • the surface which can be colonized with biological cells was preferably obtained using the method according to the invention.
  • the features, properties, advantages and embodiments of the manufacturing method according to the invention also apply in
  • Another object of the present invention relates to a method for colonizing a surface with biological cells, which has the following steps:
  • the surface having a reactant reacting with azides in a copper-free click reaction was obtained using the production method according to the invention.
  • the biological cells which have azide groups (-N3) on their surface were obtained by incubating biological cells with an azide sugar which is preferably selected from the group consisting of: Ac4ManNAz (N- azidoacetylmannosamine-tetraacylated), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac4GlcNAz), N-azidoacetylgalactosamine-tetraacylated (Ac4GalNAz), and other azide-functionalized glycoconjugates.
  • an azide sugar which is preferably selected from the group consisting of: Ac4ManNAz (N- azidoacetylmannosamine-tetraacylated), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac4GlcNAz), N-azidoacetylgalactosamine-tetraacylated (Ac4GalNAz), and other azide-functionalized
  • nucleic acid By this measure, biological cells are obtained in an advantageous manner, which expose azide groups (-N3) on their surface.
  • the azide sugars specified are particularly suitable for the functionalization of the cells. Like their natural analogues, the azide sugars are taken up into the cells and incorporated into glycoproteins. This causes the cells to have glycoproteins on the cell surface that are provided with azide groups (-N3). These groups can be covalently conjugated to the surface using click chemistry.
  • Incubating the modified cells with the modified HFMs results in a bio-orthogonal reaction, the alkyne group of the reactant or DBCO reacts with the azide on the surface of the cells. This happens very specifically, so only modified cells with azide molecules can bind to the reactants on the membrane. Binding of the cells to the membrane and further incubation in cell culture medium leads to proliferation and ultimately colonization of the membrane with a confluent monolayer of cells.
  • the biological cells are endothelial cells.
  • the surfaces are populated with cells that are of particular importance for the functionality of important medical surfaces or devices.
  • Particularly suitable are primary endothelial cells isolated from umbilical cord blood, so-called Human Umbilical Vein Endothelial Celis (HUVECs), which are cultivated in VascuLife® EnGS Endothelial Medium Complete Kit until they are endothelialized.
  • HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Celis
  • colonization with the endothelial cells can take place in EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit.
  • Polymethylpentene HFMs (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Germany), APTES, methanol, toluene (Sigma-Aldrich, Darmstadt), DBCO-PEG4-NHS ester (Jena Bioscience, Jena, Germany), Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), (Invitrogen), N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz, Sigma Aldrich, Germany), DMSO (Sigma-Aldrich).
  • Fig. 1 Schematic representation of the functionalization of the PMP hollow fiber membranes (HFMs).
  • HFMs PMP hollow fiber membranes
  • Fig.2 Detection of the generated functional groups on PMP hollow fiber membranes (HFMs).
  • Fig. 3 Result of the SEM analysis. There are no visual differences on the
  • FIG. 6 Metabolic labeling of HUVECs with Ac4ManNAz and cell viability analysis. 2x10 5 HUVECs were incubated for 48 h with and without 50 pM Ac4ManNAz.
  • B) Cells were incubated for 1 hour with 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 and, after washing with DPBS, flow cytometric analyzes were performed. Results are presented as mean ⁇ SD (n 3).
  • Fig. 8 Analysis of the response of the endothelialized surface to an inflammatory stimulus using qRT-PCR.
  • Endothelialized HFM were treated with 50 ng/ml TNF- ⁇ and the expression of adhesion molecules (E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1) was determined by qRT-PCR.
  • TAT thrombin-antithrombin III complex
  • sC5b-9 complement system
  • PMN- Elastase inflammation
  • HIVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells
  • HUVECs (ATCC®, Manassas, USA) were seeded in T75 cell culture flasks coated with 0.1% gelatin and cultured at 37°C and 5% CO2 in Vasculife® EnGS EC culture medium (CellSystems, Troisdorf, Germany) with VascuLife EnGS LifeFactors Kit, 50 mg/ml gentamicin and 0.05 mg/ml amphotericin B (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). The medium was changed every 3 days. After reaching 80% confluency, the cells were detached with trypsin/EDTA (0.04%/0.03%, PromoCell, Heidelberg, Germany).
  • the surface of polymethylpentene HFMs (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Germany) was coated in a three-stage process ( Figure 1). First the surface was treated with 02 plasma and in the second step the silanization was carried out. In the third step, dibenzylcyclooctyne-PEG4-NHS-ester (DBCO-PEG4-NHS-ester) was conjugated to the silanized surface.
  • DBCO-PEG4-NHS-ester dibenzylcyclooctyne-PEG4-NHS-ester
  • PMP membranes were cut to a size of 3 x 3 cm and treated with 02 plasma (Denta Pias®, Diener electronic, Ebhausen, Germany) for 30 min at a pressure of 0.3 mbar ( ⁇ 0.20 mbar ) and an output of 80% ( ⁇ 5%) hydroxyl groups.
  • the HFMs were then incubated for 30 minutes in toluene (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) with 2% (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES, Sigma-Aldrich) on a shaker at 20 rpm.
  • the membranes were then sonicated in 100% toluene, 50% toluene/50% methanol, and 100% methanol for 2 minutes each to remove unbound or weakly bound APTES. After drying, the membranes were soaked in 400 M DBCO-PEG4-NHS-ester (Jena Bioscience, Jena, Germany) with Dulbecco's phosphate-buffered saline for 30 minutes (DPBS) (Invitrogen, Carlsbad, USA) to introduce cyclooctyne groups and washed three times with fresh DPBS.
  • DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline for 30 minutes
  • the membranes were incubated for 5 hours in 0.5 mM methyl orange (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) at 37°C on a shaker, followed by washing three times with 1 mM HCl -Solution. Desorption of bound methyl orange from the HFM surface was performed with 0.4 mL of a 1 mM NaOH solution overnight at 37°C on a shaker. For detection of methyl orange, 100 ⁇ l of the desorption solution was placed in triplicate in a 96-well plate. The absorbance was measured at 465 nm with a microplate reader (Eon Synergy 2, Bio Tek Instruments Inc., Winooski USA).
  • the HFM in DPBS without Ca 2+ /Mg 2+ were incubated for 1 hour with 80 pg/ml Cy3-azide (Sigma-Aldrich) to convert the Cy3-azide bind to the DBCO-functionalized HFM surface.
  • the HFMs were then washed five times with 100% ethanol and the staining of the membranes was detected using fluorescence microscopy (Axiovert 135, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).
  • the fluorescence intensity on the membranes was quantified using a microplate reader (Mithras 940, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) at an excitation wavelength of 500 nm and an emission wavelength of 600 nm. HFM with no treatment and with APTES treatment only were used as controls.
  • HUVECs 1 .4 Metabolic labeling of HUVECs with azide groups and detection of the azide label
  • 2 x 10 5 HUVECs were seeded per well of a 6-well plate and tetraacylated with or without 50 pM N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz, Sigma Aldrich) in 2 ml medium for Treated with 5% CO2 at 37°C for 48 h.
  • the cells were washed with DPBS without Ca 2+ /Mg 2+ and with 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 (Jena Bioscience, Germany) in DPBS with Ca 2+ /Mg 2+ for 1 h at 37° C and 5% CO2.
  • the cells were washed three times with 10 ml DPBS, detached with trypsin/EDTA (0.04%/0.03%) and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes.
  • the cell pellet was resuspended in 0.5 ml DPBS and the Cy3 labeling of 10,000 cells was analyzed by flow cytometry (FACS SCAN, BD, Heidelberg, Germany).
  • HUVECs The influence of metabolic labeling on the viability of HUVECs was examined 48 hours after labeling with 50 pM Ac4ManNAz using the PrestoBlue assay (Invitrogen, Carlsbad, USA). For this purpose, 500 pL 1 ⁇ Presto Blue cell viability reagent were added per well of a 6-well plate and incubated at 37° C. for 1.5 h. The fluorescence intensity of 100 pL of supernatant was measured in triplicate at an excitation wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 600 nm using a multimode microplate reader (Mithras LB 940, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany).
  • DBCO-coated and uncoated PMP membranes (3 x 3 cm) were incubated with 5.2 x 10 6 Ac4ManNAz-labeled HUVECs in 13 ml of EGMTM-2 endothelial cell growth medium BulletKitTM (Lonza, Basel, Switzerland). Incubation was carried out for 24 hours at 10 rpm with a rotator (Phoenix Instrument, Garbsen, Germany) in one humidified incubator with 5% CO2 at 37°C. After the rotary incubation, the membranes were placed in each well of a 6-well plate and further incubated for 1 or 5 days under static conditions.
  • the HLIVECs attached to the membranes were stained with 250 ng/mL calcein acetoxymethyl ester (Calcein-AM; Invitrogen) for 10 minutes at 37°C.
  • the stained cells were detected using fluorescence microscopy (Axio 135, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).
  • fluorescence signal on the surface of the HFMs before and after calcein-AM staining was detected at an excitation wavelength of 494 nm and an emission wavelength of 517 nm using a multimode microplate reader (Mithras LB 940, Berthold Technologies).
  • the formation of a confluent endothelial cell monolayer and the presence of cell-cell contacts were detected by staining the cells with an anti-human VE-cadherin antibody.
  • the membranes coated with DBCO-PEG4-NHS ester and endothelialized were washed with DPBS and fixed in 4% paraformaldehyde (v/v) for 10 minutes at RT. After washing with DPBS, blocking was performed with Tris-buffered saline (50 mM Tris base, 150 mM sodium chloride, pH 7.5) containing 5% goat serum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) for 30 minutes at RT.
  • the membranes were washed with DPBS and with the primary antibody mouse anti-human VE-cadherin (CD144 (16B1), eBioscience, Invitrogen, USA) diluted 1:100 in DPBS with 1% bovine serum albumin (BSA) for 1 h at RT incubated. The membranes were then washed three times with DPBS and incubated with 1:400 diluted goat anti-mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody (ThermoFisher, USA) labeled with Alexa Fluor 488 (ThermoFisher, USA) for 1 h in PBS with 1% BSA .
  • the cell nuclei were stained for 5 minutes with DAPI (Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany) diluted 1:2000 in DPBS. As a negative control, the membranes were also incubated with an isotype control antibody. The stained cells were detected using fluorescence microscopy (Axio 135, Carl Zeiss AG, Aoberkochen, Germany). 1 .8 Reactivity of the endothelium to HFMs to the inflammatory stimulus
  • Endothelialized HFMs were incubated for 4 hours without or with 50 ng/mL tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ , Sigma-Aldrich) in EGMTM-2 endothelial cell growth medium without hydrocortisone. After incubation, the HFMs were washed twice with DPBS and total RNA isolated. Expression of the activation markers, endothelial leukocyte adhesion molecule 1 (E-selectin), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), was detected by qRT-PCR. The mRNA levels were normalized to the GAPDH mRNA levels and the results were presented relative to the expression levels in endothelialized HFM without TNF- ⁇ stimulation.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • RNA was isolated with the Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, Kunststoff, Germany) according to the manufacturer's instructions. 300 ng of RNA was reverse transcribed into DNA copies (cDNA) using the iScript Kit (Bio-Rad). The transcripts were amplified using the primers listed in Table 1 in a final concentration of 300 nM under the following conditions: one cycle of 3 min at 95°C, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 72°C for 10 s After 40 cycles, a melting curve analysis was performed to detect the specific amplicons.
