DE2857791C2

DE2857791C2 -

Info

Publication number: DE2857791C2
Application number: DE2857791A
Authority: DE
Inventors: Raymond Urgel Lemieux; Robert Murray Edmonton Alberta Ca Ratcliffe
Original assignee: Chembiomed Ltd
Current assignee: Chembiomed Ltd
Priority date: 1977-04-14
Filing date: 1978-04-14
Publication date: 1988-04-28
Also published as: SE8307205D0; SE463515B; FR2414052B1; JPS5746997A; JPS5745196A; NL7803918A; GB1603609A; FR2414052A1; SE8307205L; CA1105011A; US4195174A; SE465624B; SE8307206L; DE2816340A1; SE8307206D0; DE2816340C2; FR2414053B1; SE450124B; JPS6129359B2; FR2414053A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Trisaccharide und ihre Verwendung zur Herstellung eines Immunoadsorbens und eines Antigens, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Es ist bekannt, daß Kohlehydratstrukturen verschiedener komplexer Zusammensetzungen antigene Determinantien sind. Es ist weiterhin sichergestellt daß relativ kleine Moleküle, die als Haptene bekannt sind, der Struktur der antigenen Determinante entsprechen können. Die Haptene ergeben, wenn sie an geeignete Trägermoleküle gebunden sind, ein künstliches Antigen, das, wenn es einem Tier unter geeigneten Bedingungen verabreicht wird, die Bildung von Antikörpern mit einer Spezifizität für das Hapten bewirkt. Es wurde viel Literatur veröffentlicht, die die Herstellung von Immunoadsorbentien aus Haptenen betrifft. Diese Literatur betrifft die Bildung des Haptens normalerweise durch kovalente Bindungen, aber manchmal auch durch hydrophobe Bindungen, in einem Feststoff, Latex oder gelatineartigen Träger. Das Hapten wird immobilisiert, so daß, wenn das entstehende Immunoadsorbens den Antikörpern mit den Bindungsstellen für die haptenische Struktur ausgesetzt ist, ein Binden der Antikörper an der Oberfläche des Immunoadsorbens stattfindet und so müssen die Antikörper spezifisch aus der Lösung entfernt werden.

Viele Arten von Feststoff-, Latex- und Gelträgern für die Herstellung von Immunoadsorbentien wurden entwickelt und viele Wege wurden für die Bindung des Haptens an diese unlöslichen Strukturen vorgeschlagen. Obgleich Verbesserungen bei diesen Materialien möglich sind, liegt die Hauptschwierigkeit darin, daß ein einfacher Zugang zu dem gewünschten Hapten in einer Form, die für die Bindung bzw. Haftung an dem Trägermolekül geeignet ist, fehlt.

Sowohl Galactosamin als auch Lactosamin, normalerweise in Form ihrer N-acetylierten Derivate, finden sich vielfach in der Natur. Sie kommen in Glycoproteinen, Glycolipiden und Mucopolysacchariden vor. Als solche sind sie wichtige Aufbaueinheiten, die in den antigenen Determinanten der Blutgruppensubstanz gefunden werden.

Die bekannte Hauptquelle für D-Galactosamin ist die Säurehydrolyse von Chrondroitinsulfat C, das durch Extraktion von Knorpelgewebe, wie Sehnen, Trachea und Nasensepta erhalten wird. Diese Ausbeuten sind ungewiß und es ist schwierig, ein kristallines Produkt herzustellen. Es gibt chemische Synthesen, bei denen 1,6,2,3-Dianhydro-β-D-talopyranose mit Ammoniak oder einem Azidion umgesetzt wird. Diese Verfahren umfassen jedoch 6 bis 11 getrennte chemische Umwandlungen, ausgehend von den einfachen Zuckern. Kürzere Verfahren erfordern seltene Zucker als Ausgangsmaterialien.

Die Inversion der C-4-Konfiguration von Glucosamin ausgehend von dem 4-O-Sulfonat von 2-Acetamido-2-desoxyglucopyranosylderivaten wurde ebenfalls für die Synthese von D-Galactosamin verwendet. Die Umwandlung von Glucosamin in das erforderliche Ausgangsmaterial ist jedoch mühsam.

