DE2339238A1

DE2339238A1 - Enzyme und/oder mikroorganismen in loesung oder dispersion enthaltender hohlfaden, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur durchfuehrung biotechnischer reaktionen

Info

Publication number: DE2339238A1
Application number: DE2339238A
Authority: DE
Inventors: Yasuo Hashino; Masataka Morishita; Masatsugu Yoshino
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1972-08-04
Filing date: 1973-08-02
Publication date: 1974-03-21
Also published as: JPS4931913A; US3875008A; JPS5136810B2; DE2339238B2; GB1422854A; CA1036086A; FR2194484B1; FR2194484A1

Description

¹¹ Enzyme und/oder Mikroorganismen in Lösung oder Dispersion enthaltender Hohlfaden, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Vervrendung zur Durchführung biotechnischer Reaktionen "

Priorität: 4. August 1972, Japan, Nr. 77 680/72

Die Erfindung betrifft einen Enzyme und/oder Mikroorganismen in Lösung oder Dispersion enthaltenden Hohlfaden, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie die Verwendung des Hohlfadens zur Durchführung biotechnischer Reaktionen.

Seit kurzem werden fixierte Enzyme mit Vorteil auf den verschiedensten Gebieten eingesetzt, insbesondere bei der Durchführung biotechnischer Reaktionen. Einer der Vorteile dieser fixierten Enzyme ist, daß das Enzym aus dem Reaktionssystem nach beendeter Umsetzung nicht abgetrennt werden muß, weil sich das in festem Zustand fixierte Enzym als. Feststoff im Gegensatz zu einer wäßrigen Enzyialösung handhaben läßt. Somit lassen sich bei Verwendung fixierter Enzyme kontinuieriiche Reaktionen in Kolonnen durchführen. Bei der Durchführung von chemischen Reak-

tionen mil i'ikroor^siiismen können diese mit Vorteil als lebende ι ι

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BAD OR(OINAt.

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Katalysatoren verwendet werden, wenn sie an einem Träger fixiert sind, ohne daß der Mikroorganismus in das Reaktionsgemisch entweicht. Dies vereinfacht die anschließenden Reinigungsstufen.

Es sind verschiedene Verfahren zum Fixieren von Enzymen oder Mikroorganismen zur Verwendung als lebende Katalysatoren bekannt. Zum Fixieren von Enzymen sind die nachstehenden Methoden bekannt:

(1) Die kovalente Bindungsmethode. Bei dieser Methode wird eine kovalente Bindung zwischen einem Enzym und einem fixierenden Träger ausgebildet;

(2) Die ionische Bindungsmethode. Bei dieser Methode wird ein Enzyraprotein ionisch an seinem isoelektrischen Punkt an einem Träger mit ionenaustauschenden Gruppen adsorbiert;

(3) Die physikalische Adsorptionsmethode. Bei dieser Methode wird ein Enzym an einem Träger, wie Aktivkohle oder Kaoliriit, adsorbiert;

(4) Die Vernetzungsmethode. Bei dieser Methode wird ein Enzym durch Vernetzen des Enzymproteins mit einem bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzungsmittel fixiert;

(5) Netzeinschlußmethode. Bei dieser Methode wird ein Enzym in kleinen Netzen oder Gittern eines Gels, z.B. einem PcIyacrylamidgel, eingeschlossen;

(6) Die Mikrokapseln^ thode. Bei dieser Methode wird ein Enzym mit einem Überzug aus einem semipermeablen Polymer versehen.

Zum Fixieren von Mikroorganismen wurden (1) die Ionenbindungr,--methode, (2) die Gittereinschlußmethode und (3) die Mikroorga-