  • ICAM-1 CTTGAGGGCACCTACCTCTGTC CGGCTGTCTACCACAGTGATG
  • VCAM-1 ACACTTTATGTCAATGTTGCCCC GAGGCTGTAGCTCCCCGTTAG
  • Tubes containing (0.3 mL citrate solution/3 mL blood, 0.106 M CeHsNasO? x 2H2O, Sartstedt) were used to detect PMN elastase and TAT.
  • blood was collected in 2.7 mL CTAD tubes containing 270 pL of 0.109 M CTAD solution containing buffered sodium citrate, theophylline, adenosine and dipyridamole (BD Vacutainer CTAD, Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany ), transferred and placed on ice for 15 minutes.
  • the EDTA and CTAD preparations were centrifuged at 2500 xg for 20 minutes at 4°C.
  • the citrated blood preparations were centrifuged at 1800 ⁇ g for 18 min at RT.
  • the blood plasma each Sample was snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until further investigation.
  • the numbers of erythrocytes, leukocytes and thrombocytes were measured in the collected blood samples with an automatic cell counting system (ABX Micros 60, HORIBA Medical, Minami-ku, Kyoto, Japan).
  • thrombin-antithrombin III complex TAT
  • sC5b-9 complement system
  • ß-thromboglobulin ß-thromboglobulin
  • neutrophils commercially available ELISA Kits (enzyme-linked immunosorbent assays) used according to manufacturer's instructions.
  • sC5b-9 (MicroVueTM Complement, Quidel Germany GmbH & AnDiaTec Division, Kornwestheim, Germany), TAT (Enzygnost® TAT micro, Siemens Healthcare, Er Weg, Germany), polymorphonuclear (PMN) elastase (Demeditec Diagnostics, Kiel, Germany) and ⁇ -TG (Asserachrom® ⁇ -TG, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ, USA) ELISAs.
  • TAT Enzygnost® TAT micro, Siemens Healthcare, Er Weg, Germany
  • PMN polymorphonuclear
  • ⁇ -TG Assserachrom® ⁇ -TG, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ, USA
  • Uncoated, DBCO-coated, or endothelialized HFMs were incubated with blood as described above. After incubating the HFMs with human blood for 90 minutes, the blood was collected and diluted 1:5 with DPBS. The samples were treated for 30 minutes at RT with 10 ⁇ l mouse anti-human CD41-FITC antibody (company) for the detection of platelets and 10 ⁇ l mouse anti-human CD62P-PE antibody (BD Biosciences, Heidelberg, Germany ) to detect platelets expressing P-selectin (CD62P), indicating platelet activation. Samples were fixed with 0.5% paraformaldehyde and platelet activation analyzed by flow cytometry. Scanning electron microscopy (SEM) analyzes of the HFM surfaces
  • HFMs were rinsed with 0.9% saline (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany) and immersed in 2.5% glutaraldehyde (Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany) fixed in DPBS. After the fixation step, the samples were washed with DPBS for 15 min at RT and then dehydrated in 15 min steps at RT with an ascending ethanol series (40%-100% ethanol; Merck-Millipore, Darmstadt, Germany).
  • 0.9% saline Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
  • glutaraldehyde Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany
  • Hydroxyl groups on the surface of materials can react with chemical groups on other molecules to form a covalent bond.
  • the free hydroxyl groups react with APTES.
  • Diluting APTES in anhydrous toluene is a widely used method in silanization.
  • the membranes were incubated for 30 min in 2% APTES (APTES, Sigma-Aldrich, Darmstadt) diluted in toluene (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) at 20 rpm and RT.
  • Three washing steps were then carried out in an ultrasonic bath for 2 min to remove unbound or weakly bound APTES.
  • DBCO Conjugation (Step 3 in Figure 1)
  • the silanized membranes were then diluted with 400 pM DBC0-PEG4-NHS ester (Jena Bioscience, Jena, Germany) in Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Invitrogen) and incubated for 30 min at RT. After the incubation, three washing steps were carried out in DPBS for 5 min each.
  • the DBCO used contains a PEG4 chain to extend the DBCO to enable easier binding to the metabolically modified cells. Furthermore, there is an activated carboxylic acid (-NHS ester) on the DBCO used, which can react with amino groups from APTES and thus form covalent bonds.
  • the pressure was monitored with a pressure gauge (RS 1113, RS Components, Corby, UK) connected to the system.
  • the cells were washed with DPBS without Ca 2+ /Mg 2+ and with 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 (Jena Bioscience, Germany) in DPBS with Ca 2+ /Mg 2+ for 1 h at 37°C and 5% CO2 incubated.
  • the cells were then washed three times with 1 ml DPBS, detached with trypsin/EDTA (0.04%/0.03%) and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 min.
  • the cell pellet was resuspended in 0.5 ml DPBS and the Cy3 labeling of 10,000 cells was analyzed by flow cytometry (FACS SCAN, BD, Heidelberg, Germany).
  • the HLIVECs were treated with 50 pM Ac4ManNAz for 48 hours. To determine if Na groups are present on the cell surface, cells were then incubated with 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 for 1 hour. The presence of N3 on the cell surface led to conjugation of DBCO and labeling of cells with Cy3 ( Figure 6A). The cells without Ac4ManNAz treatment were not stained. In addition, flow cytometric analyzes showed that about 98% of the cells analyzed were Cy3-positive (FIG. 6B). Treatment of the cells with Ac4ManNAz had no effect on the viability of the HUVECs ( Figure 6C).
  • DBCO-coated and uncoated HFMs were incubated with 5.2 x 10 6 Ac4ManNAz-labeled HUVECs for 24 hours under rotation and then for 24 hours under static conditions.
  • the attached HUVECs were detected by staining with calcein AM ( Figure 7A). Fluorescence microscopy analysis showed that Ac4ManNAz-treated HUVECs efficiently bound to the DBCO-functionalized HFM surface and resulted in almost complete endothelialization.
  • the detection of the fluorescence intensity of the HFMs also showed that the DBCO functionalization led to a significantly increased adhesion of the HUVECs compared to uncoated or APTES-coated HFMs (Figure 7B).
  • the tight cell-cell contacts of HUVECs on the HFM membranes were detected by staining with an anti-VE-cadherin antibody ( Figure 7C).
  • E-selectin The expression of the adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 was analyzed after stimulation of the endothelial layer on HFMs with TNF- ⁇ and compared with the non-stimulated endothelial layer using qRT-PCR (Figure 8).
  • the stimulation of Endothelial layer with TNF- ⁇ resulted in significantly higher expression of E-selectin (199-fold), VCAM-1 (328-fold) and ICAM-1 (162-fold) compared to the unstimulated endothelial layer. This demonstrated the responsiveness of the generated endothelial layer to HFMs.
  • the P-selectin expression on the platelets was also analyzed as a marker for platelet activation. As shown in FIG. 9, a significantly higher number of activated platelets was detected on uncoated and DBCO-coated HFM compared to the blood samples without HFM. However, the endothelialized membranes prevented platelet activation.
  • thrombin-antithrombin III complex TAT
  • ⁇ -thromboglobulin a marker of platelet activation
  • the inventors provide a method by which biological cells can be covalently attached to surfaces in a very specific and selective manner. This enables efficient colonization of the surfaces, for example with endothelial cells, in order to prevent the surfaces from being recognized as "foreign".
  • the method can also be used to attach patient EPCs or "iPSC-derived" endothelial cells to desired surfaces of blood-contacting materials.
  • Off-the-shelf products can be manufactured that can be populated with the patient's own endothelial cells if required. The conjugation of the cells to the surface takes place without a catalyst under physiological conditions.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, eine Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, und ein Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen.

Description

Besiedelung von Oberflächen mit biologischen Zellen
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, eine Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, und ein Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen.
[0002] Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist weltweit die dritthäufigste Todesursache, und die Lungentransplantation ist die einzige kurative Behandlungsoption für Patienten mit Lungenerkrankungen im Endstadium, wie der COPD, interstitiellen Lungenerkrankung, zystischen Fibrose und Lungenödemen. Im Jahr 2017 konnten nur 77 % der für eine Lungentransplantation angemeldeten Patienten in Deutschland eine Lunge erhalten, was bedeutet, dass 23 % dieser Patienten auf der Warteliste jedes Jahr sterben. Selbst nach erfolgreicher Transplantation liegt die mediane Überlebensrate für Lungenempfänger nur bei 5,3 Jahren. Es besteht also ein dringender Bedarf an künstlichen Lungen, die die Funktion der Lunge für einen längeren Zeitraum übernehmen können, um die Zeit bis zur Transplantation zu überbrücken. [0003] Bei schwerem Atemversagen wird die extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) durchgeführt, indem das Blut des Patienten kontinuierlich durch einen gasdurchlässigen Membranoxygenator (künstliche Lunge) gepumpt wird, der den Gasaustauschprozess der Lunge nachahmt. Standard-Blutoxygenatoren bestehen aus Bündeln mikroporöser Hohlfasermembranen (HFM), die meist aus Polypropylen (PP) oder Polymethylpenten (PMP) bestehen und eine große Oberfläche (~ 2 m2) haben, um die klinisch erforderlichen Transportraten für O2 und CO2 zu erreichen. In den meisten künstlichen Lungen fließt der Sauerstoff durch die Lumina der Hohlfasern und das Blut durch die Zwischenräume im Hohlfaserbündel.