Die Synthese von Lactosamin ist noch schwieriger, da sie notwendigerweise eine Glycosylierung des Galactosylhalogenids mit einem seltenen Derivat von 2-Acetamido-2-desoxyglucose erfordert. Bei einem bekannten Verfahren sind neun chemische Umwandlungen, ausgehend von 2-Acetamido-2-desoxyglucosamin, vor der Glycosylierungsstufe erforderlich.

Ein Zwischenprodukt, das eine wirksame Herstellung von Glycosiden mit hoher Ausbeute ermöglicht, die die 2-Acetamido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylgruppe enthalten, die beispielsweise in der antigenen Determinante der Menschenblutgruppe A und in dem Forssman-Antigen gefunden wird, ist 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid, hergestellt aus D-Galactaltriacetat in hoher Ausbeute.

Man hat lange angenommen, daß die Verwendung von β-Glycosylhalogenid α-(1,2-cis)-Glycosid-Bindungen durch eine Walden-Inversion des reagierenden Zentrums bei Königs-Knorr-Reaktionsbedingungen ergeben würde, wenn der 2-Substituent so gewählt wird, daß er in der Reaktion an dem anomeren Zentrum nicht teilnimmt. Beispielsweise haben Wolfram, Thompson und Linebeck (J. Org. Chem. 28, 860 (1963)) Tri-O-acetyl-2-nitro-β-D- glucopyranosylchlorid entwickelt, um α-D-Glucopyranoside zu synthetisieren. Es sind Arbeiten bekannt, bei denen 2-Azido-2-desoxy-b-D-glycopyranosylchloride verwendet werden, die zur Bildung von 2-Azido-2- desoxy-α-D-galactopyranosiden führen. Es muß jedoch bemerkt werden, daß die von Paulsen und Mitarbeitern (Angew. Chem., Int. Ed., 14, 558 (1975); Tetrahed. Lett., 1493 (1975) und 2301 (1976); Angew. Chem., Int. Ed., 15, 440 (1975)) beschriebenen Verfahren einen beschränkten, sofern überhaupt einen technischen Wert besitzen wegen der extremen Schwierigkeit, die Synthese von 6-O-Acetyl-2-azido-3,4-O-benzyl- 2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid zu erreichen.

Die durch Umsetzung von O-acyliertem 2-Azido-2-desoxy-glycosylnitrat in einem aprotischen, inerten Lösungsmittel mit einem Tetraalkylammonium- oder einem Alkalihalogenid erhaltene Verbindung 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β- D-galactopyranosylchlorid kann bei Reaktionen mit Alkohol unter Bildung von 3,4,6-Tri-O-acetyl- 2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosiden (A) bei geeigneten Königs-Knorr-Bedingungen für die Kondensation eingesetzt werden.

Die Verbindung wird zu einem leicht verfügbaren Zwischenprodukt für Reaktionen, die zu den Produkten des Typs A führen. Somit ist es technisch möglich, die terminale antigene Trisacchariddeterminante für menschliches Blut-A zu synthetisieren, wie sie in den Strukturen B für die Typ-1- und Typ-2-antigenen Determinanten der Menschenblutgruppe A vorhanden ist. Das Trisaccharid wird in einer Form synthetisiert, die für die Herstellung künstlicher Antigene und Immunoadsorbentien, die mit der menschlichen Blutgruppe A verwandt sind, nützlich ist.

Die Bildung von α-Azido-b-nitratoalkanen durch Umsetzung von Olefinen mit Natriumazid und Cer(IV)-ammoniumnitraten wurde von Trahanovsky und Robbins (J. Am. Chem. Soc., 93, 5256 (1971)) beschrieben.

Die Addition von Azid- und Nitratgruppen an 1,2-ungesättigten Zucker läuft in hoher wirtschaftlicher Ausbeute unter Bildung von 2-Azido-2-desoxyglycosylnitrat ab.

Diese Produkte können aus anomeren Gemischen aus 2-Azido-2-desoxyglycosylnitraten (DE-OS 28 16 340) hergestellt werden.

