DE102021123779A1

DE102021123779A1 - Besiedelung von Oberflächen mit biologischen Zellen

Info

Publication number: DE102021123779A1
Application number: DE102021123779.3A
Authority: DE
Inventors: Meltem Avci-Adali; Denis Canjuga
Original assignee: Eberhard Karls Univ Tuebingen Medizinische Fakultaet Anstalt Des Oeffentlichen Rechts; Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet Anstalt Des Oeffentlichen Rechts
Current assignee: Eberhard Karls Univ Tuebingen Medizinische Fakultaet Anstalt Des Oeffentlichen Rechts; Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet Anstalt Des Oeffentlichen Rechts
Priority date: 2021-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2023-03-16
Also published as: KR20240055861A; CA3231506A1; WO2023041275A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, eine Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, und ein Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, eine Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, und ein Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen.
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist weltweit die dritthäufigste Todesursache, und die Lungentransplantation ist die einzige kurative Behandlungsoption für Patienten mit Lungenerkrankungen im Endstadium, wie der COPD, interstitiellen Lungenerkrankung, zystischen Fibrose und Lungenödemen. Im Jahr 2017 konnten nur 77 % der für eine Lungentransplantation angemeldeten Patienten in Deutschland eine Lunge erhalten, was bedeutet, dass 23 % dieser Patienten auf der Warteliste jedes Jahr sterben. Selbst nach erfolgreicher Transplantation liegt die mediane Überlebensrate für Lungenempfänger nur bei 5,3 Jahren. Es besteht also ein dringender Bedarf an künstlichen Lungen, die die Funktion der Lunge für einen längeren Zeitraum übernehmen können, um die Zeit bis zur Transplantation zu überbrücken.
Bei schwerem Atemversagen wird die extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) durchgeführt, indem das Blut des Patienten kontinuierlich durch einen gasdurchlässigen Membranoxygenator (künstliche Lunge) gepumpt wird, der den Gasaustauschprozess der Lunge nachahmt. Standard-Blutoxygenatoren bestehen aus Bündeln mikroporöser Hohlfasermembranen (HFM), die meist aus Polypropylen (PP) oder Polymethylpenten (PMP) bestehen und eine große Oberfläche (~ 2 m²) haben, um die klinisch erforderlichen Transportraten für O₂ und CO₂ zu erreichen. In den meisten künstlichen Lungen fließt der Sauerstoff durch die Lumina der Hohlfasern und das Blut durch die Zwischenräume im Hohlfaserbündel.
Trotz der Behandlung der Patienten während der ECMO mit gerinnungshemmenden Medikamenten, meist Heparin, führt die Fremdmaterialoberfläche der künstlichen Lungen immer noch zu einer Aktivierung des Gerinnungs- und Komplementsystems und erschwert deren langfristigen Einsatz, so dass sie derzeit nur für einen sehr begrenzten Zeitraum von Tagen bis wenigen Wochen verwendet werden können [Gulack, B.C., S.A. Hirji, and M.G. Hartwig, Bridge to lung transplantation and rescue post-transplant: the expanding role of extracorporeal membrane oxygenation. J Thorac Dis, 2014. 6(8): S. 1070-1079]. Seit Jahrzehnten wird intensiv an der Verbesserung der Hämokompatibilität von blutkontaktierenden künstlichen Geräten geforscht [de Mel, A., B.G. Cousins, and A.M. Seifalian, Surface modification of biomaterials: a quest for blood compatibility. Int J Biomater, 2012. 2012: S. 707863; Wendel, H.P. and G. Ziemer, Coating-techniques to improve the hemocompatibility of artificial devices used for extracorporeal circulation. Eur J Cardiothorac Surg, 1999. 16(3): S. 342-350]. Bisher wurden blutberührende Oxygenatoroberflächen z.B. mit Phosphorylcholin [Pieri, M., et al., A new phosphorylcholinecoated polymethylpentene oxygenator for extracorporeal membrane oxygenation: a preliminary experience. Perfusion, 2013. 28(2): S. 132-137], Heparin [Pappalardo, F., et al., Bioline heparin-coated ECMO with bivalirudin anticoagulation in a patient with acute heparin-induced thrombocytopenia: the immune reaction appeared to continue unabated. Perfusion, 2009. 24(2): S. 135-137] oder Poly-2-methoxyethylacrylat (PMEA) [Eisses, M.J., et al., Effect of polymer coating (poly 2-methoxyethylacrylate) of the oxygenator on hemostatic markers during cardiopulmonary bypass in children. J Cardiothorac Vasc Anesth, 2007. 21 (1): S. 28-34.] beschichtet.
Die Beschichtung von Oberflächen mit Polydopamin ist bspw. aus der CN 110545754 bekannt, die Beschichtung mit Polymeren aus der US 6,309,660 . Beide Ansätze haben sich aber in der Praxis nicht bewährt.
Der gängigste Ansatz besteht darin, die Oberflächen mit Heparin zu beschichten, wie z.B. beschrieben in der WO 2020/190214 . Mit der Zeit kann sich das Heparin jedoch von der Oberfläche lösen und zur Bildung von Thromben führen. Zusätzlich zu den Komplikationen wie Blutungen birgt die Langzeitexposition gegenüber Heparin das Risiko, dass der Patient eine Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) entwickelt. Dabei werden Antikörper gegen den Komplex Heparin und Plättchenfaktor 4 (PF4) gebildet, die durch eine starke Aktivierung der Blutplättchen, eine erhöhte Thrombinbildung und -aktivierung zu schweren thromboembolischen Komplikationen führen können.
Wie in einem Übersichtsartikel [Avci-Adali, M., et al., Current concepts and new developments for autologous in vivo endothelialisation of biomaterials for intravascular applications. European cells & materials, 2011. 21: S. 157-176] ausführlich beschrieben, wurden verschiedene Fängermoleküle und Strategien zur Endothelialisierung blutberührter Implantate eingesetzt. Bislang wurden HFM mit Heparin/Albumin [Wiegmann, B., et al., Developing a biohybrid lung - sufficient endothelialization of poly-4-methly-1-pentene gas exchange hollow-fiber membranes. J Mech Behav Biomed Mater, 2016. 60: S. 301-311], cRGD [Moller, L., et al., Towards a biocompatible artificial lung: Covalent functionalization of poly(4-methylpent-1-ene) (TPX) with cRGD pentapeptide. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2013. 9: S. 270-277] oder Fibronektin [Cornelissen, C.G., et al., Fibronectin coating of oxygenator membranes enhances endothelial cell attachment. Biomed Eng Online, 2013. 12: S. 7] beschichtet, um die Endothelialisierung zu unterstützen. Diese Strategien haben jedoch mehrere Einschränkungen, z.B. kann die Beschichtung der Oberflächen mit Fibronektin zu einer unspezifischen Anlagerung unerwünschter Zellen führen, und die nicht-enthothelialisierten Bereiche können Thrombozyten aktivieren und zu einer Thrombose führen. Auch die Verwendung von cRGD zur Bindung von Endothelzellen („ECs“) ist unspezifisch. Mehrere Zellen, darunter auch Thrombozyten, haben cRGD-bindende Integrine auf ihrer Oberfläche, was zu einer unspezifischen Adhäsion von Zellen an der blutberührenden Oberfläche führen kann. Es bedarf also noch einer effizienten Strategie, um blutberührte Bereiche mit ECs zu endothelialisieren und die Hämokompatibilität der künstlichen Lungen zu verbessern.
Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche bereitzustellen, die mit biologischen Zellen besiedelbar ist, bei dem die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden oder zumindest reduziert werden. Insbesondere soll solch eine Oberfläche bereitgestellt werden, die sich derart mit biologischen Zellen besiedeln lässt, dass ein hohes Maß an Biokompatibilität erreicht wird.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche gelöst, das folgende Schritte aufweist:

1. Bereitstellen einer Hydroxylgruppen (-OH) aufweisenden Oberfläche,
2. Silanisierung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche,
3. Konjugation eines in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden an die silanisierte Oberfläche.

Erfindungsgemäß umfasst eine „Oberfläche“ jegliche Fläche, die mit biologischen Zellen, bspw. Endothelzellen, besiedelt werden soll. Darunter fallen u.a., aber nicht ausschließlich, Flächen von Medizinprodukten oder medizinischen Vorrichtungen, wie künstlichen Lungen der Oxygenatoren, bspw. die Wandungen von Membranen, an denen der Gasaustausch stattfindet. Auch Kunststoff- oder Metalloberflächen sind erfindungsgemäß umfasst.
Erfindungsgemäß wird unter „biologischen Zellen“ jede Art von Zelle verstanden, wie bspw. Endothelzellen, aber auch Stammzellen, einschließlich mesenchymale Stammzellen, sowie Vorläuferzellen hiervon oder davon abgeleitete Zellen, wie endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) oder Endothelzellen, die sich von induzierten pluripotenten Stammzellen ableiten („iPSC-derived endothelial cells“).
Die Bereitstellung von Hydroxylgruppen (-OH) an den Oberflächen im Schritt 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Methoden erfolgen. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Behandlung der Oberfläche mit Sauerstoffplasma. So können durch diese Behandlung von Membranen, bspw. Polymethylpenten-Hohlfasermembranen, auf der Oberfläche Hydroxylgruppen generiert werden.
Unter „Silanisierung“ im Schritt 2 des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die chemische Anbindung einer Silanverbindung an die Oberfläche verstanden. Dies kann bspw., aber nicht ausschließlich, durch eine Reaktion der freien Hydroxylgruppen mit 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES) erfolgen.
Im Schritt 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Reaktand, der in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagieren kann, wie bspw., jedoch nicht ausschließlich, Dibenzocyclooctin (DBCO), mit dem Fachmann bekannten Methoden an die silanisierte Oberfläche konjugiert.
Erfindungsgemäß wird unter einer „Klick-Reaktion“, synonym auch als „Klick-Chemie“ bezeichnet, eine Reaktion zwischen Azid und Alkin verstanden, um ein 1,5-disubstituiertes 1,2,3-Triazol zu liefern. Dies erfolgt erfindungsgemäß ohne den Einsatz von Kupfer oder anderen zytotoxischen Katalysatoren unter physiologischen Bedingungen, z.B. im Zellkulturmedium. Dies bedeutet eine Abkehr vom im Stand der Technik eingesetzten „Klick-Reaktionen“. So werden dort vorwiegend Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloadditionen (CuAAC) durchgeführt. Diese Methode ist jedoch durch den Einsatz von Kupfer erfindungsgemäß ungeeignet, da Kupfer die biologischen Zellen schädigt. Die Erfindung schafft durch die Kupferfreiheit Abhilfe.
Die erfindungsgemäß hergestellten Oberflächen sind nun in der Lage, in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden zu reagieren und dadurch Strukturen, die Azidgruppen (N₃) exponieren, kovalent an die Oberfläche zu binden. So lassen sich bspw. Endothelzellen derart funktionalisieren, dass sie an ihren Oberflächen Glykoproteine mit Azidgruppen aufweisen. Diese Gruppen können in einer kupferfreien Klick-Reaktion kovalent an den Reaktand, wie bspw. DBCO, konjugiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit Oberflächen bereit, die effizient und zielgerichtet mit azidmodifizierten biologischen Zellen besiedelt werden können. Da diese Reaktion sehr spezifisch abläuft, werden nur solche biologischen Zellen an die Oberfläche gebunden, die Azidgruppen exponieren. Die unspezifische Bindung unerwünschter Zellpopulationen wird dadurch verhindert. Dies ermöglicht eine effiziente Besiedelung der Oberflächen mit bspw. Endothelzellen, um die Erkennung der Oberflächen als „fremd“ zu verhindern. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch eingesetzt werden, um patienteneigene endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) oder Endothelzellen, die sich von induzierten pluripotenten Stammzellen ableiten („iPSC-derived endothelial cells“), auf gewünschte Oberflächen von blutkontaktierenden Materialien zu binden.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird somit vollkommen gelöst.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Reaktand aus Schritt 3 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Cycloalkin, Cycloalkin-Ester, Phoshin und Phosphin-Ester.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Reaktanden zum Einsatz kommen, die geeignet sind, um in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagieren zu können und damit erfindungsgemäß besonders funktionell sind. Dabei reagieren Phosphin-Gruppen mit den Azidgruppen in einer sogenannten Staudinger-Reaktion. Diese Reaktion zeigt langsame Reaktionskinetiken von etwa 10^-3 M^-1s^-1. Cycloalkine reagieren mit den Azidgruppen in einer sog. ‚strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction‘ (SPAAC). Die Reaktion 2. Ordnung hat eine moderate Geschwindigkeitskonstante von 10^-2 - 1 M^-1s^-1.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kommt als Reaktand das Cycloalkin Dibenzocyclooctin (DBCO) und/oder der Cycloalkin-Ester DBCO-PEG₄-NHS-Ester zum Einsatz.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Reaktanden zum Einsatz kommen, die sich nach Erkenntnissen der Erfinder besonders bewährt haben. Dabei war die erfindungsgemäße Eignung von DBCO besonders überraschend. So sind im Stand der Technik zwar Verwendungsmöglichkeiten beschrieben, wie mittels DBCO Moleküle, i.d.R. Proteine, funktionalisiert werden können: siehe z.B. Wallrodt, S., et al., Bioorthogonally Functionalized NAD(+) Analogues for In-Cell Visualization of Poly(ADP-Ribose) Formation. Angew Chem Int Ed Engl, 2016. 55(27): S. 7660-7664; Laughlin, S.T., et al., In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science, 2008. 320(5876): S. 664-667; Xie, R., et al., In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016. 113(19): S. 5173-5178; Koo, H., et al., Bioorthogonal Copper-Free Click Chemistry In Vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angewandte Chemie-International Edition, 2012. 51(47): p. 11836-11840. Eine Konjugation von DBCO an eine sialisierte Oberfläche zum Zwecke der anschließenden Besiedlung mit biologischen Zellen ist im Stand der Technik jedoch bislang nicht beschrieben.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt 1 die Bereitstellung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche durch Sauerstoffplasmabehandlung einer Oberfläche.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Verfahren zum Einsatz kommt, dass sich zur Erzeugung von Hydroxylgruppen auf der Oberfläche besonders gut eignet.