nismen-Oberflächenbehandlungsmethode verwendet *■*„,,>..,.. ι

L ^J ORIGINAL INSPECTED

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Diese bekannten Methoden können jedoch nicht bei allen Enzymen oder Mikroorganismen angewandt werden. In den meisten. Fällen läßt sich eine Methode nur für ein bestimmtes Enzym oder einen bestimmten Mikroorganismus, jedoch nicht für andere Enzyme oder Mikroorganismen anwenden. Beispielsweise ist bei der kovalenten Bindungsmethode oder der Vernetzungsmethode zum Fixieren von Enzymen die Festigkeit der Bindung zwischen dem Enzym und dem Träger sehr stark. Diese Methoden haben den Nachteil, daß nur wenig aktive Produkte erhalten werden, weil die aktiven Zentren des Enzymproteins durch die Fixierbehandlung zerstört werden, die unter verhältnismäßig drastischen Bedingungen durchgeführt wird. Häufig erfolgt bei diesen Verfahren auch eine Änderung der Substratspezifität. Bei der lonenbindungsmethode oder der physikalischen Adsorptionsmethode ist dagegen die Festigkeit der Bindung zwischen dem Enzym und dem Träger sehr schwach, so daß die Gefahr besteht, daß das Enzym aus dem Träger auswandert. Ferner eignen sich für diese Methoden nur sehr wenige Träger. Die anderen Methoden, nämlich die Gittereinschlußmethode und die Mikrokapselmethode desaktivieren zwar nicht das Enzym, doch haben sie verfahrenstechnische Nachteile bei der Herstellung des fixierten Enzyms, und außerdem ist die Permeabilität des Substrats durch das Gel oder die Wandschicht erschwert.

Aufgabe der Erfindung ist es, Enzyme und/oder Mikroorganismen in fixierter Form zur Verfügung zu stellen, die hoch aktive lebende Katalysatoren darstellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues, einfach durchführbares Verfahren zur Herstellung solcher fixierter Enzyme und/oder Mikroorganismen zu schaffen.

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π "⁴- 233923Η

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Enzymeund/oder Mikroorganismen in Lösung oder Dispersion enthaltender Hohlfaden aus

von

einem semipermeablen Gel auf Basis Polyacrylnitril, Polymethacrylnitril, Celluloseacetat, Celluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Hydroxypropylmethylcellulosetrimellitat, Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymerisaten, Polyurethanen, Polysulfonen oder Copolymerisaten, welche diese Polymeren als Hauptbestandteile enthalten.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Hohlsfadens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung eines ein semipermeables Gel bildenden Polymers durch eine Spinndüse mit ringförmiger Öffnung in ein Fällbad spinnt und gleichzeitig durch den inneren Teil der Öffnung als internes Koaguliermittel eine Lösung oder Dispersion mindestens eines Enzyms und/oder Mikroorganismus in den Hohlfaden injiziert.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß wasserhaltige Gele eines Polymers, welche die Eigenschaft einer semipermeablen Membran aufweisen, eine ausgezeichnete Permeabilität für Wasser und Substrate besitzen. Es wurde ferner festgestellt, daß zum Einhüllen von Enzymen und/oder Mikroorganismen unter milden Bedingungen, d.h. in Form einer Lösung oder einer Suspension, in den Hohlraum von Hohlfaden die Methode des Verspinnens in Wasser besonders vorteilhaft ist zur Herstellung dieser Hohlfaden, und daß die auf diese Weise hergestellten Hohlfaden sehr aktive lebende Katalysatoren darstellen.

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Der Ausdruck "Einhüllen" bedeutet, daß das Enzym oder der Mikroorganismus in dem Hohlraum von Hohlfaden fixiert ist. Die Enden des Enzyms und/oder den Mikroorganismus enthaltenden Hohlfaden können entweder offen oder geschlossen sein. Da die erfindungsge mäßen Hohlfaden sehr dünn sind, bleibt das in dem Hohlfaden eingeschlossene Enzym und/oder der Mikroorganismus darin fixiert, selbst wenn die Enden des Hohlfadens offen sind.

Die Erfindung hat folgende Vorteile:

(1) Es können die verschiedensten Enzyme und Mikroorganismen in Lösung oder als Suspension in den Hohlraum von Hohlfaden eingeschlossen werden;

(2) Die Aktivität der Enzyme und/oder Mikroorganismen erleidet keine Änderung, da bei der Herstellung des Hohlfadens kein Erhitzen, keine Änderung des pH-Wertes oder sonstige drastische Reaktionsbedingungen angewendet v/erden, welche das Enzym und/oder den Mikroorganismus desaktivieren;