[0004] Trotz der Behandlung der Patienten während der ECMO mit gerinnungshemmenden Medikamenten, meist Heparin, führt die Fremdmaterialoberfläche der künstlichen Lungen immer noch zu einer Aktivierung des Gerinnungs- und Komplementsystems und erschwert deren langfristigen Einsatz, so dass sie derzeit nur für einen sehr begrenzten Zeitraum von Tagen bis wenigen Wochen verwendet werden können [Gulack, B.C., S.A. Hirji, and M.G. Hartwig, Bridge to lung transplantation and rescue post-transplant: the expanding role of extracorporeal membrane oxygenation. J Thorac Dis, 2014. 6(8): S. 1070-1079], Seit Jahrzehnten wird intensiv an der Verbesserung der Hämokompatibilität von blutkontaktierenden künstlichen Geräten geforscht [de Mel, A., B.G. Cousins, and A.M. Seifalian, Surface modification of biomaterials: a quest for blood compatibility. Int J Biomater, 2012. 2012: S. 707863; Wendel, H.P. and G. Ziemer, Coating-techniques to improve the hemocompatibility of artificial devices used for extracorporeal circulation. Eur J Cardiothorac Surg, 1999. 16(3): S. 342-350], Bisher wurden blutberührende Oxygenatoroberflächen z.B. mit Phosphorylcholin [Pieri, M., et al., A new phosphorylcholine-coated polymethylpentene oxygenator for extracorporeal membrane oxygenation: a preliminary experience. Perfusion, 2013. 28(2): S. 132-137], Heparin [Pappalardo, F., et al., Bioline heparin-coated ECMO with bivalirudin anticoagulation in a patient with acute heparin-induced thrombocytopenia: the immune reaction appeared to continue unabated. Perfusion, 2009. 24(2): S. 135-137] oder Poly-2-methoxyethylacrylat (PMEA) [Eisses, M.J., et al., Effect of polymer coating (poly 2-methoxyethylacrylate) of the oxygenator on hemostatic markers during cardiopulmonary bypass in children. J Cardiothorac Vase Anesth, 2007. 21(1): S. 28-34.] beschichtet. [0005] Die Beschichtung von Oberflächen mit Polydopamin ist bspw. aus der CN 110545754 bekannt, die Beschichtung mit Polymeren aus der US 6,309,660. Beide Ansätze haben sich aber in der Praxis nicht bewährt.
[0006] Der gängigste Ansatz besteht darin, die Oberflächen mit Heparin zu beschichten, wie z.B. beschrieben in der WO 2020/190214. Mit der Zeit kann sich das Heparin jedoch von der Oberfläche lösen und zur Bildung von Thromben führen. Zusätzlich zu den Komplikationen wie Blutungen birgt die Langzeitexposition gegenüber Heparin das Risiko, dass der Patient eine Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) entwickelt. Dabei werden Antikörper gegen den Komplex Heparin und Plättchenfaktor 4 (PF4) gebildet, die durch eine starke Aktivierung der Blutplättchen, eine erhöhte Thrombinbildung und -aktivierung zu schweren thromboembolischen Komplikationen führen können.
[0007] Wie in einem Übersichtsartikel [Avci-Adali, M., et al., Current concepts and new developments for autologous in vivo endothelialisation of biomaterials for intravascular applications. European cells & materials, 2011. 21 : S. 157-176] ausführlich beschrieben, wurden verschiedene Fängermoleküle und Strategien zur Endothelialisierung blutberührter Implantate eingesetzt. Bislang wurden HFM mit Heparin/Albumin [Wiegmann, B., et al., Developing a biohybrid lung - sufficient endothelialization of poly-4-methly-1 -pentene gas exchange hollow-fiber membranes. J Meeh Behav Biomed Mater, 2016. 60: S. 301-311], cRGD [Moller, L, et al., Towards a biocompatible artificial lung: Covalent functionalization of poly(4-methylpent-1-ene) (TPX) with cRGD pentapeptide. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2013. 9: S. 270-277] oder Fibronektin [Cornelissen, C.G., et al., Fibronectin coating of oxygenator membranes enhances endothelial cell attachment. Biomed Eng Online, 2013. 12: S. 7] beschichtet, urn die Endothelialisierung zu unterstützen. Diese Strategien haben jedoch mehrere Einschränkungen, z.B. kann die Beschichtung der Oberflächen mit Fibronektin zu einer unspezifischen Anlagerung unerwünschter Zellen führen, und die nicht-enthothelialisierten Bereiche können Thrombozyten aktivieren und zu einer Thrombose führen. Auch die Verwendung von cRGD zur Bindung von Endothelzellen ("ECs") ist unspezifisch. Mehrere Zellen, darunter auch Thrombozyten, haben cRGD-bin- dende Integrine auf ihrer Oberfläche, was zu einer unspezifischen Adhäsion von Zellen an der blutberührenden Oberfläche führen kann. Es bedarf also noch einer effizienten Strategie, um blutberührte Bereiche mit ECs zu endothelialisieren und die Hämokompati- bilität der künstlichen Lungen zu verbessern.
[0008] Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche bereitzustellen, die mit biologischen Zellen besiedelbar ist, bei dem die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden oder zumindest reduziert werden. Insbesondere soll solch eine Oberfläche bereitgestellt werden, die sich derart mit biologischen Zellen besiedeln lässt, dass ein hohes Maß an Biokompatibilität erreicht wird.
[0009] Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche gelöst, das folgende Schritte aufweist:
1. Bereitstellen einer Hydroxylgruppen (-OH) aufweisenden Oberfläche,
2. Silanisierung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche,
3. Konjugation eines in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Re- aktanden an die silanisierte Oberfläche.
[0010] Erfindungsgemäß umfasst eine "Oberfläche" jegliche Fläche, die mit biologischen Zellen, bspw. Endothelzellen, besiedelt werden soll. Darunter fallen u.a., aber nicht ausschließlich, Flächen von Medizinprodukten oder medizinischen Vorrichtungen, wie künstlichen Lungen der Oxygenatoren, bspw. die Wandungen von Membranen, an denen der Gasaustausch stattfindet. Auch Kunststoff- oder Metalloberflächen sind erfindungsgemäß umfasst.
[0011] Erfindungsgemäß wird unter "biologischen Zellen" jede Art von Zelle verstanden, wie bspw. Endothelzellen, aber auch Stammzellen, einschließlich mesenchymale Stammzellen, sowie Vorläuferzellen hiervon oder davon abgeleitete Zellen, wie endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) oder Endothelzellen, die sich von induzierten pluripotenten Stammzellen ableiten ("iPSC-derived endothelial cells"). [0012] Die Bereitstellung von Hydroxylgruppen (-OH) an den Oberflächen im Schritt 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Methoden erfolgen. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Behandlung der Oberfläche mit Sauerstoffplasma. So können durch diese Behandlung von Membranen, bspw. Polyme- thylpenten-Hohlfasermembranen, auf der Oberfläche Hydroxylgruppen generiert werden.
[0013] Unter "Silanisierung" im Schritt 2 des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die chemische Anbindung einer Silanverbindung an die Oberfläche verstanden. Dies kann bspw., aber nicht ausschließlich, durch eine Reaktion der freien Hydroxylgruppen mit 3-aminopropy- Itriethoxysilan (APTES) erfolgen.
[0014] Im Schritt 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Reaktand, der in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagieren kann, wie bspw., jedoch nicht ausschließlich, Dibenzocyclooctin (DBCO), mit dem Fachmann bekannten Methoden an die silanisierte Oberfläche konjugiert.
[0015] Erfindungsgemäß wird unter einer "Klick-Reaktion", synonym auch als "Klick-Chemie" bezeichnet, eine Reaktion zwischen Azid und Alkin verstanden, um ein 1 ,5-disubstituiertes 1 ,2,3-Triazol zu liefern. Dies erfolgt erfindungsgemäß ohne den Einsatz von Kupfer oder anderen zytotoxischen Katalysatoren unter physiologischen Bedingungen, z.B. im Zellkulturmedium. Dies bedeutet eine Abkehr vom im Stand der Technik eingesetzten "Klick-Reaktionen". So werden dort vorwiegend Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloadditionen (Cu- AAC) durchgeführt. Diese Methode ist jedoch durch den Einsatz von Kupfer erfindungsgemäß ungeeignet, da Kupfer die biologischen Zellen schädigt. Die Erfindung schafft durch die Kupferfreiheit Abhilfe.
[0016] Die erfindungsgemäß hergestellten Oberflächen sind nun in der Lage, in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden zu reagieren und dadurch Strukturen, die Azidgruppen (N3) exponieren, kovalent an die Oberfläche zu binden. So lassen sich bspw. Endothelzellen derart funktionalisieren, dass sie an ihren Oberflächen Glykoproteine mit Azidgruppen aufweisen. Diese Gruppen können in einer kupferfreien Klick-Reaktion kovalent an den Reaktand, wie bspw. DBCO, konjugiert werden. [0017] Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit Oberflächen bereit, die effizient und zielgerichtet mit azidmodifizierten biologischen Zellen besiedelt werden können. Da diese Reaktion sehr spezifisch abläuft, werden nur solche biologischen Zellen an die Oberfläche gebunden, die Azidgruppen exponieren. Die unspezifische Bindung unerwünschter Zellpopulationen wird dadurch verhindert. Dies ermöglicht eine effiziente Besiedelung der Oberflächen mit bspw. Endothelzellen, um die Erkennung der Oberflächen als "fremd" zu verhindern. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch eingesetzt werden, um patienteneigene endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) oder Endothelzellen, die sich von induzierten pluripotenten Stammzellen ableiten ("iPSC-derived endothelial cells"), auf gewünschte Oberflächen von blutkontaktierenden Materialien zu binden.
[0018] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird somit vollkommen gelöst.
[0019] Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch folgenden weiteren Schritt: 4. Inkubation der Oberfläche mit biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) aufweisen, unter Bedingungen, die in einer kupferfreien Klick-Reaktion die Konjugation der Azidgruppe mit dem Reaktanden erlau-ben.
[0020] In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Reaktand aus Schritt 3 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Cycloalkin, Cycloalkin-Ester, Phoshin und Phosphin-Ester.
[0021] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Reaktanden zum Einsatz kommen, die geeignet sind, um in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagieren zu können und damit erfindungsgemäß besonders funktionell sind. Dabei reagieren Phosphin-Gruppen mit den Azidgruppen in einer sogenannten Staudinger-Reaktion. Diese Reaktion zeigt langsame Reaktionskinetiken von etwa 10'3 M'1s'1. Cycloalkine reagieren mit den Azidgruppen in einer sog. 'strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction' (SPAAC). Die Reaktion 2. Ordnung hat eine moderate Geschwindigkeitskonstante von 10’2 — 1 M'1s'1.
[0022] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kommt als Reaktand das Cycloalkin Di- benzocyclooctin (DBCO) und/oder der Cycloalkin-Ester DBCO-PEG4-NHS-Ester zum Einsatz. [0023] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Reaktanden zum Einsatz kommen, die sich nach Erkenntnissen der Erfinder besonders bewährt haben. Dabei war die erfindungsgemäße Eignung von DBCO besonders überraschend. So sind im Stand der Technik zwar Verwendungsmöglichkeiten beschrieben, wie mittels DBCO Moleküle, i.d.R. Proteine, funktionalisiert werden können: siehe z.B. Wallrodt, S., et al., Bioorthogonally Functionalized NAD(+) Analogues for In-Cell Visualization of Poly(ADP-Ribose) Formation. Angew Chem Int Ed Engl, 2016. 55(27): S. 7660-7664; Laughlin, S.T., et al., In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science, 2008. 320(5876): S. 664- 667; Xie, R., et al., In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016. 113(19): S. 5173-5178; Koo, H., et al., Bioorthogonal Copper-Free Click Chemistry In Vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angewandte Chemie-International Edition, 2012. 51(47): p. 11836-11840. Eine Konjugation von DBCO an eine sialisierte Oberfläche zum Zwecke der anschließenden Besiedlung mit biologischen Zellen ist im Stand der Technik jedoch bislang nicht beschrieben.