Dabei handelt es sich in einer Ausführungsform der Erfindung bei der Oberfläche um eine solche einer medizinischen Vorrichtung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: künstliche Lunge, Oxygenator, künstliche Niere, Prothese, Gefäßprothese, Stent, Kunstherz.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Verfahren dort zum Einsatz kommt, wo die Besiedelung von Oberflächen mit biologischen Zellen für die Funktionalität und Biokompatibilität der Vorrichtungen besonders wesentlich ist. Bei einem Einsatz im Patienten kann damit verhindert werden, dass die Vorrichtung als „fremd“ erkannt wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Oberfläche eine Oberfläche einer Hohlfasermembran (HFM), vorzugsweise einer Polymethylpenten- oder Polypropylen-HFM.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Verfahren bei besonders praxisrelevanten blutkontaktierenden Oberflächen zum Einsatz kommt, die bspw. in Oxygenatoren verwendet werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die biologischen Zellen Endothelzellen.
Mit dieser Maßnahme können solche Zellen an die Oberflächen gebunden werden, denen für die Funktionalität wichtiger medizinischer Vorrichtungen, wie künstlichen Lungen, eine besondere Bedeutung zukommt.
In eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die biologischen Zellen an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) auf.
Mit dieser Maßnahme werden auf vorteilhafte Art und Weise die technischen Voraussetzungen dafür geschaffen, dass die Zellen in einer kupferfreien Klick-Reaktion an die erfindungsgemäß hergestellte Oberfläche gebunden werden können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, vorzugsweise eine künstliche Lunge, ein Oxygenator, künstliche Niere, eine Prothese, eine Gefäßprothese, ein Stent, ein Kunstherz oder eine Hohlfasermembran (HFM) wie eine Polymethylpenten oder Polypropylen-HFM, wobei die Oberfläche einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist. Vorzugsweise wurde die mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten.
Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens gelten in entsprechender Art und Weise auch für die erfindungsgemäße Vorrichtung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen, das folgende Schritte aufweist:

1. Bereitstellung einer Oberfläche, die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist,
2. Inkubation der Oberfläche mit biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) aufweisen, unter Bedingungen, die in einer kupferfreien Klick-Reaktion die Konjugation der Azidgruppe mit dem Reaktanden erlauben.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Besiedelungsverfahrens wurde die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweisende Oberfläche mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Besiedelungsverfahrens wurden die biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) aufweisen, durch Inkubation von biologischen Zellen mit einem Azidzucker erhalten, der vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ac4ManNAz (N-Azidoacetylmannosamine-tetraacylated), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac4GIcNAz), N-azidoacetylgalactosamine-tetraacylated (Ac4GalNAz) und anderen Azid-funktionalisierten Glykokonjugaten.
Durch diese Maßnahme werden auf vorteilhafte Art und Weise biologische Zellen erhalten, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) exponieren. Die angegebenen Azidzucker sind dabei für die Funktionalisierung der Zellen besonders geeignet. Die Azidzucker werden wie ihre natürlichen Analoga in die Zellen aufgenommen und in Glykoproteine eingebaut. Dies führt dazu, dass die Zellen auf der Zelloberfläche Glykoproteine haben, die mit Azidgruppen (-N₃) versehen sind. Diese Gruppen können mittels Klick-Chemie kovalent an die Oberfläche konjugiert werden. Durch die Inkubation der modifizierten Zellen mit den modifizierten HFMs kommt es zu einer bio-orthogonalen Reaktion, die Alkingruppe des Reaktanden bzw. DBCOs reagiert mit dem Azid auf der Oberfläche der Zellen. Dies passiert sehr spezifisch, sodass nur modifizierte Zellen mit Azid-Molekülen an die Reaktanden auf der Membran binden können. Das Binden der Zellen an der Membran und die weitere Inkubation in Zellkulturmedium führen zur Proliferation und letztendlich zur Besiedelung der Membran mit einem konfluentem Monolayer aus Zellen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Besiedelungsverfahrens sind die biologischen Zellen Endothelzellen.
Mit dieser Maßnahme werden die Oberflächen mit solchen Zellen besiedelt, denen für die Funktionalität wichtiger medizinischer Oberflächen bzw. Vorrichtungen eine besondere Bedeutung zukommt. Besonders geeignet sind primäre Endothelzellen, die aus Nabelschnurrblut isoliert wurden, sogenannte Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs), die in VascuLife® EnGS Endothelial Medium Complete Kit bis zur Endothelialisierung kultiviert werden. In einer Ausführungsform kann die Besiedelung mit den Endothelzellen in EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit stattfinden. Polymethylpentene HFMs (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Germany), APTES, Methanol, Toluol (Sigma-Aldrich, Darmstadt), DBCO-PEG4-NHS ester (Jena Bioscience, Jena, Germany), Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), (Invitrogen), N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz, Sigma Aldrich, Germany), DMSO (Sigma-Aldrich).
Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens gelten in entsprechender Art und Weise auch für das erfindungsgemäße Besiedelungsverfahren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert. Die dort erwähnten Merkmale gelten nicht nur in Bezug auf das konkrete Beispiel, sondern auch in isolierter Form als zur Erfindung gehörend.
Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:

1: Schematische Darstellung der Funktionalisierung der PMP-Hohlfasermembranen (HFMs). a) Erzeugung von Hydroxylgruppen durch O₂-Plasmabehandlung. b) Silanisierung der plasmabehandelten HFMs mit APTES. c) Einführung von Cyclooctyne-Gruppen durch kovalente Bindung von DBCO-PEG4-NHS-Estern. d) Klick-Reaktion von modifizierten HFM mit metabolisch veränderten Endothelzellen.
2: Detektion der erzeugten funktionellen Gruppen auf PMP-Hohlfasermembranen (HFMs). (A) Zum Nachweis der Aminogruppen nach APTES-Behandlung der HFM wurden die HFM mit Methylorange angefärbt, und die Absorption von an der Oberfläche gebundenem und eluiertem Methylorange wurde mit einem Spektralphotometer gemessen. Unbehandelte und mit O₂-Plasma behandelte HFMs wurden als Negativkontrollen verwendet. (n=3). (B) Zum Nachweis von DBCO-Gruppen auf der Oberfläche von unbehandelten, mit APTES oder DBCO-PEG-NHS-Ester behandelten HFM wurden die HFM mit Cy3-Azid inkubiert. Das konjugierte Cy3-Azid wurde mit einem Fluoreszenz-Lesegerät (n=3) oder (C) durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Die statistische Analyse wurde mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey-Vergleichstest durchgeführt. (*** p < 0,001, **** p < 0,0001).
3: Ergebnis der REM-Analysen. Es gibt keine visuellen Unterschiede auf der Oberfläche der HFM, die nur mit APTES oder APTES und DBCO-PEG₄-NHS-Ester behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten HFM.
4: Metabolische Markierung von HUVECs mit Ac4ManNAz und Analyse der Zelllebensfähigkeit. 2×10⁵ HUVECs wurden 48 h lang mit und ohne 50 µM Ac4ManNAz inkubiert. A) Die Zellen wurden 1 h lang mit 5 µM DBCO-Sulfo-Cy3 inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen mit DPBS und der Färbung des Zytoskeletts mit ActinGreen und der Zellkerne mit DAPI wurden fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen gemacht. B) Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit 5 µM DBCO-Sulfo-Cy3 inkubiert und nach dem Waschen mit DPBS wurden durchflusszytometrische Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD (n=3) angegeben. C) Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem PrestoBlue-Assay bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM (n=3) angegeben. Die statistische Analyse wurde mit einem zweiseitigen gepaarten t-Test durchgeführt. (** p < 0,01, ns: nicht signifikant).