(3) Die Enzyme und/oder Mikroorganismen in Lösung oder Dispersion enthaltenden Hohlfäden stellen sehr aktive feste lebende Katalysatoren dar, da polymere Gelfilme mit ausgezeichneter Wasserpermeabilität sowie Substratpermeabilität als Umhüllungsmaterial verwendet werden;

(4) Die Hohlfaden haben eine große Oberfläche, durch die das Substrat eindringen kann, so daß ein fester lebender Katalysator mit großer Kapazität vorliegt. Bei der Durchführung biotechnischer Reaktionen in Kolonnen erfolgt bei der Verwendung der Hohlfaden als Füllungsmaterial kein Verstopfen;

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(5) Je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck können Lösungen oder Dispersionen reiner Enzyme und/oder Mikroorganismen oder auch Gemische aus mindestens zwei oder mehr Enzymen und/oder Mikroorganismen zur Durchführung komplexer Reaktionen verwendet werden;

(6) Das Verfahren zur Herstellung der Hohlfaden gestaltet sich einfach und ist damit sehr wirtschaftlich.

Das Enzym und/oder der Mikroorganismus wird in Form einer Lösung oder Suspension verwendet. Beispielsweise wird ein Enzym in Wasser, einem Alkohol, Aceton oder einer geeigneten Pufferlösung gelöst. Ein Mikroorganismus kann in Wasser, einem Alkohol oder einer Pufferlösung suspendiert werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren können beliebige Enzyme und Mikroorganismen eingesetzt werden. Es ist auch möglich, zwei oder mehr Enzyme und bzw. oder Mikroorganismen in Kombination zu \rerwenden. Spezielle Beispiele für verwendbare Enzyme sind Enzyme des Penicillinacylasetyps, Racemasen, Esterasen und Glucoseisomerase. Spezielle Beispiele für verwendbare Mikroorganismen sind Cyan verwertende Mikroorganismen, Penicillinacylase und makrolide Antibiotika produzierende Mikroorganismen.

Zur Herstellung der Hohlfaden können alle Polymerisate verwendet v/erden, sofern sie semipermeable Gele bilden, die eine ausgezeichnete Substratpermeabilität aufweisen, wenn sie unter Bildung von Hohlfaden in Wasser versponnen werden und dem angewandten Druck widerstehen können. Spezielle Beispiele für bevorzugt verwendete Polymerisate sind Polyacrylnitril, Polymethacrylnitril, Cellulosederivate, \vie Celluloseacetat, Cellulose-_j

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acetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Hydroxypropylmethylcellulosetrimellltat, Nitrocellulose und Äthylcellulose, Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymerisate, Polyurethane, Polysulfone und Copolymerisate, welche diese Polymeren als Hauptbestandteile enthalten. Besonders bevorzugt sind Polyacrylnitril und dessen Copolymerisate, da die Enzyme und/oder Mikroorganismen in den aus diesen Polymeren hergestellten Hohlfaden die höchste Aktivität beibehalten.

Zur Herstellung der Spinnlösung werden Lösungsmittel verwendet, die sowohl das Polymerisat gut lösen als auch eine ausgezeichnete Mischbarkeit mit Wasser besitzen. Die Art des verwendeten Lösungsmittels hängt von der Art des eingesetzten Polymers ab. Bevorzugt verwendete Lösungsmittel sind Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dirnethylsulfoxid, Formamid und eine konzentrierte wäßrige Lösung eines Salzes der Rhodanwasserstoffsäure. Ein besonders bevorzugtes Lösungsmittel für Polyacrylnitril ist Dimethylsulfoxid. In Hohlfaden, die aus einer Lösung von Polyacrylnitril in Dimethylsulfoxid hergestellt wurden, ist die Aktivität der eingeschlossenen Enzyme und/oder Mikroorganismen besonders hoch.

Die erfindungsgemäß hergestellten Hohlfaden sollen eine möglichst hohe Viasserpermeabilität aufweisen. Sofern der Viert der Wasserpermeabilität unter 0,1 ml/cm . min . atm liegt, ist der praktische Wert der Hohlfaden stark vermindert. Der Innendurchmesser und Außendurchmesser der Hohlfaden soll möglichst klein sein, da mit abnehmendem Durchmesser die Oberfläche der Hohlfaden größer wird. Hohlfaden mit einem Innendurchmesser

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von 0,06 mm oder kleiner sind jedoch schwierig herzustellen, während Hohlfaden mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm und größer schwierig zu handhaben sind, da sie zu füllig werden und sich schwierig in Kolonnen einfüllen lassen. Vorzugsweise beträgt der Außendurchmesser der erfindungsgemäßen Hohlfaden 0,1 bis 1,5 mm und der Innendurchmesser 0,06 bis 1,3 mm.