[0024] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt 1 die Bereitstellung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche durch Sauerstoffplasmabehandlung einer Oberfläche.
[0025] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Verfahren zum Einsatz kommt, dass sich zur Erzeugung von Hydroxylgruppen auf der Oberfläche besonders gut eignet.
[0026] Dabei handelt es sich in einer Ausführungsform der Erfindung bei der Oberfläche um eine solche einer medizinischen Vorrichtung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: künstliche Lunge, Oxygenator, künstliche Niere, Prothese, Gefäßprothese, Stent, Kunstherz.
[0027] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Verfahren dort zum Einsatz kommt, wo die Besiedelung von Oberflächen mit biologischen Zellen für die Funktionalität und Biokompatibilität der Vorrichtungen besonders wesentlich ist. Bei einem Einsatz im Patienten kann damit verhindert werden, dass die Vorrichtung als "fremd" erkannt wird.
[0028] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Oberfläche eine Oberfläche einer Hohlfasermembran (HFM), vorzugsweise einer Polymethylpenten- oder Polypropylen- HFM.
[0029] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Verfahren bei besonders praxisrelevanten blutkontaktierenden Oberflächen zum Einsatz kommt, die bspw. in Oxygenatoren verwendet werden.
[0030] In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die biologischen Zellen Endothelzellen.
[0031] Mit dieser Maßnahme können solche Zellen an die Oberflächen gebunden werden, denen für die Funktionalität wichtiger medizinischer Vorrichtungen, wie künstlichen Lungen, eine besondere Bedeutung zukommt.
[0032] In eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die biologischen Zellen an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) auf.
[0033] Mit dieser Maßnahme werden auf vorteilhafte Art und Weise die technischen Voraussetzungen dafür geschaffen, dass die Zellen in einer kupferfreien Klick-Reaktion an die erfindungsgemäß hergestellte Oberfläche gebunden werden können.
[0034] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, vorzugsweise eine künstliche Lunge, ein Oxygenator, künstliche Niere, eine Prothese, eine Gefäßprothese, ein Stent, ein Kunstherz oder eine Hohlfasermembran (HFM) wie eine Polymethylpenten oder Polypropylen-HFM, wobei die Oberfläche einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktan- den aufweist. Vorzugsweise wurde die mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten. [0035] Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens gelten in entsprechender Art und Weise auch für die erfindungsgemäße Vorrichtung.
[0036] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen, das folgende Schritte aufweist:
1. Bereitstellung einer Oberfläche, die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist,
2. Inkubation der Oberfläche mit biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) aufweisen, unter Bedingungen, die in einer kupferfreien Klick-Reaktion die Konjugation der Azidgruppe mit dem Reaktanden erlauben.
[0037] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Besiedelungsverfahrens wurde die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweisende Oberfläche mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten.
[0038] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Besiedelungsverfahrens wurden die biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) aufweisen, durch Inkubation von biologischen Zellen mit einem Azidzucker erhalten, der vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ac4ManNAz (N-Azidoacetylmannosamine-tet- raacylated), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac4GlcNAz), N-azidoacetylgalacto- samine-tetraacylated (Ac4GalNAz) und anderen Azid-funktionalisierten Glykokonjugaten.
[0039] Durch diese Maßnahme werden auf vorteilhafte Art und Weise biologische Zellen erhalten, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) exponieren. Die angegebenen Azidzucker sind dabei für die Funktionalisierung der Zellen besonders geeignet. Die Azidzucker werden wie ihre natürlichen Analoga in die Zellen aufgenommen und in Glykoproteine eingebaut. Dies führt dazu, dass die Zellen auf der Zelloberfläche Glykoproteine haben, die mit Azidgruppen (-N3) versehen sind. Diese Gruppen können mittels Klick-Chemie kovalent an die Oberfläche konjugiert werden. Durch die Inkubation der modifizierten Zellen mit den modifizierten HFMs kommt es zu einer bio-orthogonalen Reaktion, die Alkingruppe des Reaktanden bzw. DBCOs reagiert mit dem Azid auf der Oberfläche der Zellen. Dies passiert sehr spezifisch, sodass nur modifizierte Zellen mit Azid-Molekülen an die Reaktanden auf der Membran binden können. Das Binden der Zellen an der Membran und die weitere Inkubation in Zellkulturmedium führen zur Proliferation und letztendlich zur Besiedelung der Membran mit einem konfluentem Monolayer aus Zellen.
[0040] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Besiedelungsverfahrens sind die biologischen Zellen Endothelzellen.
[0041] Mit dieser Maßnahme werden die Oberflächen mit solchen Zellen besiedelt, denen für die Funktionalität wichtiger medizinischer Oberflächen bzw. Vorrichtungen eine besondere Bedeutung zukommt. Besonders geeignet sind primäre Endothelzellen, die aus Nabelschnurrblut isoliert wurden, sogenannte Human Umbilical Vein Endothelial Celis (HUVECs), die in VascuLife® EnGS Endothelial Medium Complete Kit bis zur Endothelia- lisierung kultiviert werden. In einer Ausführungsform kann die Besiedelung mit den Endothelzellen in EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit stattfinden. Polymethyl- pentene HFMs (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Germany), APTES, Methanol, Toluol (Sigma-Aldrich, Darmstadt), DBCO-PEG4-NHS ester (Jena Bioscience, Jena, Germany), Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), (Invitrogen), N-azidoacetylman- nosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz, Sigma Aldrich, Germany), DMSO (Sigma-Aldrich).
[0042] Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens gelten in entsprechender Art und Weise auch für das erfindungsgemäße Besiedelungsverfahren.
[0043] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. [0044] Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert. Die dort erwähnten Merkmale gelten nicht nur in Bezug auf das konkrete Beispiel, sondern auch in isolierter Form als zur Erfindung gehörend.
[0045] Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 : Schematische Darstellung der Funktionalisierung der PMP-Hohlfaser- membranen (HFMs). a) Erzeugung von Hydroxylgruppen durch Ch-Plasmabe- handlung. b) Silanisierung der plasmabehandelten HFMs mit APTES. c) Einführung von Cyclooctyne-Gruppen durch kovalente Bindung von DBCO- PEG4-NHS-Estern. d) Klick-Reaktion von modifizierten HFM mit metabolisch veränderten Endothelzellen.
Fig.2: Detektion der erzeugten funktionellen Gruppen auf PMP-Hohlfaser- membranen (HFMs). (A) Zum Nachweis der Aminogruppen nach APTES- Behandlung der HFM wurden die HFM mit Methylorange angefärbt, und die Absorption von an der Oberfläche gebundenem und eluiertem Methylorange wurde mit einem Spektralphotometer gemessen. Unbehandelte und mit O2- Plasma behandelte HFMs wurden als Negativkontrollen verwendet. (n=3). (B) Zum Nachweis von DBCO-Gruppen auf der Oberfläche von unbehandelten, mit APTES oder DBCO-PEG-NHS-Ester behandelten HFM wurden die HFM mit Cy3-Azid inkubiert. Das konjugierte Cy3-Azid wurde mit einem Fluoreszenz-Lesegerät (n=3) oder (C) durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Die statistische Analyse wurde mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey-Vergleichstest durchgeführt. (*** p < 0,001 , **** p < 0,0001).
Fig. 3: Ergebnis der REM-Analysen. Es gibt keine visuellen Unterschiede auf der
Oberfläche der HFM, die nur mit APTES oder APTES und DBCO-PEG4-NHS- Ester behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten HFM. Fig. 4: Analyse der Dichtigkeit von HFM-Membranen nach Oberflächenfunktionalisie- rung. A) Um eine mögliche Leckage zu messen, wurden HFMs B) unbehandelt (links) und Ch-Plasma-behandelt (rechts) sowie C) APTES- (links) und DBCO- (rechts) funktionalisierte Membranen in einen geschlossenen Kreislauf platziert, der mit 0,1 % Toluidinblau-Lösung gefüllt war, und wurden unter einem konstanten Druck von 250 mmHg ± 10 mmHg inkubiert. Nach 3 Stunden wurde keine Leckage festgestellt, was die Aufrechterhaltung der Membranintegrität demonstriert. Abgebildet sind repräsentative Aufnahmen (n=3).
Fig. 5: Analyse des Vorhandenseins von Na-Gruppen auf der Oberfläche von HUVECs nach Entfernung von Ac4ManNAz aus dem Zellkulturmedium. 2x105 HUVECs wurden 48 h lang mit 50 pM Ac4ManNAz und ohne inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und das Medium wurde durch Zellkulturmedium ohne Ac4ManNAz ersetzt. Nach 0, 2, 4 und 24 Stunden wurden die Zellen 1 Stunde lang mit 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 inkubiert, und nach dem Waschen mit DPBS wurden durchflusszytometrische Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SD (n=3) angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mit Hilfe einer Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni- Mehrfachvergleichstest (**p<0,01 , ***p<0,001, ns: nicht signifikant).
Fig. 6: Metabolische Markierung von HUVECs mit Ac4ManNAz und Analyse der Zelllebensfähigkeit. 2x105 HUVECs wurden 48 h lang mit und ohne 50 pM Ac4ManNAz inkubiert. A) Die Zellen wurden 1 h lang mit 5 pM DBCO-Sulfo- Cy3 inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen mit DPBS und der Färbung des Zytoskeletts mit ActinGreen und der Zellkerne mit DAPI wurden fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen gemacht. B) Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 inkubiert und nach dem Waschen mit DPBS wurden durchflusszytometrische Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD (n=3) angegeben. C) Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem PrestoBlue-Assay bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM (n=3) angegeben. Die statistische Analyse wurde mit einem zweiseitigen gepaarten t-Test durchgeführt. (** p < 0,01, ns: nicht signifikant). Fig. 7: Analyse der Endothelialisierung von modifizierten Hohlfasermembranen (HFMs). Unbehandelte, APTES- oder DBCO-funktionalisierte HFMs wurden mit HUVECs inkubiert. Dazu wurden 5,2 x 106 HUVECs ohne (w/o) oder mit metabolischer Markierung mit Ac4ManNAz 24 h lang dynamisch inkubiert und dann 24 h lang unter statischen Bedingungen kultiviert. A) Die angehefteten Zellen wurden durch Calcein AM-Färbung und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Abgebildet sind repräsentative Bilder von drei Experimenten. B) Quantifizierung der gebundenen HUVECs auf HFMs mithilfe eines Fluoreszenz-Readers. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM (n=3) angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey's Multiple Comparison Test. (*p < 0,05, ** p< 0,01). C) Nachweis von Zell-Zell-Kontakten von HUVECs, die an die DBCO-beschichteten Membranen gebunden sind, durch Färbung mit anti-humanem VE-Cadherin (grün) und DAPI als Kernfärbung mittels Fluoreszenzmikroskopie. D) Detektion von Zell-Zell-Kontakten von HUVECs, die an die DBCO-beschichteten Membranen gebunden sind, durch Färbung mit anti-humanem VE-Cadherin-Antikörper (grün) und ActinRed-Zytoskelett-Färbung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie.