5: Analyse der Endothelialisierung von modifizierten Hohlfasermembranen (HFMs). Unbehandelte, APTES- oder DBCO-funktionalisierte HFMs wurden mit HUVECs inkubiert. Dazu wurden 5,2 × 10⁶ HUVECs ohne (w/o) oder mit metabolischer Markierung mit Ac4ManNAz 24 h lang dynamisch inkubiert und dann 24 h lang unter statischen Bedingungen kultiviert. A) Die angehefteten Zellen wurden durch Calcein AM-Färbung und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Abgebildet sind repräsentative Bilder von drei Experimenten. B) Quantifizierung der gebundenen HUVECs auf HFMs mithilfe eines Fluoreszenz-Readers. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM (n=3) angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey's Multiple Comparison Test. (*p < 0,05, ** p< 0,01). C) Nachweis von Zell-Zell-Kontakten von HUVECs, die an die DBCO-beschichteten Membranen gebunden sind, durch Färbung mit anti-humanem VE-Cadherin (grün) und DAPI als Kernfärbung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
6: Analyse der Reaktion der endothelialisierten Oberfläche auf einen Entzündungsreiz mittels qRT-PCR. Endothelialisierte HFM wurden mit 50 ng/ml TNF-α behandelt, und die Expression von Adhäsionsmolekülen (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1) wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Die mRNA-Werte wurden auf die GAPDH-mRNA-Werte normalisiert, und die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM relativ zu den Expressionswerten in der Negativkontrolle (endothelialisierte HFM ohne TNF-α-Stimulation) angegeben. Die Unterschiede wurden mit einem einseitigen t-Test ermittelt. (n=3). (*p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).
7: Bestimmung der Blutzellzahl nach Inkubation von menschlichem Blut mit unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFM. Blutproben ohne HFM wurden als Negativkontrolle verwendet. Die Inkubation des Blutes erfolgte für 90 Minuten bei 37 °C. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen, der roten Blutkörperchen und der Blutplättchen wurde mit einem Zellzähler bestimmt. Darüber hinaus wurden die aktivierten Thrombozyten durch Färbung mit einem anti-humanen CD62P-Antikörper und durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die Daten sind als Mittelwert + SD angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels einseitiger ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest. (*p < 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001).
8: Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder von unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFMs 90 Minuten nach der Inkubation mit menschlichem Blut oder endothelialisierten HFMs ohne Blutkontakt. (n=3).
9: Analyse der Hämokompatibilität von unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFM. Nach 90-minütiger Inkubation mit frischem menschlichem Blut wurden die Aktivierung der Gerinnung (Thrombin-Antithrombin-III-Komplex (TAT)), der Thrombozyten (β-Thromboglobulin), des Komplementsystems (sC5b-9) und der Entzündung (PMN-Elastase) mittels ELISA bestimmt (n=4). Die Daten sind als Mittelwert + SD angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest. (**p< 0,01, ***p< 0,001, und ****p< 0,0001).
10: Analyse des Entzündungsstatus der endothelialisierten Oberfläche von HFMs mittels qRT-PCR. Endothelialisierte HFMs wurden 90 Minuten lang bei 37°C mit menschlichem Blut inkubiert, und die Expression von Adhäsionsmolekülen (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1) wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Die mR-NA-Werte wurden auf die GAPDH-mRNA-Werte normiert, und die Ergebnisse werden als Mittelwert + SEM im Verhältnis zu den Expressionswerten in der Kontrolle (HUVECs auf Zellkulturplatte) angegeben. Die Unterschiede wurden mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest ermittelt. (n=3). (*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001).

Beispiele
1. Material und Methoden
2.1 Kultivierung von humanen Nabelvenenendothelzellen (HUVECs)
HUVECs (ATCC®, Manassas, USA) wurden in T75-Zellkulturflaschen, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet waren, ausgesät und bei 37°C und 5 % CO₂ in Vasculife® EnGS EC-Kulturmedium (CellSystems, Troisdorf, Deutschland) mit VascuLife EnGS LifeFactors Kit, 50 mg/ml Gentamicin und 0,05 mg/ml Amphotericin B (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) kultiviert. Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Nach Erreichen von 80 % Konfluenz wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA (0,04 %/0,03 %, PromoCell, Heidelberg, Deutschland) abgelöst.
2.2 Funktionalisierung von Hohlfasermembranen (HFMs) mit DBCO
Die Oberfläche von Polymethylpenten-HFMs (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Deutschland) wurde in einem dreistufigen Verfahren beschichtet (1). Zunächst wurde die Oberfläche mit O₂-Plasma behandelt, und im zweiten Schritt wurde die Silanisierung durchgeführt. Im dritten Schritt wurde Dibenzylcyclooctyne-PEG4-NHS-Ester (DBCO-PEG4-NHS-Ester) an die silanisierte Oberfläche konjugiert. Dazu wurden PMP-Membranen auf eine Größe von 3 × 3 cm geschnitten und durch Behandlung mit O₂-Plasma (Denta Plas®, Diener electronic, Ebhausen, Deutschland) für 30 min bei einem Druck von 0,3 mbar (± 0,20 mbar) und einer Leistung von 80% (± 5%) Hydroxylgruppen erzeugt. Anschließend wurden die HFMs 30 Minuten lang in Toluol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) mit 2 % (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES, Sigma-Aldrich) auf einem Schüttler bei 20 U/min inkubiert. Die Membranen wurden dann in 100%igem Toluol, 50%igem Toluol/50%igem Methanol und 100%igem Methanol jeweils 2 Minuten lang sonifiziert, um ungebundenes oder schwach gebundenes APTES zu entfernen. Nach dem Trocknen wurden die Membranen 30 Minuten lang in 400 µM DBCO-PEG₄-NHS-Ester (Jena Bioscience, Jena, Deutschland) mit Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (Invitrogen, Carlsbad, USA) inkubiert, um Cyclooctin-Gruppen einzuführen, und dreimal mit frischem DPBS gewaschen.
2.3 Quantifizierung der auf der HFM-Beschichtung gebildeten funktionellen Gruppen
Nachweis von Aminogruppen nach APTES-Behandlung
Zum Nachweis der Aminogruppen auf der HFM-Oberfläche wurden die Membranen 5 Stunden lang in 0,5 mM Methylorange (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit 1 mM HCl-Lösung. Die Desorption von gebundenem Methylorange von der HFM-Oberfläche erfolgte mit 0,4 ml einer 1 mM NaOH-Lösung über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler. Zum Nachweis von Methylorange wurden 100 µl der Desorptionslösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte gegeben. Die Absorption wurde bei 465 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Eon Synergy 2, Bio Tek Instruments Inc., Winooski USA) gemessen.