In der Praxis werden die Hohlfaden der Erfindung folgendermaßen hergestellt:

Ein Polymer, aus dem der Hohlfaden hergestellt werden soll," wird in einem der vorgenannten Lösungsmittel in geeigneter Konzentration, z.B. in einer Konzentration von 10 bis 20 Gewichtsprozent, unter Rühren gelöst. Nach dem Auflösen des Polymers wird die Lösung entschäumt und filtriert. Sodann wird die Lösung durch den Ringraum einer doppelten Öffnung in ein Fällbad gesponnen. Man erhält einen Hohlfaden. Als Fällbad eignet sich ein wäßriges Bad. Gleichzeitig mit dem Verspinnen des Hohlfadens wird eine wäßrige Lösung oder Suspension eines Enzyms und/oder eines Mikroorganismus durch den inneren Teil der Öffnung in den gebildeten Hohlfaden injiziert.

Das semipermeable Gel, aus dem der Hohlfaden besteht, enthält Poren, deren Durchschnittsgröße genügend klein ist, so daß sie das Enzym und/oder den Mikroorganismus zusammen mit einem Wassergehalt von 50 Volumprozent oder mehr einschließen können. Die Durchschnittsgröße der Poren kann 0,5 Mikron oder geringer sein.

Die V/asserpermeabilität wird folgendermaßen bestimmt:

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Aus einem Hohlfaden wird ein 40 cm langes Stück abgeschnitten und gründlich mit Wasser gewaschen, um das eingeschlossene Enzym und/oder den Mikroorganismus vollständig abzutrennen. Sodann wird um den Hohlfaden ein Außenmantel angeordnet, dessen Enden am Hohlfaden mit einem Epoxykleber verklebt werden. Destilliertes V/asser wird in den Raum zwischen dem Außenmantel und dem Hohlfaden eingefüllt und ein Druckdifferential von 1 at zwischen dem Mantelraum und dem Innenraum des Hohlfadens erzeugt. Es wird die Wasserpermeabilität in der Zeiteinheit bestimmt. Der Wert pro Flächeneinheit wird durch Dividieren des gemessenen Wertes durch die effektive Fläche der Membran berechnet. Die effektive Fläche wird aus dem Innendurchmesser des Hohlfadens errechnet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Polyacrylnitril mit einer grundmolaren Viskositätszahl von 1,2 in Dimethylformamid wird in Dimethylsulfoxid bis zu einer Konzentration von 15 g/100 ml gelöst. Die Lösung wird filtriert und entschäumt und sodann durch den äußeren Ring einer Ringdüse extrudiert. Gleichzeitig wird durch den inneren Teil der -Ringdüse eine 1 Gewichtsprozent aktive Holzkohle in einem 0,05 molaren Trispuffer vom pH-Wert 7,0 mit 10 Gewichtsprozent gelöster Urease extrudiert. Der extrudierte Faden wird in einem Wasserbad koaguliert. Die Ringdüse hat einen Äußendurchmesser von 0,80 mm und eine Ringschlitzbreite von 0,1 mm.

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-ι ~¹⁰~ 233923?