Die 2-Azido-2-desoxyglycosylnitrate können zu den entsprechenden 2-Amino-2-desoxyzuckern durch Hydrolyse der Nitrat- und Schutzgruppen, und durch Reduktion der Azidogruppe nach an sich bekannten Verfahren umgewandelt werden. Die Hydrolyse kann vor der Reduktion ablaufen oder vice versa. Die N-acetylierten Derivate der Aminozucker können nach an sich bekannten Verfahren erhalten werden.

Die 2-Azido-2-desoxyglycosylnitrate können mit einem Halogenidsalz zum Ersatz der Nitratgruppe und unter Bildung der 2-Azido-2-desoxyglycosylhalogenide behandelt werden. Die Behandlung mit Jodidionen eines anomeren Gemisches aus Glycosylnitraten ergibt thermodynamisch günstigere Anomere, nämlich 2-Azido- 2-desoxy-α-D-glycosyljodid. Das α-Glycosyljodid wird leicht mit einem Äquivalent Chloridion durch Inversion unter Bildung von 2-Azido-2-desoxy-β-D-glycosylchlorid in bekannter Weise substituiert. Dieser Weg zu dem β-Halogenid ist von Vorteil, da er die Umwandlung von Nitraten in ein Reaktionsprodukt ermöglicht, das hauptsächlich das 2-Azido-2-desoxy-β-D-galactosylchlorid enthält, das für die Bildung eines 2-Desoxy-α-D-galactosids einer integralen Einheit der Determinante der Blutgruppe A nützlich ist. Das so beanspruchte Reagens ist 3,4,6-Tri-O- acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid (1).

Die 2-Azido-2-desoxyglycosylhalogenide können zur Herstellung von 2-Amino-2-desoxyglycosiden unter Glycosidierungsbedingungen verwendet werden, beispielsweise unter Königs-Knorr-Bedingungen.

Diese Reaktionen betreffen die Behandlung von Glycosylhalid mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators.

Das so erhaltene 2-Azido-2-desoxyglycosid wird nach an sich bekannten Verfahren unter Bildung von 2-Amino-2-desoxyglycosiden reduziert. Weiterhin können die Schutzgruppen zur Deblockierung des Glycosids entfernt werden. Insbesondere kann 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid mit 8-Methoxycarbonyloctyl-2-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)- 4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid in Anwesenheit eines Aktivators umgesetzt werden. Das Trisaccharidprodukt wird entblockiert und die Azidogruppe wird zu dem Amin reduziert, das anschließend unter Bildung von erfindungsgemäßen 8-Methoxycarbonyloctyl-3-O-(2-acetamido-2- desoxy-α-D-galactopyranosyl)-2-O-(α-L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid acetyliert wird. Dieses erfindungsgemäße Produkt entspricht der antigenen Determinante für die menschliche Blutgruppe A und kann zur Herstellung von Immunoadsorbens verwendet werden, das für die Antikörper A spezifisch ist, durch Fixierung an einen unlöslichen Träger. Es kann weiterhin zur Inhibierung der Reaktion zwischen den Anti-A-Antikörpern und menschlichen A-Erythrocyten verwendet werden. Das erfindungsgemäße Trisaccharid kann ebenfalls zur Herstellung künstlicher Antigene verwendet werden, die das Züchten durch Immunisierung von monospezifischen Anti-A-Antikörpern in Testtieren ermöglichen. Die darauffolgende Isolierung dieser Antikörper unter Verwendung des Immunoadsorbens ergibt dann ein wichtiges und nützliches Reagens für Zell- und Gewebebestimmungen.

Die Azidonitrierungsreaktion zur Herstellung der Ausgangsverbindung 2-Azido-2-desoxyglycosylnitrat wird in der DE-OS 28 16 340 im einzelnen beschrieben.

Im folgenden werden Reaktionsschemata und Formeln der einzelnen Verbindungen aufgeführt.