Nachweis von DBCO-Gruppen nach der Konjugation von DBCO-PEG4-NHS-Ester
Nach der Inkubation mit DBCO-PEG4-NHS-Ester wurden die HFM in DPBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ 1 Stunde lang mit 80 µg/ml Cy3-Azid (Sigma-Aldrich) inkubiert, um das Cy3-Azid an die DBCO-funktionalisierte HFM-Oberfläche zu binden. Die HFMs wurden dann fünfmal mit 100 %igem Ethanol gewaschen und die Färbung der Membranen wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie (Axiovert 135, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) nachgewiesen. Außerdem wurde die Fluoreszenzintensität auf den Membranen mit einem Mikroplattenlesegerät (Mithras 940, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) bei einer Anregungswellenlänge von 500 nm und einer Emissionswellenlänge von 600 nm quantifiziert. HFM ohne Behandlung und nur mit APTES-Behandlung wurden als Kontrollen verwendet.
2.4 Metabolische Markierung von HUVECs mit Azidgruppen und Nachweis der Azidmarkierung
Um die Zelloberfläche von HUVECs mit Azidgruppen zu funktionalisieren, wurden 2 × 10⁵ HUVECs pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ausgesät und mit oder ohne 50 µM N-Azidoacetylmannosamin-tetraacyliert (Ac4ManNAz, Sigma Aldrich) in 2 ml Medium für 48 h bei 37°C mit 5% CO₂ behandelt. Zum Nachweis der gebildeten Azidogruppen wurden die Zellen mit DPBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ gewaschen und mit 5 µM DBCO-Sulfo-Cy3 (Jena Bioscience, Deutschland) in DPBS mit Ca²⁺/Mg²⁺ für 1 h bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit 10 ml DPBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA (0,04 %/0,03 %) abgelöst und 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0,5 ml DPBS resuspendiert, und die Cy3-Markierung von 10.000 Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS SCAN, BD, Heidelberg, Deutschland) analysiert. Zusätzlich zu den durchflusszytometrischen Analysen wurden die Zellen 30 Minuten lang mit ActinGreen™ 488 ReadyProbes® Reagenz (Invitrogen) für das Zytoskelett und 5 Minuten lang mit 0,2 µg/ml DAPI (Sigma Aldrich) zur Visualisierung der Zellkerne gefärbt.
2.5 Analyse der Lebensfähigkeit der Zellen nach metabolischer Markierung von HUVECs mit Ac4ManNAz
Der Einfluss der metabolischen Markierung auf die Lebensfähigkeit von HUVECs wurde 48 Stunden nach der Markierung mit 50 µM Ac4ManNAz mit dem PrestoBlue-Assay (Invitrogen, Carlsbad, USA) untersucht. Dazu wurden 500 µL 1x Presto Blue Zelllebensfähigkeitsreagenz pro Vertiefung einer 6-Well-Platte zugegeben und 1,5 h bei 37°C inkubiert. Die Fluoreszenzintensität von 100 µL Überstand wurde in dreifacher Ausführung bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 600 nm mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät (Mithras LB 940, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) gemessen.
2.6 Klicken von Endothelzellen an HFM mittels kupferfreier Klick-Chemie
DBCO-beschichtete und unbeschichtete PMP-Membranen (3 × 3 cm) wurden mit 5,2 × 106 Ac4ManNAz-markierten HUVECs in 13 ml EGMTM-2 Endothelzell-Wachstumsmedium BulletKitTM (Lonza, Basel, Schweiz) inkubiert. Die Inkubation erfolgte für 24 Stunden bei 10 U/min mit einem Rotator (Phoenix Instrument, Garbsen, Deutschland) in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ bei 37°C. Nach der Rotationsinkubation wurden die Membranen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte gelegt und für 1 oder 5 Tage unter statischen Bedingungen weiter inkubiert.
2.7 Analyse der Endothelialisierung
Die an den Membranen haftenden HUVECs wurden mit 250 ng/mL Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM; Invitrogen) für 10 Minuten bei 37°C angefärbt. Die gefärbten Zellen wurden mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie (Axio 135, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) nachgewiesen. Außerdem wurde das Fluoreszenzsignal auf der Oberfläche der HFMs vor und nach der Calcein-AM-Färbung bei einer Anregungswellenlänge von 494 nm und einer Emissionswellenlänge von 517 nm mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät (Mithras LB 940, Berthold Technologies) erfasst.
Darüber hinaus wurden die Bildung eines konfluenten Endothelzell-Monolayers und das Vorhandensein von Zell-Zell-Kontakten durch Färbung der Zellen mit einem anti-humanen VE-Cadherin-Antikörper nachgewiesen. Dazu wurden die mit DBCO-PEG₄-NHS-Ester beschichteten und endothelialisierten Membranen mit DPBS gewaschen und in 4 % Paraformaldehyd (v/v) für 10 Minuten bei RT fixiert. Nach dem Waschen mit DPBS erfolgte die Blockierung mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris-Base, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,5) mit 5 % Ziegenserum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) für 30 Minuten bei RT. Die Membranen wurden mit DPBS gewaschen und mit dem 1:100 verdünnten primären Antikörper Maus-Anti-Human-VE-Cadherin (CD144 (16B1), eBioscience, Invitrogen, USA) in DPBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei RT inkubiert. Die Membranen wurden dann dreimal mit DPBS gewaschen und mit 1:400 verdünntem, mit Alexa Fluor 488 markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbiertem sekundärem Antikörper (ThermoFisher, USA) für 1 h in PBS mit 1 % BSA inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit DPBS wurden die Zellkerne 5 Minuten lang mit DAPI (Sigma Aldrich, Darmstadt, Deutschland) 1:2000 verdünnt in DPBS gefärbt. Als Negativkontrolle wurden die Membranen auch mit einem Isotyp-Kontrollantikörper inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie (Axio 135, Carl Zeiss AG, Aoberkochen, Deutschland) nachgewiesen.
2.8 Reaktivität des Endothels auf HFMs auf den Entzündungsreiz
Endothelialisierte HFMs wurden 4 Stunden lang ohne oder mit 50 ng/mL Tumornekrosefaktor α (TNF-α, Sigma-Aldrich) in EGMTM-2-Endothelzell-Wachstumsmedium ohne Hydrocortison inkubiert. Nach der Inkubation wurden die HFMs zweimal mit DPBS gewaschen und die Gesamt-RNA isoliert. Die Expression der Aktivierungsmarker, des endothelialen Leukozytenadhäsionsmoleküls 1 (E-Selektin), des vaskulären Zelladhäsionsmoleküls 1 (VCAM-1) und des interzellulären Adhäsionsmoleküls 1 (ICAM-1), wurde mittels qRT-PCR nachgewiesen. Die mRNA-Konzentrationen wurden auf die GAPDH-mRNA-Konzentrationen normalisiert, und die Ergebnisse wurden relativ zu den Expressionskonzentrationen in endothelialisierten HFM ohne TNF-α-Stimulation dargestellt.
2.9 qRT-PCR

Die Gesamt-RNA der Zellen wurde mit dem Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, München, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. 300 ng RNA wurden mit dem iScript Kit (Bio-Rad) in DNA-Kopien (cDNA) revers transkribiert. Die Amplifikation der Transkripte erfolgte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primern in einer Endkonzentration von 300 nM unter folgenden Bedingungen: ein Zyklus von 3 min bei 95°C, gefolgt von 40 Zyklen von 95°C für 15 s und 72°C für 10 s. Nach 40 Zyklen wurde eine Schmelzkurvenanalyse zum Nachweis der spezifischen Amplifikate durchgeführt. Echtzeit-qRT-PCR-Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung mit einem Gesamtvolumen von 15 µL pro Vertiefung in einem CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) unter Verwendung von IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) durchgeführt. Das konstitutiv exprimierte GAPDH (Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) wurde als Housekeeping-Gen verwendet. Die nachgewiesenen mRNA-Konzentrationen jedes Gens wurden auf GAPDH normalisiert, und die Ergebnisse wurden im Verhältnis zu den mRNA-Kontrollkonzentrationen angegeben. Tabelle 1: Primer, die für die qRT-PCR-Analyse verwendet wurden.