Der erhaltene Hohlfaden, der in seinem Inneren Urease und aktive Holzkohle enthält, hat einen Aiißendurehmesser von 0,20 mm und einen Innendurchmesser von 0,18 mm. Der Hohlfaden wird durch Verknoten der Enden verschlossen und zu einer Einheit einer Länge von etwa 20 ms- verformt. Diese Einheiten der Hohlfaden werden sodann in ein Glasrohr einer Länge von .10 cm und einem Durchmesser von 2 cm vorsichtig eingefüllt, so daß die Fäden nicht geritzt oder zerschnitten werden. Auf die erhaltene Kolonne wird ein 0,05 molarer Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,5 gegeben, der 1 Prozent Harnstoff enthält. Der durch die Wand des Hohlfadens hindurchtretende Harnstoff wird durch die im Hohlfaden enthaltene Urease enzymatisch unter Bildung von Ammoniak gespalten, das von der aktiven Holzkohle adsorbiert wird. Der Prozentsatz der enzymatischen Spaltung von Harnstoff wird durch Bestimmung der Konzentration des nicht umgesetzten Harnstoffs durch Mikrodiffusionsanalyse bestimmt. 75 Prozent des Harnstoffs sind enzymatisch gespalten. Die Wasserpermeabilität des Hohlfadens beträgt 2 ml/cm . min . atm.

Beispiel2

Cellulosediacetat einer grundmolaren Viskositätszahl von 2,3 in Aceton wird in Dimethylformamid bis zu einer Konzentration von 10 g/100 ml gelöst. Danach wird die Lösung filtriert und entschäumt und sodann durch den äußeren Teil der in Beispiel 1 verwendeten Ringdüse extrudiert, während gleichzeitig eine 15gewichtsprozentige Lösung von Lipase MY in einem 0,2 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 durch den inneren Teil der Ringdüse extrudiert wird. Das extrudierte Produkt wird in einem Wasserbad koaguliert. Der erhaltene Hohlfaden, der in seinem _j

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Inneren eine Lipaselösung enthält, hat einen Außendurchmesser von 0,30 mm und einen Innendurchmesser von 0,25 mm. Bei Verwendung dieses Hohlfadens beträgt der Hydrolysegrad bei der enzymatischen Spaltung des Paranitrophenolbuttersäureesters 60 Prozent. Der Hohlfaden hat eine Wasserpermeabilität von 1 ml/cm . min . atm.

Beispiel 3

Ein Acrylnitril-Methylacrylat-Copolymerisat mit 1 Molprozent Methylacrylat und mit einer grundmolaren Viskos.*.tätszahl von 1,5 in Dimethylformamid wird in Dimethylsulfoxid bis zu einer Konzentration von 10 g/100 ml gelöst. Die Lösung wird filtriert und entschäumt und sodann durch den äußeren Teil der in Beispiel 1 verwendeten Ringdüse extrudiert, während durch den inneren Teil der Ringdüse eine 20gewichtsprozentige Dispersion von Fusarium solani (FERM Nr. 217; hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan) extrudiert wird. Das Produkt wird in einem Wasserbad koaguliert. Der erhaltene Hohlfaden, der eine Dispersion von Fusarium solani in seinem Inneren enthält, hat einen Außendurchmesser von 0,25 mm und einen Innendurchmesser von 0,20 mm.

Der erhaltene Hohlfaden wird an den Enden verknotet und zu Einheiten mit einer Länge von 25 cm verarbeitet. 10 Einheiten dieses Hohlfadens werden in ein Glasrohr einer Länge von 20 cm und mit einem Durchmesser von 1 cm eingefüllt. Auf die erhaltene Kolonne wird eine Cyanidionen enthaltende Flüssigkeit (50 ppm CN) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Std. gegeben. Die abfließende Flüssigkeit enthält praktisch keine ,

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Cyanidionen (weniger als 1 ppm CN). Die Y/asserpermeabilität des Hohlfadens beträgt 4 ml/cm . min . atm.

Beispiele 4 bis 18

Verschiedene Polymere werden in Dimethylsulfoxid bis zu einer Konzentration von 15 g/100 ml gelöst. Auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise werden aus den erhaltenen Spinndüsen Hohlfaden hergestellt, die in ihrem Inneren eine Dispersion von Fusarium solani enthalten. In Tabelle I sind die verwendeten Polymeren, die Lösungsmittel zur Herstellung der Spinnlösung» die Abmessungen der erhaltenen Hohlfäden und die Wasserpermeabilität zusammengefaßt. Die erhaltenen Hohlfäden werden an ihren Enden verknotet und zu Einheiten mit einer Länge von 40 cm verarbeitet. Jeweils 30 Einheiten eines Hohlfadens werden in ein Glasrohr einer Länge von 30 cm und mit einem Durchmesser von 2 cm eingefüllt. Die in Beispiel 3 verwendete Cyanidionen enthaltende Flüssigkeit wird auf die erhaltene Kolonne unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 gegeben. Die Cyanidionenkonzentration in der abfließenden Flüssigkeit ist ebenfalls in Tabelle I angegeben.