3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactal

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-talopyranosylnitrat

N-(3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylacetamid)

3,4,6-Tri-O-acetyl-D-glucal

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-glucopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-glucopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-mannopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-benzoyl-D-galactal

3,4,6-Tri-O-benzoyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-benzoyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylnitrat

3,6,2′,3′,4′,6′-Hexa-O-acetyl-D-lactal

3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)- 2-azido-2-desoxy-α-D-glucopyranosylnitrat

3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)- 2-azido-2-desoxy-β-D-glucopyranosylnitrat

3,4-Di-O-acetyl-D-xylal

3,4-Di-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-xylopyranosylnitrat

3,4-Di-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-a/β-D-lyxopyranosylnitrat

3,4-Di-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-xylopyranosylnitrat

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylbromid

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylbromid

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylchlorid

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosyljodid

3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)- 2-azido-2-desoxy-α-D-glucopyranosylchlorid

3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)- 2-azido-2-desoxy-α-D-glucopyranosylbromid

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranose

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranose

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-glucopyranose

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-mannopyranose

1,3,6-Tri-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-galactopyranosyl)- 2-azido-2-desoxy-α-D-glucopyranose

1,3,6-Tri-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-galactopyranosyl)- 2-azido-2-desoxy-β-D-glucopyranose

nicht dargestellt (XXXIII)

2-Acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-desoxy-α-D-galactopyranose

2-Acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-desoxy-β-D-galactopyranose

2-Acetamido-2-desoxy-D-galactose

D-Galactosaminhydrochlorid

3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactosamin

2-Desoxy-D-lactosaminhydrochlorid

2-Azido-2-desoxy-D-galactopyranose

t-Butyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosid

t-Butyl-3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β- D-galactopyranosyl)-2-azido-2-desoxy-β-D-glucopyranosid

t-Butyl-2-acetamido-2-desoxy-β-D-lactosylglycosid

t-Butyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-a-D-galactopyranosid

8-Methoxycarbonyloctyl-4,6-O-benzyliden-2-O-benzoyl-β-D-galactopyranosid

8-Methoxycarbonyloctyl-3-O-(3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido- 2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-4,6-O-benzyliden-2-O- benzoyl-β-D-galactopyranosid

8-Methoxycarbonyloctyl-2-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-α-L- fucopyranosyl)-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid

8-Methoxycarbonyloctyl-3-O-(2-acetamido-2-desoxy-α-D- galactopyranosyl)-2-O-(α-L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid

LR = OCH₃ LIR = NH-NH₂ LIIR = Trägermolekül LIIIR = fester Träger

Die Umwandlung der Azidonitrate in Azidohalogenide wird in der DE-OS 28 57 790 im einzelnen beschrieben.

Umwandlung von Glycosylhalogeniden zu Glycosiden

Die Glycosidierung unter Königs-Knorr-Bedingungen umfaßt die Behandlung der Glycosylhalogeniden mit einem Alkohol, ROH, in Anwesenheit eines Aktivators. Der Aktivator ist üblicherweise ein Salz oder eine Verbindung, die ein schweres Atom, wie Silber, Blei oder Quecksilber, enthält, das sich mit dem Halogenatom koordinieren kann, so daß die Spaltung seiner Bindung mit dem anomeren Kohlenstoffatom erleichtert wird. Das Halogen wird durch die Gruppe -OCH₃ oder -NHNH₂ unter Bildung des Glycoxids ersetzt.

Die α-Glycosylhalogenide von 2-Azido-2-desoxy-D-galactose XX und 2-Azido-2-desoxy-D-lactose XXV und XXVI können für die Herstellung der 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranoside (Beispiele 1, 2) und 2-Azido-2-desoxy-β-D-lactoside (Beispiel 3) unter den Bedingungen der Königs-Knorr-Reaktion verwendet werden.