Gen	Vorwärtsprimer (5'->3')	Rückwärtsprimer (5'->3')
GAPDH	TCAACAGCGACACCCACTCC (SEQ ID NO: 1)	TGAGGTCCACCACCCTGTTG (SEQ ID NO: 5)
E-selectin	GCCCAGAGCCTTCAGTGTACC (SEQ ID NO: 2)	GGAATGGCTGCACCTCACAG (SEQ ID NO: 6)
ICAM-1	CTTGAGGGCACCTACCTCTGTC (SEQ ID NO: 3)	CGGCTGCTACCACAGTGATG (SEQ ID NO: 7)
VCAM-1	ACACTTTATGTCAATGTTGCCCC (SEQ ID NO: 4)	GAGGCTGTAGCTCCCCGTTAG (SEQ ID NO: 8)

2.10 Blutentnahme
Menschliches Vollblut wurde mit einer Safety-Multyfly® 20 Gx3/4 TW Nadel (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) aus der antekubitalen Vene gesunder Probanden (n=4) entnommen und in 9 mL Monovetten (Sarstedt) mit 1 IU/mL Natriumheparin (Ratiopharm, Ulm, Deutschland) gefüllt. Die Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigte die Blutentnahme, und alle Probanden gaben ihr schriftliches Einverständnis.
2.11 Durchführung von Hämokompatibilitätsanalysen
Die Inkubation von unmodifizierten, DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFM (3 × 3 cm) mit menschlichen Blutproben erfolgte mit 9 mL heparinisiertem menschlichem Vollblut in Polypropylen-Rundbodenröhrchen (14 mL, BD Biosciences, Deutschland) unter dynamischen Bedingungen für 90 Minuten bei 37°C und 30 U/min. Als Negativkontrolle wurden die Röhrchen mit der gleichen Menge frischem heparinisiertem Blut ohne jegliches Material gefüllt. Nach 90 Minuten dynamischer Inkubation wurden die Blutproben in Röhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (1,6 mg/mL, EDTA, Sarstedt) für die Analyse der Komplementaktivierung und den Nachweis der Zellzahl gesammelt. Zum Nachweis von PMN-Elastase und TAT wurden Röhrchen mit (0,3 mL Citratlösung/3 mL Blut, 0,106 M C₆H₅Na₃O₇ × 2H₂O, Sartstedt) verwendet. Für die β-TG-Analyse wurde das Blut in 2,7 mL CTAD-Röhrchen mit 270 µL 0,109 M CTAD-Lösung, die gepuffertes Natriumcitrat, Theophyllin, Adenosin und Dipyridamol enthält (BD Vacutainer CTAD, Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland), überführt und 15 Minuten auf Eis gelagert. Die EDTA- und CTAD-Präparate wurden bei 2500 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Citratblutpräparate wurden bei 1800 × g für 18 min bei RT zentrifugiert. Das Blutplasma jeder Probe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zu weiteren Untersuchungen bei -80°C gelagert.
Analysen der Blutzellenzahl
Die Anzahl der Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten wurde in den entnommenen Blutproben mit einem automatischen Zellzählsystem (ABX Micros 60, HORIBA Medical, Minami-ku, Kyoto, Japan) gemessen.
Analyse der Aktivierungsmarker im Blutplasma
Zur Bestimmung von Veränderungen der Gerinnung (Thrombin-Antithrombin-III-Komplex (TAT)), des Komplementsystems (sC5b-9) und der Aktivierung von Thrombozyten (β-Thromboglobulin (β-TG)) und Neutrophilen wurden handelsübliche ELISA-Kits (enzymelinked immunosorbent assays) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Daher wurden sC5b-9 (MicroVue™ Complement, Quidel Germany GmbH & AnDiaTec Division, Kornwestheim, Deutschland), TAT (Enzygnost® TAT micro, Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland), polymorphkernige (PMN) Elastase (Demeditec Diagnostics, Kiel, Deutschland) und β-TG (Asserachrom® β-TG, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ, USA) ELISAs verwendet.
Nachweis von aktivierten Thrombozyten
Unbeschichtete, DBCO-beschichtete oder endothelialisierte HFMs wurden wie oben beschrieben mit Blut inkubiert. Nach der 90-minütigen Inkubation der HFMs mit menschlichem Blut wurde das Blut entnommen und 1:5 mit DPBS verdünnt. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei RT mit 10 µl Maus-Anti-Human-CD41-FITC-Antikörper (Firma) zum Nachweis von Thrombozyten und 10 µl Maus-Anti-Human-CD62P-PE-Antikörper (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) zum Nachweis von Thrombozyten, die P-Selektin (CD62P) exprimieren, was eine Thrombozytenaktivierung anzeigt, inkubiert. Die Proben wurden mit 0,5 % Paraformaldehyd fixiert und die Aktivierung der Thrombozyten wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Rasterelektronenmikroskopische (SEM) Analysen der HFM-Oberflächen
Nach der Inkubation von unmodifizierten, DBCO-beschichteten und endothelialisierten HFMs mit Blut wurden die HFMs mit 0,9 %iger Kochsalzlösung (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) gespült und für 24 h in 2,5 %igem Glutaraldehyd (Sigma Aldrich, Darmstadt, Deutschland) in DPBS fixiert. Nach dem Fixierungsschritt wurden die Proben 15 Minuten lang bei RT mit DPBS gewaschen und anschließend in 15-Minuten-Schritten bei RT mit einer aufsteigenden Ethanolreihe (40% -100% Ethanol; Merck-Millipore, Darmstadt, Deutschland) dehydriert. Danach wurden die Proben in einem Kritischer-Punkt-Trockner (Polaron E3100, Quorum Technologies Itd, East Sussex, Vereinigtes Königreich) getrocknet und mit Gold-Palladium-Partikeln (Baltec SCD 050, Bal-Tec AG, Balzers, Liechtenstein) besputtert. Die Bildgebung erfolgte mittels REM (EVO LS 10, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) mit 20-, 500-, 1000- und 5000-facher Vergrößerung.
Analyse des Entzündungsstatus des Endothels auf HFMs
Nach der Endothelialisierung von HFMs wurde die Gesamt-RNA aus Endothelzellen ohne Blutinkubation und nach 90 Minuten Blutinkubation isoliert. Dazu wurden die HFMs vor der RNA-Isolierung zweimal mit DPBS gewaschen. Als Kontrolle wurde die RNA auch aus HUVECs isoliert, die auf 6-Well-Platten kultiviert wurden. Die Expression der Aktivierungsmarker E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde mittels qRT-PCR nachgewiesen. Die mRNA-Werte wurden auf die GAPDH-mRNA-Werte normiert, und die Ergebnisse wurden im Verhältnis zu den Expressionswerten in HUVECs dargestellt, die auf Zellkulturplatten kultiviert wurden.