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Tabelle I

Bei spiel ITr.	Polymer *)	Lösungs mittel **)
4	ΡΤ'ΛΝ	DKSO
5 '	AJI-IiA(I)	DM30
6	PAK	DKSO
7	PAN	DHF
8	CAP	Dl-ISO
9	HPMCT	Di-IGO
10	PVC-VA	DM30
11	CDA	DMSO
12	CDA	DMA .
13	CDA	Acetone
14	A1WU(2)	DFiSO
15	AN-Hä(2)	DM30
16 ■	;jm-ia(2)	DKSO
17	AN-KA(2)	DI ISO
18	ΔΗ-ΜΛ(2)	DHSO

Abmessungen des Hohlfadens Wasser- CN-Konzentration Innendurch- Außendurch- permeabilität, der abfließenden messer, mm messer, mm ml/cm^.min.atm Lösung , ppm

0,8 0_T8 0_r8 0_T8 0,8 0_r8 0_T8 0,8

0,6

6<

0_f6 0.6

0_r6 0_r6

0,6

0,1 0_;06

CVJ	0,5
5	ο_τοι>
Cv]	0,01>
2	0_?1
3	0,1
1	0,1
1	0,1
1	0,2
0,2	5
0,1	12
5	0,1
6	ο_Γοι>
8	0_;01>
11	ο,οι>
13	0,01>

K5 CO CO CD K) CO CO

Γ "1

- ¹⁴ - 233923d

*) PMAN = Polymethacrylnitril;

AN-MA(I)= Acrylnitril-Methylacrylat-Copolymerisat (Molverhältnis 90 : 10);

PAN = Polyacrylnitril; CAP = Celluloseacetatphthalat; HPMCT = Hydroxypropylniü thylcellulosetrimellitat;

PVC-VA = Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymerisat (Molverhältnis 72 : 28);

CDA = Cellulosediacetat;

AN-MA(2)= Acrylnitril-Methylacrvlat-Copolymerisat (Molverhältnis 92 : 8)

**) DMSO = Diraethylsulfoxid; DMF = Dimethylformamid; DMA = Dirnethylacetamid.

Beispiele 19 bis 22

Ein Polyacrylnitril mit einer grundmolaren Viskositätszahl von 1,2 in Dimethylformamid wird in verschiedenen Lösungsmitteln bis zu einer Konzentration von 15 g/100 ml gelöst. Auf die in Beispiel 2 beschriebene V/eise v/erden mit dieser Spinnlösung Hohlfäden hergestellt, die in ihrem Inneren Lipase enthalten. In Tabelle II sind die zur Herstellung der Spinnlösung verwendeten Lösungsmittel, die Abmessungen der erhaltenen Hohlfaden und ihre Wasserpermeabilität zusammengefaßt. Die jeweils erhaltenen Hohlfaden werden an ihren Enden verknotet und zu Einheiten einer Länge von 40 cm verarbeitet. Jeweils 30 Einheiten eines Hohlfadens werden in ein Glasrohr einer Länge von 30 cm und mit einem Durchmesser von 2 cm eingefüllt. Auf die erhaltene Kolonne wird eine Iprozentige wäßrige Lösung von Paranitrophenylbuttersäureester in einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Std. gegeben. Es wird der Prozentsatz der Hydrolyse des Esters bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II 2usair>mengefaßt. Es ist ersichtlich, daß bei Verwendung von Dimethylculf·- L

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Γ Π

oxid als Lösungsmittel für die Spinnlösung ein Hohlfaden erhalten wird, bei dem die enzymatisch^ Aktivität besonders gut erhalten bleibt.

J 409812/1097

Tabelle II

Beispiel Nr.