Das vollständige Verfahren für die Herstellung der Glycoside umfaßt somit beispielsweise:
Umsetzung von 3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactal mit Cer(IV)- ammoniumnitrat und einem Azidsalz in einem geeigneten Lösungsmittel unter Rühren unter Bildung von 3,4,6-Tri-O-acetyl- 2-desoxy-D-galactopyranosylnitraten;
Umsetzung der 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-D-galactopyranosylnitrate mit einem Halogenidsalz beispielsweise einem Iodidsalz, in einem geeigneten Lösungsmittel unter Herstellung von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosylhalogenid, beispielsweise Iodid;
gegebenenfalls Umsetzung, wenn das Iodid verwendet wurde, des 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosyliodids mit einem Mol Äquivalent eines Chloridsalzes in einem geeigneten Lösungsmittel unter Bildung von 3,4,6-Tri- O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid; und
Umsetzung von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylhalogenid, beispielsweise Chlorid, mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators unter Bildung von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosid.

Der Alkohol besitzt bevorzugt die Formel R′OH, worin R′ = (CH₂)_nCO R bedeutet, n = 3 bis 19 bedeutet und R eine -OCH₃- oder -NHNH₂-Gruppe bedeutet oder worin R′ ein geeignet geschütztes Monosaccharid oder sein Disaccharid der Struktur

ist, worin n = 3 bis 19 bedeutet und R eine -OCH₃- oder -NHNH₂-Gruppe, beispielsweise 8-Methoxycarbonyloctyl-2-O-(2,3,4- tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)-4,6-O-benzyliden-β-D- galactopyranosid, bedeutet.

Ein anderes Ausgangsmaterial ist ein peracyliertes 2- Azido-2-desoxy-α-D-lactosylhalogenid, das, wenn es mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators umgesetzt wird, peracylierte 2-Azido-2-desoxy-β-D-lactoside ergibt.

Im speziellen wird 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D- galactopyranosylchlorid (XXIII) mit 8-Methoxycarbonyloctyl- 2-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)-4,6-O-benzyliden- β-D-galactopyranosid (XLVII) in Anwesenheit von Silbertrifluormethansulfonat und Silbercarbonat in dem Lösungsmittel Dichlormethan unter Bildung von 8-Methoxycarbonyloctyl-3-O- (3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-2- O-(2,3,4-tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)-4,6-O-benzyliden-β- D-galactopyranosid (XLVIII) umgesetzt. Dieses Produkt wird nach an sich bekannten Verfahren isoliert und behandelt, so daß die folgenden Reaktionen ablaufen: Abspaltung, d. h. Umwandlung der Acetyl-, Benzyl- und Benzylidengruppen in Hydroxylgruppen, Reduktion der Azidogruppe in ein Amin und Acetylierung des Amins. Das Endprodukt dieser Stufen ist 8-Methoxycarbonyloctyl- 3-O-(2-acetamido-2-deoxy-α-D-galactopyranosyl)- 2-O-(α-L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid, die terminale bzw. endständige Trisaccharid-Antigendeterminante für die menschliche Blutgruppe A.

Beispiel 1 Herstellung von t-Butyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosid (XLI)

0,90 g (2,28 mMol) 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D- galactopyranosylbromid (XX), hergestellt entweder durch Umsetzung von 1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-galactopyranose (XXVII) mit Bromwasserstoff in Methylenchlorid werden zu 0,236 ml (2,40 mMol) t-Butylalkohol, gelöst in 3 ml Methylenchlorid, das 1,8 g (6,74 mMol) Silbercarbonat und ein 4Å-Molekularsieb enthält, gegeben. Nach dem Rühren während 1 h bei Zimmertemperatur wird das Produkt in an sich bekannter Weise isoliert. Man erhält einen Sirup. Die PMR-Prüfung dieses Sirups zeigt ein Doublett bei 4,64 ppm mit J_1,2 = 9 Hz und ein Singlett bei 1,31 ppm, die dem anomeren Proton bzw. Aglycon von t- Butyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosid (XLI) zugeordnet werden, das in einer Ausbeute von 75% erhalten wird.