Fig. 8: Analyse der Reaktion der endothelialisierten Oberfläche auf einen Entzündungsreiz mittels qRT-PCR. Endothelialisierte HFM wurden mit 50 ng/ml TNF- a behandelt, und die Expression von Adhäsionsmolekülen (E-Selektin, VCAM- 1 und ICAM-1) wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Die mRNA-Werte wurden auf die GAPDH-mRNA-Werte normalisiert, und die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM relativ zu den Expressionswerten in der Negativkontrolle (endothelialisierte HFM ohne TNF-a-Stimulation) angegeben. Die Unterschiede wurden mit einem einseitigen t-Test ermittelt. (n=3). (*p < 0,05, ***p < 0,001 , ****p < 0,0001).
Fig. 9: Bestimmung der Blutzellzahl nach Inkubation von menschlichem Blut mit unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFM. Blutproben ohne HFM wurden als Negativkontrolle verwendet. Die Inkubation des Blutes erfolgte für 90 Minuten bei 37 °C. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen, der roten Blutkörperchen und der Blutplättchen wurde mit einem Zellzähler bestimmt. Darüber hinaus wurden die aktivierten Thrombozyten durch Färbung mit einem anti-humanen CD62P-Antikörper und durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die Daten sind als Mittelwert + SD angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels einseitiger ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni- Mehrfachvergleichstest. (*p < 0,05, ** p< 0,01 , *** p< 0,001).
Fig. 10: Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder von unbeschichteten, DBCO- beschichteten oder endothelialisierten HFMs 90 Minuten nach der Inkubation mit menschlichem Blut oder endothelialisierten HFMs ohne Blutkontakt. (n=3).
Fig. 11 : Analyse der Hämokompatibilität von unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFM. Nach 90-minütiger Inkubation mit frischem menschlichem Blut wurden die Aktivierung der Gerinnung (Thrombin-Anti- thrombin-lll-Komplex (TAT)), der Thrombozyten (ß-Thromboglobulin), des Komplementsystems (sC5b-9) und der Entzündung (PMN-Elastase) mittels ELISA bestimmt (n=4). Die Daten sind als Mittelwert + SD angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest. (**p< 0,01 , ***p< 0,001 , und ****p< 0,0001).
Fig. 12: Analyse des Entzündungsstatus der endothelialisierten Oberfläche von HFMs mittels qRT-PCR. Endothelialisierte HFMs wurden 90 Minuten lang bei 37°C mit menschlichem Blut inkubiert, und die Expression von Adhäsionsmolekülen (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1) wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Die mRNA-Werte wurden auf die GAPDH-mRNA-Werte normiert, und die Ergebnisse werden als Mittelwert + SEM im Verhältnis zu den Expressionswerten in der Kontrolle (HllVECs auf Zellkulturplatte) angegeben. Die Unterschiede wurden mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Bonferroni-Mehrfach- vergleichstest ermittelt. (n=3). (*p< 0,05, **p< 0,01 , ***p< 0,001). Beispiele
1. Material und Methoden
1.1 Kultivierung von humanen Nabelvenenendothelzellen (HLIVECs)
[0046] HUVECs (ATCC®, Manassas, USA) wurden in T75-Zellkulturflaschen, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet waren, ausgesät und bei 37°C und 5 % CO2 in Vasculife® EnGS EC- Kulturmedium (CellSystems, Troisdorf, Deutschland) mit VascuLife EnGS LifeFactors Kit, 50 mg/ml Gentamicin und 0,05 mg/ml Amphotericin B (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) kultiviert. Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Nach Erreichen von 80 % Konfluenz wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA (0,04 %/0,03 %, PromoCell, Heidelberg, Deutschland) abgelöst.
1.2 Funktionalisierung von Hohlfasermembranen (HFMs) mit DBCO
[0047] Die Oberfläche von Polymethylpenten-HFMs (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Deutschland) wurde in einem dreistufigen Verfahren beschichtet (Figur 1). Zunächst wurde die Oberfläche mit 02-Plasma behandelt, und im zweiten Schritt wurde die Silani- sierung durchgeführt. Im dritten Schritt wurde Dibenzylcyclooctyne-PEG4-NHS-Ester (DBCO-PEG4-NHS-Ester) an die silanisierte Oberfläche konjugiert. Dazu wurden PMP- Membranen auf eine Größe von 3 x 3 cm geschnitten und durch Behandlung mit 02- Plasma (Denta Pias®, Diener electronic, Ebhausen, Deutschland) für 30 min bei einem Druck von 0,3 mbar (± 0,20 mbar) und einer Leistung von 80% (± 5%) Hydroxylgruppen erzeugt. Anschließend wurden die HFMs 30 Minuten lang in Toluol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) mit 2 % (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES, Sigma-Aldrich) auf einem Schüttler bei 20 U/min inkubiert. Die Membranen wurden dann in 100%igem Toluol, 50%igem Toluol/50%igem Methanol und 100%igem Methanol jeweils 2 Minuten lang soni- fiziert, um ungebundenes oder schwach gebundenes APTES zu entfernen. Nach dem Trocknen wurden die Membranen 30 Minuten lang in 400 M DBCO-PEG4-NHS-Ester (Jena Bioscience, Jena, Deutschland) mit Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (Invitrogen, Carlsbad, USA) inkubiert, um Cyclooctin-Gruppen einzuführen, und dreimal mit frischem DPBS gewaschen.
1 .3 Quantifizierung der auf der HFM-Beschichtung gebildeten funktionellen Gruppen
Nachweis von Aminogruppen nach APTES-Behandlung
[0048] Zum Nachweis der Aminogruppen auf der HFM-Oberfläche wurden die Membranen 5 Stunden lang in 0,5 mM Methylorange (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit 1 mM HCI-Lösung. Die Desorption von gebundenem Methylorange von der HFM-Oberfläche erfolgte mit 0,4 ml einer 1 mM NaOH-Lösung über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler. Zum Nachweis von Methylorange wurden 100 pl der Desorptionslösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte gegeben. Die Absorption wurde bei 465 nm mit einem Mikroplatten-Lese- gerät (Eon Synergy 2, Bio Tek Instruments Inc. , Winooski USA) gemessen.
Nachweis von DBCO-Gruppen nach der Konjugation von DBCO-PEG4-NHS-Ester
[0049] Nach der Inkubation mit DBCO-PEG4-NHS-Ester wurden die HFM in DPBS ohne Ca2+/Mg2+ 1 Stunde lang mit 80 pg/ml Cy3-Azid (Sigma-Aldrich) inkubiert, um das Cy3- Azid an die DBCO-funktionalisierte HFM-Oberfläche zu binden. Die HFMs wurden dann fünfmal mit 100 %igem Ethanol gewaschen und die Färbung der Membranen wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie (Axiovert 135, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) nachgewiesen. Außerdem wurde die Fluoreszenzintensität auf den Membranen mit einem Mikroplattenlesegerät (Mithras 940, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) bei einer Anregungswellenlänge von 500 nm und einer Emissionswellenlänge von 600 nm quantifiziert. HFM ohne Behandlung und nur mit APTES-Behandlung wurden als Kontrollen verwendet.
1 .4 Metabolische Markierung von HUVECs mit Azidgruppen und Nachweis der Azidmarkierung [0050] Um die Zelloberfläche von HUVECs mit Azidgruppen zu funktionalisieren, wurden 2 x 105 HUVECs pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ausgesät und mit oder ohne 50 pM N- Azidoacetylmannosamin-tetraacyliert (Ac4ManNAz, Sigma Aldrich) in 2 ml Medium für 48 h bei 37°C mit 5% CO2 behandelt. Zum Nachweis der gebildeten Azidogruppen wurden die Zellen mit DPBS ohne Ca2+/Mg2+ gewaschen und mit 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 (Jena Bioscience, Deutschland) in DPBS mit Ca2+/Mg2+ für 1 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit 10 ml DPBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA (0,04 %/0,03 %) abgelöst und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0,5 ml DPBS resuspendiert, und die Cy3-Markierung von 10.000 Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS SCAN, BD, Heidelberg, Deutschland) analysiert. Zusätzlich zu den durchflusszytometrischen Analysen wurden die Zellen 30 Minuten lang mit ActinGreen™ 488 ReadyProbes® Reagenz (Invitrogen) für das Zytoskelett und 5 Minuten lang mit 0,2 pg/ml DAPI (Sigma Aldrich) zur Visualisierung der Zellkerne gefärbt.
1 .5 Analyse der Lebensfähigkeit der Zellen nach metabolischer Markierung von HUVECs mit Ac4ManNAz
[0051] Der Einfluss der metabolischen Markierung auf die Lebensfähigkeit von HUVECs wurde 48 Stunden nach der Markierung mit 50 pM Ac4ManNAz mit dem PrestoBlue-Assay (Invitrogen, Carlsbad, USA) untersucht. Dazu wurden 500 pL 1x Presto Blue Zelllebensfähigkeitsreagenz pro Vertiefung einer 6-Well-Platte zugegeben und 1 ,5 h bei 37°C inkubiert. Die Fluoreszenzintensität von 100 pL Überstand wurde in dreifacher Ausführung bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 600 nm mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät (Mithras LB 940, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) gemessen.
1.6 Klicken von Endothelzellen an HFM mittels kupferfreier Klick-Chemie
[0052] DBCO-beschichtete und unbeschichtete PMP-Membranen (3 x 3 cm) wurden mit 5,2 x 106 Ac4ManNAz-markierten HUVECs in 13 ml EGMTM-2 Endothelzell-Wachstumsmedium BulletKitTM (Lonza, Basel, Schweiz) inkubiert. Die Inkubation erfolgte für 24 Stunden bei 10 U/min mit einem Rotator (Phoenix Instrument, Garbsen, Deutschland) in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37°C. Nach der Rotationsinkubation wurden die Membranen in jede Vertiefung einer 6- Well-Platte gelegt und für 1 oder 5 Tage unter statischen Bedingungen weiter inkubiert.