2.14 Statistische Auswertung
Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Für den Vergleich der Mittelwerte zwischen zwei Gruppen wurde ein zweiseitiger gepaarter t-Test durchgeführt. Für den Vergleich der Mittelwerte von mehr als zwei Gruppen wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0.2 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, Kalifornien, USA) durchgeführt. Unterschiede von p ≤ 0,05 wurden als signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1 Schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
O₂-Plasma (Schritt 1 in Figur 1)
Hydroxylgruppen an der Oberfläche von Materialien können mit chemischen Gruppen von anderen Molekülen reagieren und so eine kovalente Bindung eingehen.
3×3 cm große Polymethylpenten Hohlfasermembranen (PMP, OXYPLUS, 3M Membrana, Wuppertal, Germany) wurden zunächst mit Sauerstoffplasma behandelt, um Hydroxylgruppen (-OH) an der Oberfläche zu generieren. Dies wurde mittels der Anlage Denta Plas®, Diener electronic, Ebhausen, durchgeführt. Hierfür wurden die Membrane mit einem Druck von 0.3 mbar ((± 0.20 mbar) und einer Plasmastärke von 80 % (± 5%) im Niedervakuum mit Sauerstoffplasma behandelt. Im Anschluss folgte die Silanisierung.
Silanisierung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (Schritt 2 in Figur 1)
In diesem Schritt reagieren die freien Hydroxylgruppen mit APTES. Das Verdünnen von APTES in wasserfreiem Toluol ist eine weitverbreitete Methode bei der Silanisierung. Für die Silanisierung wurden die Membranen für 30 min in 2% APTES (APTES, Sigma-Aldrich, Darmstadt) verdünnt in Toluol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) bei 20 rpm und RT inkubiert. Im Anschluss wurden drei Waschschritte für 2 min im Ultraschallbad durchgeführt, um ungebundenes oder schwachgebundenes APTES zu entfernen. Zunächst wurden die Membranen in frischer 100%-iger Toluol-Lösung gewaschen gefolgt von 50% Toluol in 50% Methanol und zuletzt in 100% Methanol gewaschen und getrocknet.
DBCO-Konjugation (Schritt 3 in Figur 1)
Die silanisierten Membranen wurden im Anschluss mit 400 µM DBCO-PEG₄-NHS-Ester (Jena Bioscience, Jena, Germany) verdünnt in Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Invitrogen) für 30 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation erfolgten drei Waschschritte in DPBS für jeweils 5 min. Das verwendete DBCO enthält eine PEG₄-Kette zur Verlängerung des DBCOs, um eine leichtere Bindung zu den metabolisch modifizierten Zellen zu ermöglichen. Des Weiteren befindet sich an dem eingesetzten DBCO eine aktivierte Carbonsäure (-NHS-Ester), welches mit Aminogruppen vom APTES reagieren und so kovalente Bindungen eingehen können.
3.2 Detektion der gebildeten funktionellen Gruppen auf der Oberfläche von PMP-HFMs
Zur Detektion der gebildeten Aminogruppen auf unbehandelten, O₂-Plasma- und APTESbehandelten HFM-Membranen wurden die Membranen mit Methylorange angefärbt ( 2A). APTES-behandelte Membranen zeigten eine etwa 126-mal höhere Methylorange-Bindung (0,2523 ± 0,0175 gegenüber 0,002 ± 0,0175) im Vergleich zu O₂-Plasma-behandelten Membranen, was auf eine erfolgreiche Silanisierung der Oberfläche und das Vorhandensein von Aminogruppen hinweist. Diese aminofunktionalisierten Oberflächen wurden mit DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelt und das Vorhandensein von DBCO wurde durch die Click-Reaktion von Cy3-Azid an der Oberfläche nachgewiesen. Die Fluoreszenzintensität der HFMs wurde mit einem Fluoreszenzlesegerät ermittelt (2B). Mit DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelte Oberflächen zeigten eine etwa 5,87-fach höhere Cy3-Azid-Konjugation als mit APTES behandelte HFM (RFU: 22553 ± 3564 gegenüber 3845 ± 2155). Darüber hinaus wurde die Cy3-Fluoreszenzfärbung nur auf der Oberfläche der mit DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelten HFM durch fluoreszenzmikroskopische Analyse nachgewiesen (2C). Darüber hinaus zeigten die REM-Analysen keine visuellen Unterschiede auf der Oberfläche der nur mit APTES oder APTES und DBCO-PEG4-NHS-Ester behandelten HFMs im Vergleich zu den unbehandelten HFMs, was zeigt, dass das Beschichtungsverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Integrität der HFMs hat (3).
3.3 Metabolische Markierung der Oberfläche von Endothelzellen mit N₃ und Analyse des Einflusses auf die Zelllebensfähigkeit
Die HUVECs wurden 48 Stunden lang mit 50 µM Ac4ManNAz behandelt. Um festzustellen, ob N₃-Gruppen auf der Zelloberfläche vorhanden sind, wurden die Zellen anschließend 1 Stunde lang mit 5 µM DBCO-Sulfo-Cy3 inkubiert. Das Vorhandensein von N₃ auf der Zelloberfläche führte zur Konjugation von DBCO und zur Markierung der Zellen mit Cy3 (4A). Die Zellen ohne Ac4ManNAz-Behandlung wurden nicht gefärbt. Darüber hinaus zeigten durchflusszytometrische Analysen, dass etwa 98 % der analysierten Zellen Cy3-positiv waren (4B). Die Behandlung der Zellen mit Ac4ManNAz hatte keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der HUVECs (4C).
3.4 Endothelialisierung modifizierter HFMs durch kupferfreie Click-Reaktion von N₃markierten HUVECs auf der DBCO-funktionalisierten HFM-Oberfläche
DBCO-beschichtete und unbeschichtete HFMs wurden mit 5,2 × 10⁶ Ac4ManNAz-markierten HUVECs 24 Stunden lang unter Rotation und anschließend 24 Stunden lang unter statischen Bedingungen inkubiert. Die angehefteten HUVECs wurden durch Färbung mit Calcein AM nachgewiesen (5A). Die fluoreszenzmikroskopische Analyse zeigte, dass die mit Ac4ManNAz behandelten HUVECs effizient an die mit DBCO funktionalisierte HFM-Oberfläche binden und zu einer fast vollständigen Endothelialisierung führen. Der Nachweis der Fluoreszenzintensität der HFMs zeigte auch, dass die DBCO-Funktionalisierung zu einer deutlich erhöhten Adhäsion der HUVECs im Vergleich zu unbeschichteten oder APTES-beschichteten HFMs führte (5B). Die engen Zell-Zell-Kontakte von HUVECs auf den HFM-Membranen wurden durch Färbung mit einem Anti-VE-Cadherin-Antikörper nachgewiesen (5C).
3.5 Reaktivität der Endothelschicht auf einen Entzündungsreiz
Die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde nach der Stimulation der Endothelschicht auf HFMs mit TNF-α analysiert und mit der nicht stimulierten Endothelschicht mittels qRT-PCR verglichen (6). Die Stimulation der Endothelschicht mit TNF-α führte zu einer signifikant höheren Expression von E-Selectin (199-fach), VCAM-1 (328-fach) und ICAM-1 (162-fach) im Vergleich zur nicht stimulierten Endothelschicht. Damit wurde die Reaktionsfähigkeit der erzeugten Endothelschicht auf HFMs nachgewiesen.