Beispiel 2 Herstellung von 8-Methoxyoctylcarbonyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-acetamido-2-desoxy-β-D-galactopyranosid (XL)

Eine Lösung aus 1,0 g (2,54 mMol) 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido- 2-desoxy-β-D-galactopyranosylbromid (XXI), gelöst in 2 ml Dichlormethan, wird zu einem Gemisch aus 0,565 g (2,79 mMol) 8- Methoxycarbonyloctanol, 4Å-Molekularsieben und 2,30 g (8,37 mMol) Silbercarbonat in 5 ml Dichlormethan gegeben. Anschließend wird 3 h bei Zimmertemperatur gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Lösung filtriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält 1,30 g Sirup. Dieser Sirup wird in 10 ml Essigsäure, die 10 ml Essigsäureanhydrid enthält, gelöst und 1,17 g (18 mMol) Zinkmetall werden unter Rühren zugegeben. Nach 20 min werden die Feststoffe abfiltriert und das Filtrat auf etwa 2 oder 3 ml konzentriert. Dieses wird mit 25 ml Dichlormethan verdünnt und mit 20 ml gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und 10 ml Wasser gewaschen. Das Trocknen der organischen Lösung und das Eindampfen ergibt 1,0 g (75%ige Ausbeute) eines Sirups, der, wie durch Prüfung des PMR-Spektrums in CDCl₃ gezeigt werden konnte, im wesentlichen reines 8-Methoxyoctylcarbonyl- 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-β-D- galactopyranosid (XLII) ist. Ein Partial-PMR dieser Verbindung in CDCl₃ ergibt (ppm) 6,40 (d, 1, J_{NH, 2} 8,2 Hz, NH), 4,70 (d, 1, J_1,2 8,0 Hz, H-1). Die große Kupplungskonstante von 8,0 Hz für das H-1-Proton wird durch die Bildung der β-D- Glycosylbindung bestätigt.

Beispiel 3 Synthese von t-Butyl-3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-desoxy-β-D-glucopyranosid (XLIII)

Behandlung von 1,0 g (1,46 mMol) 2-Azido-2-desoxy-lactosylbromid (hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 während 2 h) ergibt nach üblicher Aufarbeitung 0,80 g (80%) der Verbindung XLIII.

Die Deacetylierung und Reduktion der Azidogruppe, gefolgt durch N-Acetylierung der Verbindung XLIII ergibt das entsprechende 2-Acetamido-2-desoxy- β-D-lactosylglycosid (XLIV).

In dem folgenden Beispiel wird die Verbindung XXII zur Herstellung einer antigenen Trisacchariddeterminate für die menschliche Blutgruppe A (Beispiel 4) verwendet.

Beispiel 4 Herstellung von 8-Methoxycarbonyloctyl-3-O-(2-acetamido-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-2-O-(α-L-fucopyranosyl)-D-galactopyranosid L

In diesem Beispiel besitzt der Alkohol eine Disaccharidstruktur und das Glycosidierungsprodukt wird durch Umwandlung der Acetyl-, Benzyl- und Benzoylgruppen in Hydroxylgruppen (Schutzgruppenabspaltung) behandelt und dann wird die Azidogruppe zu Amin reduziert, das dann acetyliert wird. Die Verfahren, die für die Schutzgruppenabspaltung, Reduktion und Acetylierung verwendet werden, sind dem Fachmann geläufig.

Eine Lösung aus 0,588 g (1,6 mMol) frisch hergestelltem 3,4,6- Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylchlorid (XXIII), gelöst in 2 ml Dichlormethan, wird zu einer Lösung von 0,035 g (0,136 mMol) Silbertrifluormethansulfonat, 1,70 g (6,18 mMol) Silbercarbonat, 1,12 g 4Å-Molekularsieben und 0,787 g (0,9 mMol) 8-Methoxycarbonyloctyl-2-O-(2,3,4-tri-O- benzyl-α-L-fucopyranosyl)-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid (XLVIII) in 5 ml Dichlormethan gegeben. Nach 4 h bei Umgebungstemperatur wird das Gemisch mit 10 ml Dichlormethan verdünnt und durch Diatomeensilica filtriert. Das Filtrat wird eingedampft und man erhält 1,25 g Sirup. Dieser Sirup wird an einer Säule (44 × 2 cm) von Silicagel mit 2 : 1(V/V)-Benzol/ Äthylacetat als Eluierungsmittel chromatographiert. Man erhält 0,780 g (75%ige Ausbeute) reines 8-Methoxycarbonyloctyl- 3-O-(3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)- 2-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-a-L-fucopyranosyl)-4,6-α-benzyliden- β-D-galactopyranosid XLIX, [α] + 15,5° (c 1, Chloroform), IR (Film) 2110 cm^-1 (-N₃).