1 .7 Analyse der Endothelialisierung
[0053] Die an den Membranen haftenden HLIVECs wurden mit 250 ng/mL Calcein-Acetoxyme- thylester (Calcein-AM; Invitrogen) für 10 Minuten bei 37°C angefärbt. Die gefärbten Zellen wurden mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie (Axio 135, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) nachgewiesen. Außerdem wurde das Fluoreszenzsignal auf der Oberfläche der HFMs vor und nach der Calcein-AM-Färbung bei einer Anregungswellenlänge von 494 nm und einer Emissionswellenlänge von 517 nm mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät (Mithras LB 940, Berthold Technologies) erfasst.
[0054] Darüber hinaus wurden die Bildung eines konfluenten Endothelzell-Monolayers und das Vorhandensein von Zell-Zell-Kontakten durch Färbung der Zellen mit einem anti-humanen VE-Cadherin-Antikörper nachgewiesen. Dazu wurden die mit DBCO-PEG4-NHS-Ester beschichteten und endothelialisierten Membranen mit DPBS gewaschen und in 4 % Paraformaldehyd (v/v) für 10 Minuten bei RT fixiert. Nach dem Waschen mit DPBS erfolgte die Blockierung mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris-Base, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,5) mit 5 % Ziegenserum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) für 30 Minuten bei RT. Die Membranen wurden mit DPBS gewaschen und mit dem 1 :100 verdünnten primären Antikörper Maus-Anti-Human-VE-Cadherin (CD144 (16B1), eBioscience, Invitrogen, USA) in DPBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei RT inkubiert. Die Membranen wurden dann dreimal mit DPBS gewaschen und mit 1 :400 verdünntem, mit Alexa Fluor 488 markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbiertem sekundärem Antikörper (ThermoFisher, USA) für 1 h in PBS mit 1 % BSA inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit DPBS wurden die Zellkerne 5 Minuten lang mit DAPI (Sigma Aldrich, Darmstadt, Deutschland) 1 :2000 verdünnt in DPBS gefärbt. Als Negativkontrolle wurden die Membranen auch mit einem Isotyp-Kontrollantikörper inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie (Axio 135, Carl Zeiss AG, Aoberkochen, Deutschland) nachgewiesen. 1 .8 Reaktivität des Endothels auf HFMs auf den Entzündungsreiz
[0055] Endothelialisierte HFMs wurden 4 Stunden lang ohne oder mit 50 ng/mL Tumornekrosefaktor a (TNF-a, Sigma-Aldrich) in EGMTM-2-Endothelzell-Wachstumsmedium ohne Hydrocortison inkubiert. Nach der Inkubation wurden die HFMs zweimal mit DPBS gewaschen und die Gesamt-RNA isoliert. Die Expression der Aktivierungsmarker, des endothelialen Leukozytenadhäsionsmoleküls 1 (E-Selektin), des vaskulären Zelladhäsionsmoleküls 1 (VCAM-1) und des interzellulären Adhäsionsmoleküls 1 (ICAM-1), wurde mittels qRT-PCR nachgewiesen. Die mRNA-Konzentrationen wurden auf die GAPDH-mRNA- Konzentrationen normalisiert, und die Ergebnisse wurden relativ zu den Expressionskonzentrationen in endothelialisierten HFM ohne TNF-a-Stimulation dargestellt.
1.9 qRT-PCR
[0056] Die Gesamt-RNA der Zellen wurde mit dem Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, München, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. 300 ng RNA wurden mit dem iScript Kit (Bio-Rad) in DNA-Kopien (cDNA) revers transkribiert. Die Amplifikation der Transkripte erfolgte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primern in einer Endkonzentration von 300 nM unter folgenden Bedingungen: ein Zyklus von 3 min bei 95°C, gefolgt von 40 Zyklen von 95°C für 15 s und 72°C für 10 s. Nach 40 Zyklen wurde eine Schmelzkurvenanalyse zum Nachweis der spezifischen Amplifikate durchgeführt. Echtzeit-qRT-PCR- Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung mit einem Gesamtvolumen von 15 pL pro Vertiefung in einem CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) unter Verwendung von IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) durchgeführt. Das konstitutiv expri- mierte GAPDH (Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) wurde als Housekeeping- Gen verwendet. Die nachgewiesenen mRNA-Konzentrationen jedes Gens wurden auf GAPDH normalisiert, und die Ergebnisse wurden im Verhältnis zu den mRNA-Kontrollkon- zentrationen angegeben.
Gen Vorwärtsprimer (5’->3’) Rückwärtsprimer (5’^3’)
GAPDH TCAACAGCGACACCCACTCC TGAGGTCCACCACCCTGTTG
(SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5) E-selec- GCCCAGAGCCTTCAGTGTACC GGAATGGCTGCACCTCACAG tin (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 6)
ICAM-1 CTTGAGGGCACCTACCTCTGTC CGGCTGCTACCACAGTGATG
(SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 7)
VCAM-1 ACACTTTATGTCAATGTTGCCCC GAGGCTGTAGCTCCCCGTTAG
(SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 8)
Tabelle 1 : Primer, die für die qRT-PCR-Analyse verwendet wurden.
1.10 Blutentnahme
[0057] Menschliches Vollblut wurde mit einer Safety-Multyfly® 20 Gx3/4 TW Nadel (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) aus der antekubitalen Vene gesunder Probanden (n=4) entnommen und in 9 mL Monovetten (Sarstedt) mit 1 lll/mL Natriumheparin (Ratiopharm, Ulm, Deutschland) gefüllt. Die Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigte die Blutentnahme, und alle Probanden gaben ihr schriftliches Einverständnis.
1.11 Durchführung von Hämokompatibilitätsanalysen
[0058] Die Inkubation von unmodifizierten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFM (3 x 3 cm) mit menschlichen Blutproben erfolgte mit 9 mL heparinisiertem menschlichem Vollblut in Polypropylen-Rundbodenröhrchen (14 mL, BD Biosciences, Deutschland) unter dynamischen Bedingungen für 90 Minuten bei 37°C und 30 U/min. Als Negativkontrolle wurden die Röhrchen mit der gleichen Menge frischem heparinisiertem Blut ohne jegliches Material gefüllt. Nach 90 Minuten dynamischer Inkubation wurden die Blutproben in Röhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (1 ,6 mg/mL, EDTA, Sarstedt) für die Analyse der Komplementaktivierung und den Nachweis der Zellzahl gesammelt. Zum Nachweis von PMN-Elastase und TAT wurden Röhrchen mit (0,3 mL Citratlösung/3 mL Blut, 0,106 M CeHsNasO? x 2H2O, Sartstedt) verwendet. Für die ß-TG-Analyse wurde das Blut in 2,7 mL CTAD-Röhrchen mit 270 pL 0,109 M CTAD-Lösung, die gepuffertes Natriumcitrat, Theophyllin, Adenosin und Dipyridamol enthält (BD Vacutainer CTAD, Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland), überführt und 15 Minuten auf Eis gelagert. Die EDTA- und CTAD-Präparate wurden bei 2500 x g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Citratblutpräparate wurden bei 1800 x g für 18 min bei RT zentrifugiert. Das Blutplasma jeder Probe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zu weiteren Untersuchungen bei -80°C gelagert.
Analysen der Blutzellenzahl
[0059] Die Anzahl der Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten wurde in den entnommenen Blutproben mit einem automatischen Zellzählsystem (ABX Micros 60, HORIBA Medical, Minami-ku, Kyoto, Japan) gemessen.
Analyse der Aktivierungsmarker im Blutplasma
[0060] Zur Bestimmung von Veränderungen der Gerinnung (Thrombin-Antithrombin-Ill-Komplex (TAT)), des Komplementsystems (sC5b-9) und der Aktivierung von Thrombozyten (ß- Thromboglobulin (ß-TG)) und Neutrophilen wurden handelsübliche ELISA-Kits (enzyme- linked immunosorbent assays) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Daher wurden sC5b-9 (MicroVue™ Complement, Quidel Germany GmbH & AnDiaTec Division, Kornwestheim, Deutschland), TAT (Enzygnost® TAT micro, Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland), polymorphkernige (PMN) Elastase (Demeditec Diagnostics, Kiel, Deutschland) und ß-TG (Asserachrom® ß-TG, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ, USA) ELISAs verwendet.
Nachweis von aktivierten Thrombozyten
[0061] Unbeschichtete, DBCO-beschichtete oder endothelialisierte HFMs wurden wie oben beschrieben mit Blut inkubiert. Nach der 90-minütigen Inkubation der HFMs mit menschlichem Blut wurde das Blut entnommen und 1:5 mit DPBS verdünnt. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei RT mit 10 pl Maus-Anti-Human-CD41-FITC-Antikörper (Firma) zum Nachweis von Thrombozyten und 10 pl Maus-Anti-Human-CD62P-PE-Antikörper (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) zum Nachweis von Thrombozyten, die P-Selektin (CD62P) exprimieren, was eine Thrombozytenaktivierung anzeigt, inkubiert. Die Proben wurden mit 0,5 % Paraformaldehyd fixiert und die Aktivierung der Thrombozyten wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Rasterelektronenmikroskopische (SEM) Analysen der HFM-Oberflächen
[0062] Nach der Inkubation von unmodifizierten, DBCO-beschichteten und endothelialisierten HFMs mit Blut wurden die HFMs mit 0,9 %iger Kochsalzlösung (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) gespült und für 24 h in 2,5 %igem Glutaraldehyd (Sigma Aldrich, Darmstadt, Deutschland) in DPBS fixiert. Nach dem Fixierungsschritt wurden die Proben 15 Minuten lang bei RT mit DPBS gewaschen und anschließend in 15-Minuten-Schritten bei RT mit einer aufsteigenden Ethanolreihe (40% -100% Ethanol; Merck-Millipore, Darmstadt, Deutschland) dehydriert. Danach wurden die Proben in einem Kritischer-Punkt- Trockner (Polaron E3100, Quorum Technologies ltd, East Sussex, Vereinigtes Königreich) getrocknet und mit Gold-Palladium-Partikeln (Baltec SCD 050, Bal-Tec AG, Balzers, Liechtenstein) besputtert. Die Bildgebung erfolgte mittels REM (EVO LS 10, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) mit 20-, 500-, 1000- und 5000-facher Vergrößerung.
Analyse des Entzündungsstatus des Endothels auf HFMs
[0063] Nach der Endothelialisierung von HFMs wurde die Gesamt-RNA aus Endothelzellen ohne Blutinkubation und nach 90 Minuten Blutinkubation isoliert. Dazu wurden die HFMs vor der RNA-Isolierung zweimal mit DPBS gewaschen. Als Kontrolle wurde die RNA auch aus HUVECs isoliert, die auf 6-Well-Platten kultiviert wurden. Die Expression der Aktivierungsmarker E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde mittels qRT-PCR nachgewiesen. Die mRNA-Werte wurden auf die GAPDH-mRNA-Werte normiert, und die Ergebnisse wurden im Verhältnis zu den Expressionswerten in HUVECs dargestellt, die auf Zellkulturplatten kultiviert wurden.