3.6 Hämokompatibilität von DBCO-beschichteten oder endothelialisierten HFMs
Der Einfluss von DBCO-funktionalisierten oder endothelialisierten HFMs auf die Hämokompatibilität wurde durch dynamische Inkubation mit frischem menschlichem Blut analysiert. Die Anzahl der Blutzellen, die Aktivierung der Thrombozyten, die Gerinnung, das Komplementsystem und die Entzündung wurden nach der Inkubation von Blut ohne HFMs (Negativkontrolle), mit unbeschichteten, DBCO-beschichteten oder DBCO-beschichteten und endothelialisierten HFMs bestimmt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der weißen oder roten Blutkörperchen im Vergleich zu Blutproben ohne HFM festgestellt (7). Allerdings wurde ein signifikanter Rückgang der Thrombozytenzahl nach der Inkubation von Blut mit unbeschichteten oder DBCO-beschichteten HFM festgestellt, während endothelialisierte Membranen den Verlust von Thrombozyten verhinderten. Neben der Thrombozytenzahl wurde auch die P-Selektin-Expression auf den Thrombozyten als Marker für die Thrombozytenaktivierung analysiert. Wie in 7 dargestellt, wurde auf unbeschichteten und DBCO-beschichteten HFM im Vergleich zu den Blutproben ohne HFM eine signifikant höhere Anzahl aktivierter Thrombozyten nachgewiesen. Die endothelialisierten Membranen verhinderten jedoch die Aktivierung der Thrombozyten.
Darüber hinaus wurde nach der Inkubation der HFMs mit Blut die Adhäsion von Thrombozyten und Monozyten sowie die Bildung von Fibrin auf der Oberfläche der HFMs mittels REM analysiert (8). Die Endothelialisierung der HFM-Oberfläche führte zur Bildung einer glatten, konfluierenden Endothelzellschicht. Nach der Inkubation unmodifizierter HFMs mit frischem menschlichem Blut wurde auf der Oberfläche ein starkes Fibrinnetzwerk mit eingeschlossenen Erythrozyten festgestellt. Auch die DBCO-beschichteten HFM-Oberflächen zeigten eine Fibrinnetzbildung. Die Inkubation der endothelialisierten Oberfläche mit menschlichem Blut verhinderte jedoch die Bildung von Fibrinnetzwerken auf der Oberfläche der HFMs stark. An einigen Stellen wurden auch zellähnliche Strukturen festgestellt, bei denen es sich um abgeschilferte Endothelzellen handeln könnte, die durch die Trocknung am kritischen Punkt entstanden sind, oder um adhärente Monozyten.
Nach der Inkubation von Blut mit unbeschichteten und DBCO-funktionalisierten HFM wurden signifikant erhöhte Werte des Thrombin-Antithrombin-III-Komplexes (TAT), einem Indikator für die Gerinnungsaktivierung, und β-Thromboglobulin, einem Marker für die Thrombozytenaktivierung, festgestellt (9). Im Gegensatz dazu verhinderten endothelialisierte HFM die Aktivierung der Gerinnung und der Blutplättchen wirksam. Hinsichtlich der Aktivierung der Entzündung (PMN-Elastase) und des Komplementsystems (sC5b-9) wurden keine signifikanten Veränderungen zwischen Blutproben ohne HFM (Negativkontrolle) und verschiedenen HFM-Modifikationen gemessen.
3.7 Entzündungsstatus des Endothels auf HFMs
Nach der Endothelialisierung von HFMs wurde die Expression von Adhäsionsmolekülen vor und nach der Inkubation mit Blut für 90 Minuten analysiert, um den Aktivierungsstatus der Endothelzellen zu bestimmen. HUVECs, die in einer 6-Well-Platte kultiviert wurden, dienten als Kontrolle. Interessanterweise reduzierte die Inkubation von enthothelialisierten HFM mit Blut die Expression von E-Selektin und VCAM-1 im Vergleich zu enthothelialisierten HFM ohne Blutkontakt (10).
4. Fazit
Die Erfinder stellen ein Verfahren bereit, mit dem auf sehr spezifische und selektive Art und Weise biologische Zellen kovalent an Oberflächen gebunden werden können. Dies ermöglicht eine effiziente Besiedelung der Oberflächen bspw. mit Endothelzellen, um die Erkennung der Oberflächen als „fremd“ zu verhindern. Die Methode kann auch eingesetzt werden um patienteneigene EPCs oder „iPSC-derived“ Endothelzellen auf gewünschte Oberflächen von blutkontaktierenden Materialien zu binden. Es können off-the-shelf Produkte hergestellt werden, die bei Bedarf mit patienteneigenen Endothelzellen besiedelt werden. Die Konjugation der Zellen an die Oberfläche erfolgt ohne Katalysator unter physiologischen Bedingungen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

CN 110545754 [0005]
US 6309660 [0005]
WO 2020190214 [0006]

Claims

Verfahren zur Herstellung einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellen einer Hydroxylgruppen (-OH) aufweisenden Oberfläche, 2. Silanisierung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche, 3. Konjugation eines in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden an die silanisierte Oberfläche.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktand aus Schritt 3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cycloalkin, Cycloalkin-Ester, Phoshin und Phosphin-Ester.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Cycloalkin Dibenzocyclooctin (DBCO) ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Cycloalkin-Ester DBCO-PEG₄-NHS-Ester ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die Bereitstellung der Hydroxylgruppen aufweisenden Oberfläche durch Sauerstoffplasmabehandlung einer Oberfläche erfolgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die medizinische Vorrichtung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: künstliche Lunge, Oxygenator, künstliche Niere, Prothese, Gefäßprothese, Stent, Kunstherz.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Oberfläche einer Hohlfasermembran (HFM) ist, vorzugsweise einer Polymethylpenten- oder Polypropylen-HFM.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen Endothelzellen sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) aufweisen.
Vorrichtung mit einer mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die mit biologischen Zellen besiedelbaren Oberfläche mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten wurde.
Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus künstliche Lunge, Oxygenator, künstliche Niere, Prothese, Gefäßprothese, Stent, Kunstherz.
Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Hohlfasermembran (HFM) ist, vorzugsweise eine Polymethylpenten oder Polypropylen-HFM.
Verfahren zur Besiedelung einer Oberfläche mit biologischen Zellen, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung einer Oberfläche, die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweist, 2. Inkubation der Oberfläche mit biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) aufweisen, unter Bedingungen, die in einer kupferfreien Klick-Reaktion die Konjugation der Azidgruppe mit dem Reaktanden erlauben.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die einen in einer kupferfreien Klick-Reaktion mit Aziden reagierenden Reaktanden aufweisende Oberfläche mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten wurde.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen, die an ihrer Oberfläche Azidgruppen (-N₃) aufweisen, durch Inkubation von biologischen Zellen mit einem Azidzucker erhalten wurden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ac4ManNAz (N-Azidoacetylmannosamine-tetraacylated), N-azidoacetylglucosamine-tetraacylated (Ac4GlcNAz), N-azidoacetylgalactosamine-tetraacylated (Ac4GaINAz) und anderen Azid-funktionalisierten Glykokonjugate.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen Endothelzellen sind.