Das PMR-Spektrum der Verbindung XLIX in CDCl₃ besitzt teilweise 5,47 (d, 1, J_{1′′, 2′′} 3,4 Hz, H-1′′), 5,32 (d, 1, J_{1′, 2′} 3 Hz, H-1′). Ihr 13 C-NMR-Spektrum in CDCl₃ zeigt klar die beiden α-Glycosidinterzuckeranomer-Kohlenstoffatome mit Signalen bei 97,9 ppm und 94,0 ppm für C-1′ der Fucosyleinheit und C-1′′ der 2-Azido-2-desoxygalactosyleinheit. Das Signal, das dem C-1 der Galactosyleinheit zugeordnet wird, tritt bei 100,5 ppm auf.

0,10 g (0,085 mMol) Verbindung L werden in 2 ml Äthylacetat, das 0,2 ml Essigsäureanhydrid enthält, gelöst und in Anwesenheit von 5%igem Palladium auf Kohle (0,06 g) bei 6,896 bar (100 psig) und Umgebungstemperatur hydriert. Nach 23 h wird die Lösung filtriert und eingedampft. Man erhält einen Schaum. Das Infrarotspektrum dieser Verbindung zeigt die Abwesenheit einer Azidgruppe. Die Verbindung wird von ihren Schutzgruppen befreit und deacetyliert mit Natriummethoxid in 5 ml wasserfreiem Methanol bei Umgebungstemperatur während 15 h. Nach der Deionisierung und Filtration sowie Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 0,08 g Schaum. Die Hydrierung dieses Materials in 3 ml Äthanol in Anwesenheit von 0,065 g 5%igem Palladium auf Kohle bei Umgebungstemperatur und 6,896 bar während 40 h, gefolgt von der Filtration und Verdampfung, ergibt 0,046 g (78%ige Ausbeute) 8-Methoxycarbonyloctyl-3-O-(2-acetamido-2- desoxy-α-D-galactopyranosyl)-2-O-(α-L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (XLIX) als weißen Feststoff.

Das PMR-Spektrum der Verbindung L in D₂O ist in Übereinstimmung mit der zugeordneten Struktur und zeigt teilweise (ppm) 5,62 (d, 1, J_{1′, 2′} 1 Hz, H′), 5,46 (d, 1, J_{1′′, 2′′} 3,5 Hz, H-1′′), 2,24 (s, 3, NAc). Diese Verbindung ist die antigene Trisacchariddeterminante für die menschliche Blutgruppe A.

Beispiel 5 Herstellung eines Immunoadsorbens (LII), das für die Anti-A-Antikörper spezifisch ist

Die antigene Trisacchariddeterminante (L) für die menschliche Blutgruppe A kann zur Herstellung eines künstlichen Antigens durch Fixierung an einem löslichen Trägermolekül, wie Proteine, rote Blutzellen, Polypeptide und lösliche aminierte Polysaccharide, unter Verwendung bekannter Verfahren verwendet werden.

Das Glycosid L kann ebenfalls zur Herstellung eines Immunoadsorbens verwendet werden, das für die Anti-A-Antikörper spezifisch ist, durch Fixierung an einen unlöslichen Träger, wie aminiertes Glas, aminiertes Polyacrylamid, aminiertes Polyvinyl, aminierter Agarose und andere unlösliche aminierte Polysaccharide. Dieses Verfahren wird im folgenden erläutert.