1.14 Statistische Auswertung
[0064] Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Für den Vergleich der Mittelwerte zwischen zwei Gruppen wurde ein zweiseitiger gepaarter t-Test durchgeführt. Für den Vergleich der Mittelwerte von mehr als zwei Gruppen wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0.2 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, Kalifornien, USA) durchgeführt. Unterschiede von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
2. Ergebnisse
2.1 Schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
02-Plasma (Schritt 1 in Figur 1)
[0065] Hydroxylgruppen an der Oberfläche von Materialien können mit chemischen Gruppen von anderen Molekülen reagieren und so eine kovalente Bindung eingehen.
[0066] 3x3 cm große Polymethylpenten Hohlfasermembranen (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana,
Wuppertal, Germany) wurden zunächst mit Sauerstoffplasma behandelt, um Hydroxylgruppen (-OH) an der Oberfläche zu generieren. Dies wurde mittels der Anlage Denta Pias®, Diener electronic, Ebhausen, durchgeführt. Hierfür wurden die Membrane mit einem Druck von 0.3 mbar ((± 0.20 mbar) und einer Plasmastärke von 80 % (± 5%) im Niedervakuum mit Sauerstoffplasma behandelt. Im Anschluss folgte die Silanisierung.
Silanisierung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (Schritt 2 in Figur 1)
[0067] In diesem Schritt reagieren die freien Hydroxylgruppen mit APTES. Das Verdünnen von APTES in wasserfreiem Toluol ist eine weitverbreitete Methode bei der Silanisierung. Für die Silanisierung wurden die Membranen für 30 min in 2% APTES (APTES, Sigma-Aldrich, Darmstadt) verdünnt in Toluol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) bei 20 rpm und RT inkubiert. Im Anschluss wurden drei Waschschritte für 2 min im Ultraschallbad durchgeführt, um ungebundenes oder schwachgebundenes APTES zu entfernen. Zunächst wurden die Membranen in frischer 100%-iger Toluol-Lösung gewaschen gefolgt von 50% Toluol in 50% Methanol und zuletzt in 100% Methanol gewaschen und getrocknet. DBCO-Konjugation (Schritt 3 in Figur 1)
[0068] Die silanisierten Membranen wurden im Anschluss mit 400 pM DBC0-PEG4-NHS-Ester (Jena Bioscience, Jena, Germany) verdünnt in Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Invitrogen) für 30 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation erfolgten drei Waschschritte in DPBS für jeweils 5 min. Das verwendete DBCO enthält eine PEG4-Kette zur Verlängerung des DBCOs, um eine leichtere Bindung zu den metabolisch modifizierten Zellen zu ermöglichen. Des Weiteren befindet sich an dem eingesetzten DBCO eine aktivierte Carbonsäure (-NHS-Ester), welches mit Aminogruppen vom APTES reagieren und so kovalente Bindungen eingehen können.
2.2 Detektion der gebildeten funktionellen Gruppen auf der Oberfläche von PMP-HFMs
[0069] Zur Detektion der gebildeten Aminogruppen auf unbehandelten, O2-Plasma- und APTES- behandelten HFM-Membranen wurden die Membranen mit Methylorange angefärbt (Figur 2A). APTES-behandelte Membranen zeigten eine etwa 126-mal höhere Methylorange- Bindung (0,2523 ± 0,0175 gegenüber 0,002 ± 0,0175) im Vergleich zu O2-Plasma-behan- delten Membranen, was auf eine erfolgreiche Silanisierung der Oberfläche und das Vorhandensein von Aminogruppen hinweist. Diese aminofunktionalisierten Oberflächen wurden mit DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelt und das Vorhandensein von DBCO wurde durch die Click-Reaktion von Cy3-Azid an der Oberfläche nachgewiesen. Die Fluoreszenzintensität der HFMs wurde mit einem Fluoreszenzlesegerät ermittelt (Figur 2B). Mit DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelte Oberflächen zeigten eine etwa 5,87-fach höhere Cy3-Azid-Konjugation als mit APTES behandelte HFM (RFU: 22553 ± 3564 gegenüber 3845 ± 2155). Darüber hinaus wurde die Cy3-Fluoreszenzfärbung nur auf der Oberfläche der mit DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelten HFM durch fluoreszenzmikroskopische Analyse nachgewiesen (Figur 2C). Darüber hinaus zeigten die REM-Analysen keine visuellen Unterschiede auf der Oberfläche der nur mit APTES oder APTES und DBCO-PEG4- NHS-Ester behandelten HFMs im Vergleich zu den unbehandelten HFMs, was zeigt, dass das Beschichtungsverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Integrität der HFMs hat (Figur 3). 2.3 Analyse der Membrandichtigkeit
[0070] Um die Auswirkung des Funktionalisierungsprozesses auf die Membrandichtheit zu untersuchen, wurden unbehandelte und behandelte HFMs in ECC-noDOP PVC-Röhrchen (3/8" x 3/32", Raumedic AG, Heimbrecht, Deutschland) gelegt und mit einem Epoxidharz (UHU, Bühl/Baden, Deutschland) für 1 h bei RT fixiert. Anschließend wurden die Röhrchen mit Wasser (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) gefüllt, das 0,1 % Toluidinblau (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) enthielt, und es wurde 3 Stunden lang ein konstanter Druck von 250 mmHg ± 10 mmHg erzeugt, indem Dreiwegeventile an die Röhrchen angeschlossen und eine Ballonpumpe (Medtronic, Meerbusch, Deutschland) verwendet wurde. Der Druck wurde mit einem an das System angeschlossenen Manometer (RS 1113, RS Components, Corby, Vereinigtes Königreich) überwacht. Die Dichtigkeit der Membranen wurde analysiert, indem ein Filterpapier (0,83 mm dick, ThermoFisher, Waltham, USA) unter die Membranen gelegt wurde (Figur 4). Die Bilder wurden 3 Stunden nach der Inkubation aufgenommen (n=3).
2.4 Analyse des Vorhandenseins von Na-Gruppen nach Entfernung von Ac4ManNAz aus dem Zellkulturmedium
[0071] Um das Vorhandensein von Na-Gruppen nach Entfernung von Ac4ManNAz zu untersuchen, wurden 2x105 HUVECs pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ausgesät und mit 50 pM Ac4ManNAz oder ohne in 2 ml Medium für 48 h bei 37°C mit 5% CO2 behandelt. Die Zellen wurden mit DBPS w Ca2+/Mg2+ gewaschen und in Zellkulturmedium ohne Ac4ManNAz inkubiert. Nach 0, 2, 4 und 24 Stunden wurde das Vorhandensein von N3 auf der Zelloberfläche nachgewiesen. Dazu wurden die Zellen mit DPBS ohne Ca2+/Mg2+ gewaschen und mit 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 (Jena Bioscience, Deutschland) in DPBS mit Ca2+/Mg2+ für 1 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 1 ml DPBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA (0,04 %/0,03 %) abgelöst und 5 min bei 300 x g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0,5 ml DPBS resuspendiert, und die Cy3-Markierung von 10 000 Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS SCAN, BD, Heidelberg, Deutschland) analysiert. 2.5 Metabolische Markierung der Oberfläche von Endothelzellen mit N3 und Analyse des Einflusses auf die Zelllebensfähigkeit
[0072] Die HLIVECs wurden 48 Stunden lang mit 50 pM Ac4ManNAz behandelt. Um festzustellen, ob Na-Gruppen auf der Zelloberfläche vorhanden sind, wurden die Zellen anschließend 1 Stunde lang mit 5 pM DBCO-Sulfo-Cy3 inkubiert. Das Vorhandensein von N3 auf der Zelloberfläche führte zur Konjugation von DBCO und zur Markierung der Zellen mit Cy3 (Figur 6A). Die Zellen ohne Ac4ManNAz-Behandlung wurden nicht gefärbt. Darüber hinaus zeigten durchflusszytometrische Analysen, dass etwa 98 % der analysierten Zellen Cy3-positiv waren (Figur 6B). Die Behandlung der Zellen mit Ac4ManNAz hatte keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der HUVECs (Figur 6C).
2.6 Endothelialisierung modifizierter HFMs durch kupferfreie Click-Reaktion von N3- markierten HUVECs auf der DBCO-funktionalisierten HFM-Oberfläche
[0073] DBCO-beschichtete und unbeschichtete HFMs wurden mit 5,2 x 106 Ac4ManNAz-markier- ten HUVECs 24 Stunden lang unter Rotation und anschließend 24 Stunden lang unter statischen Bedingungen inkubiert. Die angehefteten HUVECs wurden durch Färbung mit Calcein AM nachgewiesen (Figur 7A). Die fluoreszenzmikroskopische Analyse zeigte, dass die mit Ac4ManNAz behandelten HUVECs effizient an die mit DBCO funktionali- sierte HFM-Oberfläche binden und zu einer fast vollständigen Endothelialisierung führen. Der Nachweis der Fluoreszenzintensität der HFMs zeigte auch, dass die DBCO- Funktionalisierung zu einer deutlich erhöhten Adhäsion der HUVECs im Vergleich zu unbeschichteten oder APTES-beschichteten HFMs führte (Figur 7B). Die engen Zell-Zell- Kontakte von HUVECs auf den HFM-Membranen wurden durch Färbung mit einem Anti- VE-Cadherin-Antikörper nachgewiesen (Figur 7C).
2.7 Reaktivität der Endothelschicht auf einen Entzündungsreiz
[0074] Die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde nach der Stimulation der Endothelschicht auf HFMs mit TNF-a analysiert und mit der nicht stimulierten Endothelschicht mittels qRT-PCR verglichen (Figur 8). Die Stimulation der Endothelschicht mit TNF-a führte zu einer signifikant höheren Expression von E-Selectin (199-fach), VCAM-1 (328-fach) und ICAM-1 (162-fach) im Vergleich zur nicht stimulierten Endothelschicht. Damit wurde die Reaktionsfähigkeit der erzeugten Endothelschicht auf HFMs nachgewiesen.
2.8 Hämokompatibilität von DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFMs
[0075] Der Einfluss von DBCO-funktionalisierten oder endothelialisierten HFMs auf die Hämokompatibilität wurde durch dynamische Inkubation mit frischem menschlichem Blut analysiert. Die Anzahl der Blutzellen, die Aktivierung der Thrombozyten, die Gerinnung, das Komplementsystem und die Entzündung wurden nach der Inkubation von Blut ohne HFMs (Negativkontrolle), mit unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder DBCO-beschichteten und endothelialisierten HFMs bestimmt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der weißen oder roten Blutkörperchen im Vergleich zu Blutproben ohne HFM festgestellt (Figur 9). Allerdings wurde ein signifikanter Rückgang der Thrombozytenzahl nach der Inkubation von Blut mit unbeschichteten oder DBCO-beschichteten HFM festgestellt, während endothelialisierte Membranen den Verlust von Thrombozyten verhinderten. Neben der Thrombozytenzahl wurde auch die P-Selektin-Expression auf den Thrombozyten als Marker für die Thrombozytenaktivierung analysiert. Wie in Figur 9 dargestellt, wurde auf unbeschichteten und DBCO-beschichteten HFM im Vergleich zu den Blutproben ohne HFM eine signifikant höhere Anzahl aktivierter Thrombozyten nachgewiesen. Die endothelialisierten Membranen verhinderten jedoch die Aktivierung der Thrombozyten.