Lösungsmittel

Abmessungen des Hohlfadens Wasser-Innendurch-Außendurchpermeabilität, messer, mm .messer, mm

ml/cm ,min.atm

Esterhydrolyse, %

	19	Dimethylsulfoxid	0,8	0,6
	20	Dimethylformamid	0,8	0,6
	21	Dimethylacetamid	0,8	0,6
	22	48prozentige wäßrige	0,8	0,6
		Lösung von Natriumthio-
		cyanat
O
CD
OC

2 2 2

96 62 65 60

GO Ca)

Beispiel 23

20 Liter einer Kulturflüssigkeit vom pH-Wert 7,0, die 0,5 Prozent Glucose, 0,3 Prozent Glycerin, 1,0 Prozent Fleischextrakt und 1,0 Prozent Polypepton enthält, wird in einen 30 Liter fassenden Fermentationsbehälter eingefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C dampfsterilisiert. Sodann werden in die Kulturflüssigkeit unter aseptischen Bedingungen 200 ml einer Impfkultur von Bacillus megaterium B-400(FERM-P 748, hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan) überimpft. Diese Einsaatkultur wurde in der gleichen Kulturflüssigkeit 24 Stunden bei 30⁰C gezüchtet. Die Züchtung in dem Fermentationsgefäß wird 72 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Kulturflüssigkeit wird mit 20 Liter/min belüftet und mit 300 U/min gerührt. Es wird eine Bakterienkulturflüssigkeit erhalten.

Eine Lösung von Polyacrylnitril in Dimethylsulfoxid einer Konzentration von 15 g/100 ml wird durch den äußeren Spalt einer Ringdüse in ein Wasserbad extrudiert, während gleichzeitig die erhaltene Bakterienkulturflüssigkeit durch den inneren Teil der Ringdüse in den Hohlfaden extrudiert wird. Die verwendete Ringdüse hat einen Innendurchmesser von 0,8 mm und eine Schlitzbreite von 0,10 mm. Der erhaltene Hohlfaden hat einen Außendurchmesser von 0,25 mm und einen Innendurchmesser von 0,20 mm. Der Hohlfaden wird an seinen Enden verknotet und zu Einheiten einer Länge von 25 cm verarbeitet. Etwa 30 Einheiten des Hohlfadens v/orden in ein Glasrohr einer Länge von 20 cni und einem Durchmesser von 1 cm eingefüllt. Auf die erhaltene Kolonne wird eino Lösung von 50 mg des Natriur.isalzes der

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3-Methyl-7-phenylacetafl)ido-/\ -cepham-4-carbonsäure und 100 mg D-Phenylglycinäthylester-hydrochlorid in 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gegeben. Die Strömungsgeschwindigkeit wird auf 15 ml/Std. eingestellt. Die aus der Kolonne abfließende Lösung enthält Cephalexin in einer Ausbeute von 12,4 % d. Th.

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Claims

" 19 " - 233923ο

1. Enzyme und/oder Mikroorganismen in Lösung oder Dispersion enthaltender Hohlfaden aus einem semipermeabler! Gel auf Basis von Polyacrylnitril, Polymethacrylnitril, Celluloseacetat, Celluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Hydroxypropylmethylcellulosetrimellitat, Vinylchlorid-vinylacetat-Copolymeriüaten, Polyurethanen, Polysulfonen oder Copolymerisaten, welche diese Polymeren als Hauptbestandteile enthalten.

2. Hohlfaden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserpermeabilität des Fadenmaterials einen Wert von mindestens 0,1 ml/cra . min , atm hatj der Außendurchmesser 0,1 bis 1,5 mm und sein Innendurchmesser 0,06 bis 1,3 mm beträgt.

3. Verfahren zur Herstellung des Hohlfadens ge-näß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines ein semipermeables Gel bildenden Polymers durch eine Spinndüse mit ringförmiger Öffnung in ein Fällbad spinnt und gleichzeitig durch den inneren Teil der Öffnung als internes Koaguliermittel eine Lösung oder Dispersion mindestens eines Enzyms und/oder Mikroorganismus in den Hohlfaden injiziert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Medium für das Fällbad und das interne Koaguliermittel eine Pufferflüssigkeit verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für das Polymer DimethyIsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Formamid, Aceton oder eine konzentrierte wäßrige Lösung eines Salzes der Rhodanwasserstoffsäure verwendet.

6. Verwendung des Hohlfadens gemäß Anspruch.1 zur Durchführung biotechnischer Reaktionen.

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