0,044 g (0,063 mMol) 8-Methoxycarbonyloctyl-3-O-(2-acetamido- 2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-2-O-(α-L-fucopyranosyl)-β-D- galactopyranosid (L) werden mit 2 ml 85%igem Hydrazinhydrat bei Zimmertemperatur während 90 min gerührt. Die Prüfung durch Dünnschichtchromatographie des Reaktionsgemisches an Silicagel zeigt bei der Entwicklung mit 7 : 1 : 2(V/V)-Isopropanol/Ammoniumhydroxid/ Wasser kein restliches Ausgangsmaterial. Diese Lösung wird mit 1 ml 50%igem wäßrigen Äthanol verdünnt und zur Trockene eingedampft. Man erhält 0,044 g eines weißen Schaums. Das Material wird in 2 ml Wasser gelöst und gegenüber destilliertem Wasser in einer Ultrafiltrationszelle dialysiert, wobei fünfmal ausgetauscht wurde, und die Zelle mit einer Membran mit einem Molekulargewichtschnitt von 500 ausgerüstet ist. Es wird dann gefriergetrocknet. Man erhält 0,039 g des entsprechenden Hydrazids LI als weißen Feststoff.

Das PMR-Spektrum der Verbindung L in D₂O steht in Übereinstimmung mit der zugeordneten Struktur und zeigt teilweise (ppm) 5,58 (d, 1, J 1 Hz, H-1′), 5,44 (d, 1, J_{1′′, 2′′} 3,5 Hz, H-1′′), 2,30 (s, 3, NAc).

0,35 g (0,05 mMol) des Hydrazids LI werden in 0,7 ml Dimethylformamid gelöst und auf -25°C abgekühlt. Eine Lösung von 0,057 ml Dioxan, die 3,5 N-Chlorwasserstoffsäure enthält, wird zugegeben und dann werden 0,007 g (0,069 mMol) t-Butylnitrat, gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid, zugegeben. Dieses Gemisch wird 30 min bei -25°C gerührt, danach werden 0,0049 g (0,052 mMol) Sulfamidsäure zugegeben. Nach 15 min wird diese Lösung tropfenweise zu 5,0 g silylaminierten Glasperlen, die in 25 ml Pufferlösung, 0,08 M in Na₂B₄O₇ und 0,35 M in KHCO₃ bei 0°C suspendiert sind, zugegeben. Die Suspension wird langsam bei 3 bis 5°C 26 h in einer Trommel bewegt, danach wird der Träger abfiltriert und mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Perlen werden in 30 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung suspendiert und 30 ml 5%iges wäßriges Essigsäureanhydrid werden zugegeben. Dann wird 15 min gerührt. Die Perlen werden dann filtriert und mit 500 ml Wasser gewaschen und in 25 ml phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7) suspendiert und 15 min reduziertem Druck ausgesetzt. Die Filtration und Waschen mit 100 ml Wasser ergibt 11,2 g hydratisiertes Immunoadsorbens LIII. Eine Phenol/Schwefelsäure-Analyse für die Gesamthexose dieses Immunoadsorbens vor der Acetylierung zeigt eine Beladung von 6 µMol Hapten pro g Träger.

Es wurde gefunden, daß das Immunoadsorbens LIII selektiv Anti- A-Blutgruppenantikörper aus Menschensera entfernt. Beispielsweise werden durch Behandlung von 1 ml Serum, das wirksam Menschen- A-Blutzellen agglutiniert, mit 200 mg des Immunoadsorbens LII diese Antikörper, die für die Agglutination verantwortlich sind, innerhalb 20 min entfernt. Die Verwendung des Immunoadsorbens in Form der gepackten Säule ist noch wirksamer.

Claims

1. Trisaccharide der allgemeinen Formel in der R-OCH₃ oder -NHNH₂ und n 3 bis 19 bedeuten.

2. Trisaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 8-Methoxycarbonyloctyl- 3-O-(2-acetamido-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-2-O-(α- L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid ist.

3. Verwendung eines Trisaccharides nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Immunoadsorbens, indem man in an sich bekannter Weise das Trisaccharid an einen aminierten unlöslichen Träger fixiert.

4. Verwendung eines Trisaccharides nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Antigens, indem man in an sich bekannter Weise das Trisaccharid an Proteine, Polypeptide oder aminierte Polysaccharide als lösliche Träger fixiert.