[0076] Darüber hinaus wurde nach der Inkubation der HFMs mit Blut die Adhäsion von Thrombozyten und Monozyten sowie die Bildung von Fibrin auf der Oberfläche der HFMs mittels REM analysiert (Figur 10). Die Endothelialisierung der HFM-Oberfläche führte zur Bildung einer glatten, konfluierenden Endothelzellschicht. Nach der Inkubation unmodifizierter HFMs mit frischem menschlichem Blut wurde auf der Oberfläche ein starkes Fibrinnetzwerk mit eingeschlossenen Erythrozyten festgestellt. Auch die DBCO-beschichteten HFM- Oberflächen zeigten eine Fibrinnetzbildung. Die Inkubation der endothelialisierten Oberfläche mit menschlichem Blut verhinderte jedoch die Bildung von Fibrinnetzwerken auf der Oberfläche der HFMs stark. An einigen Stellen wurden auch zellähnliche Strukturen festgestellt, bei denen es sich um abgeschilferte Endothelzellen handeln könnte, die durch die Trocknung am kritischen Punkt entstanden sind, oder um adhärente Monozyten.
[0077] Nach der Inkubation von Blut mit unbeschichteten und DBCO-funktionalisierten HFM wurden signifikant erhöhte Werte des Thrombin-Antithrombin-Ill-Komplexes (TAT), einem Indikator für die Gerinnungsaktivierung, und ß-Thromboglobulin, einem Marker für die Thrombozytenaktivierung, festgestellt (Figur 11). Im Gegensatz dazu verhinderten en- dothelialisierte HFM die Aktivierung der Gerinnung und der Blutplättchen wirksam. Hinsichtlich der Aktivierung der Entzündung (PMN-Elastase) und des Komplementsystems (sC5b-9) wurden keine signifikanten Veränderungen zwischen Blutproben ohne HFM (Ne- gativkontrolle) und verschiedenen HFM-Modifikationen gemessen.
2.9 Entzündungsstatus des Endothels auf HFMs
[0078] Nach der Endothelialisierung von HFMs wurde die Expression von Adhäsionsmolekülen vor und nach der Inkubation mit Blut für 90 Minuten analysiert, um den Aktivierungsstatus der Endothelzellen zu bestimmen. HLIVECs, die in einer 6-Well-Platte kultiviert wurden, dienten als Kontrolle. Interessanterweise reduzierte die Inkubation von enthothelialisierten HFM mit Blut die Expression von E-Selektin und VCAM-1 im Vergleich zu enthothelialisierten HFM ohne Blutkontakt (Figur 12).
3. Fazit
[0079] Die Erfinder stellen ein Verfahren bereit, mit dem auf sehr spezifische und selektive Art und Weise biologische Zellen kovalent an Oberflächen gebunden werden können. Dies ermöglicht eine effiziente Besiedelung der Oberflächen bspw. mit Endothelzellen, um die Erkennung der Oberflächen als "fremd" zu verhindern. Die Methode kann auch eingesetzt werden um patienteneigene EPCs oder "iPSC-derived" Endothelzellen auf gewünschte Oberflächen von blutkontaktierenden Materialien zu binden. Es können off-the-shelf Produkte hergestellt werden, die bei Bedarf mit patienteneigenen Endothelzellen besiedelt werden. Die Konjugation der Zellen an die Oberfläche erfolgt ohne Katalysator unter physiologischen Bedingungen.

Claims

Patentansprüche Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren und/oder besiedelten Oberfläche, das folgende Schritte aufweist:
1 . Bereitstellen einer Hydroxylgruppen (-OH) aufweisenden Oberfläche,
2. Silanisierung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche,
3. Konjugation eines in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden an die silanisierte Oberfläche. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch folgenden weiteren Schritt:
4. Inkubation der Oberfläche mit biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) aufweisen, unter Bedingungen, die in einer kupferfreien Klick-Reaktion die Konjugation der Azidgruppe mit dem Reaktanden erlauben. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktand aus Schritt 3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cycloalkin, Dibenzocyc- looctin (DBCO), Cycloalkin-Ester, DBCO-PEG4-NHS-Ester, Phoshin und Phosphin- Ester. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die Bereitstellung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche durch Sauerstoffplasmabehandlung einer Oberfläche erfolgt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: künstliche Lunge, Oxygenator, künstliche Niere, Prothese, Gefäßprothese, Stent, Kunstherz. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Oberfläche einer Hohlfasermembran (HFM) ist, vorzugsweise einer Polymethylpenten- oder Polypropylen-HFM. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen Endothelzellen sind. Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhalten wurde. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus künstliche Lunge, Oxygenator, künstliche Niere, Prothese, Gefäßprothese, Stent, Kunstherz. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Hohlfasermembran (HFM) ist, vorzugsweise eine Polymethylpenten oder Polypro- pylen-HFM. Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen, das folgende Schritte aufweist:
1. Bereitstellung einer Oberfläche, die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist,
2. Inkubation der Oberfläche mit biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) aufweisen, unter Bedingungen, die in einer kupferfreien Klick-Reaktion die Konjugation der Azidgruppe mit dem Reaktanden erlauben. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweisende Oberfläche mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhalten wurde. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N3) aufweisen, durch Inkubation von biologischen Zellen mit einem Azidzucker erhalten wurden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ac4ManNAz (N-Azidoacetylmannosamine- tetraacylated), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac4GlcNAz), N- azidoacetylgalactosamine-tetraacylated (Ac4GalNAz) und anderen Azid-funktiona- lisierten Glykokonjugate. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen Endothelzellen sind.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309660B1 (en) 1999-07-28 2001-10-30 Edwards Lifesciences Corp. Universal biocompatible coating platform for medical devices
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309660B1 (en) 1999-07-28 2001-10-30 Edwards Lifesciences Corp. Universal biocompatible coating platform for medical devices
CN110545754A (zh) 2017-04-13 2019-12-06 祥丰医疗私人有限公司 用聚多巴胺和抗体涂覆的医疗设备
WO2020190214A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Jmedtech Coating Technologies Pte Ltd Medical device comprising covalently bonded heparin coating

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVCI-ADALI, M. ET AL.: "Current concepts and new developments for autologous in vivo endothelialisation of biomaterials for intravascular applications", EUROPEAN CELLS & MATERIALS, vol. 21, 2011, pages 157 - 176
CORNELISSEN, C.G. ET AL.: "Fibronectin coating of oxygenator membranes enhances endothelial cell attachment", BIOMED ENG ONLINE, vol. 12, 2013, pages 7, XP021146904, DOI: 10.1186/1475-925X-12-7
DE MEL, A.B.G. COUSINSA.M. SEIFALIAN: "Surface modification of biomaterials: a quest for blood compatibility", INT J BIOMATER, vol. 2012, 2012, pages 707863
EISSES, M.J. ET AL.: "Effect of polymer coating (poly 2-methoxyethylacrylate) of the oxygenator on hemostatic markers during cardiopulmonary bypass in children", J CARDIOTHORAC VASC ANESTH, vol. 21, no. 1, 2007, pages 28 - 34, XP005874302, DOI: 10.1053/j.jvca.2006.03.023
GULACK, B.C.S.A. HIRJIM.G. HARTWIG: "Bridge to lung transplantation and rescue post-transplant: the expanding role of extracorporeal membrane oxygenation", J THORAC DIS, vol. 6, no. 8, 2014, pages 1070 - 1079
KOO, H. ET AL.: "Bioorthogonal Copper-Free Click Chemistry In Vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles", ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION, vol. 51, no. 47, 2012, pages 11836 - 11840, XP002758195, DOI: 10.1002/anie.201206703
LAUGHLIN, S.T. ET AL.: "In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish", SCIENCE, vol. 320, no. 5876, 2008, pages 664 - 667, XP055383745, DOI: 10.1126/science.1155106
MIYAHARA KOKI ET AL: "A Cu-free clickable surface with controllable surface density", COLLOID & POLYMER SCIENCE, SPRINGER VERLAG, HEIDELBERG, DE, vol. 297, no. 6, 8 May 2019 (2019-05-08), pages 927 - 931, XP036791405, ISSN: 0303-402X, [retrieved on 20190508], DOI: 10.1007/S00396-019-04515-4 *
MOLLER, L. ET AL.: "Towards a biocompatible artificial lung: Covalent functionalization of poly(4-methylpent-1-ene) (TPX) with cRGD pentapeptide", BEILSTEIN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 9, 2013, pages 270 - 277
PAPPALARDO, F. ET AL.: "Bioline heparin-coated ECMO with bivalirudin anticoagulation in a patient with acute heparin-induced thrombocytopenia: the immune reaction appeared to continue unabated", PERFUSION, vol. 24, no. 2, 2009, pages 135 - 137
PIERI, M. ET AL.: "A new phosphorylcholine-coated polymethylpentene oxygenator for extracorporeal membrane oxygenation: a preliminary experience", PERFUSION, vol. 28, no. 2, 2013, pages 132 - 137
WALLRODT, S. ET AL.: "Bioorthogonally Functionalized NAD(+) Analogues for In-Cell Visualization of Poly(ADP-Ribose) Formation", ANGEW CHEM INT ED ENGL, vol. 55, no. 27, 2016, pages 7660 - 7664
WENDEL, H.P.G. ZIEMER: "Coating-techniques to improve the hemocompatibility of artificial devices used for extracorporeal circulation", EUR J CARDIOTHORAC SURG, vol. 16, no. 3, 1999, pages 342 - 350
WIEGMANN BETTINA ET AL: "Developing a biohybrid lung - sufficient endothelialization of poly-4-methly-1-pentene gas exchange hollow-fiber membranes", JOURNAL OF THE MECHANICAL BEHAVIOR OF BIOMEDICAL MATERIALS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 60, 11 February 2016 (2016-02-11), pages 301 - 311, XP029556100, ISSN: 1751-6161, DOI: 10.1016/J.JMBBM.2016.01.032 *
WIEGMANN, B. ET AL.: "Developing a biohybrid lung - sufficient endothelialization of poly-4-methly-1-pentene gas exchange hollow-fiber membranes", J MECH BEHAV BIOMED MATER, vol. 60, 2016, pages 301 - 311, XP029556100, DOI: 10.1016/j.jmbbm.2016.01.032
XIE, R. ET AL.: "In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 113, no. 19, 2016, pages 5173 - 5178

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