DE2816340A1 - Verfahren zur herstellung von glycosylderivaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glycosylderivaten. - . '..-..

Es ist gut "bekannt, daß Kohlehydrätstrukturen verschiedener komplexer Zusammensetzungen antigene Determinaritien für einen großen Bereich* von Substanzen sind. Es ist: weiterhin sichergestellt, daß relativ kleine Moleküle, die als Haptene bekannt sind, der Struktur der antigenen Determinante entsprechen können. Die Haptene ergeben, wenn sie an geeignete Trägermoleküle gebunden sind, ein künstliches Antigen, das, wenn es einem Tier unter geeigneten Bedingungen verabreicht wird, die Bildung von Antikörpern mit einer Spezifizität für das Hapten bewirkt. In den vergangenen Jahren wurde viel Literatur, veröffentlicht, die die Herstellung von Immunoabsorben-

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(o··) saaaea teucx os-aeaao tclsqr>(mmc monapat teuekopicr««

tien aus Haptenen betrifft. Diese Literatur betrifft die Bildung des Haptens normalerweise durch kovalente Bindungen, aber manchmal auch durch hydrophobe Bindungen, in einem Feststoff, Latex oder gelatineartigen Träger. Das Hapten wird immobilisiert, so daß, wenn das entstehende Immunoabsorbens den Antikörpern mit den Bindungsstellen für die haptenische Struktur ausgesetzt ist, ein Binden der Antikörper an der Oberfläche des Immunoabsorbens stattfindet und so müssen die Antikörper spezifisch aus der Lösung entfernt werden.

Viele Arten von Feststoff-, Latex- und Gelträgern für die Herstellung von Immunoabsorbentien wurden entwickelt und viele Wege wurden für die Bindung des Haptens an diese unlöslichen Strukturen vorgeschlagen. Obgleich Verbesserungen bei diesen Materialien möglich sind, liegt die Hauptschwierigkeit darin, daß ein einfacher Zugang zu dem gewünschten Hapten in einer Form, die für die Bindung bzw. Haftung an dem Trägermolekül geeignet ist, fehlt.

Es war das ursprüngliche Ziel der Anmelderin, ein praktisches Verfahren für die Synthese von D-Galactosaminhydrochlorid ■(XXXVII) und von D-Lactosaminhydrochlorid (XXXIX) und ihren Derivaten zu entwickeln. Sowohl Galactosamin als auch Lactosamin, normalerweise in Form ihrer N-acetylierten Derivate, finden sich vielfach in der Natur. Sie kommen in Glycoproteinen, Glycolipiden und Mucopolysacchariden vor. Als solche sind sie wichtige Aufbaueinheiten, die in den antigenen Determinanten der Blutgruppensubstanz gefunden werden.

Die bekannte Hauptquelle für D-Galactosamin ist die Säurehydrolyse von Chrondroitinsulfat C, das durch Extraktion von Knorpelgewebe, wie Sehnen, Trachea und Hasensepta erhalten wird. Diese Ausbeuten sind ungewiß und es ist schwierig _f ein kristallines Produkt herzustellen. Es gibt zahlreiche chemische Syn-

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thesen, bei denen 1,6,2,3,-Dianhydro-ß-D-talopyranose mit Ammoniak oder einem Azidion geöffnet wird. Diese Verfahren umfassen jedoch 6 bis 11 getrennte chemische Umwandlungen, aus gehend von den einfachen Zuckern. Kürzere Verfahren hängen von sehr seltenen Zuckern als Ausgangsmaterialien ab.

Die Inversion der C-4-Konf iguration von Glucosamin durch Er satz von dem 4-0-Sulfonat von 2-Acetamido-2-deoxyglucopyrano- sylderivaten wurde ebenfalls für die Synthese von D-Galacto- samin verwendet. Die Umwandlung von Glucosamin zu dem er forderlichen Ausgangsmaterial ist jedoch mühsam.

Die Synthese von Lactosamin ist noch schwieriger, da sie notwendigerweise eine Glycosylierung des Galactosylhalids mit einem seltenen Derivat von 2-Acetamido-2-deoxyglucose erfordert. Bei einem kürzlich publizierten Verfahren sind neun chemische Umwandlungen, ausgehend von 2-Acetamido-2-deoxyglucosa~ min, vor der Glycosylierungsstufe erforderlich.

Erfindungsgemäß wird ein Reagens zur Verfügung gestellt, das eine wirksame Herstellung von Glycosiden mit hoher Ausbeute ermöglicht, die die 2-Acetamido-2-deoxy-α-D-galactopyranosylgruppe enthalten, die beispielsweise in der antigenen Determinante der Menschenblutgruppe A und in dem Forssman-Antigen gefunden wird. Das so beanspruchte nützliche Reagens ist 3,4, e-Tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIII), hergestellt einfach aus D-Galactaltriacetat (i) in hoher Ausbeute.

Man hat lange angenommen, daß die Verwendung von ß-Glycosylhalid cc-(1,2,-cis)-Glycosid-Bindungen durch eine Walden-Inversion des reagierenden Zentrums bei Könings-Knorr-Reaktionsbedingungen ergeben würde, wenn der 2-Substituent so gewählt wird, daß er in der Reaktion an dem anomeren Zentrum nicht

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teilnimmt. Beispielsweise haben Wolf rom, Thompson und Linebeck (J. Org. Chem., 28, 860 (1963)) Tri-O-acetyl-2-nitro-ß-D-glucopyranosyl dilorid entwickelt, um a-D-Glucopyranoaide zu synthetisieren. Verschiedene Arbeiten wurden in der kürzlichen Literatur veröffentlicht, bei denen 2-Azido-2-deoxy-ß-D-glycopyranosylchloride verwendet werden, wie es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt, das zu der Bildung von 2-Azido-2-deoxy-cc-D-galactopyranosiden führt. Es muß jedoch bemerkt werden, daß die von Faulsen und Mitarbeitern (Angew. Chem., Int. Ed., 14, 558 (1975); Tet. Lett., 1493 (1975) und 2301 (1976),· Angew. Chem., Int. Ed., 1j>, 440 (1975)) beschriebenen Verfahren einen, beschränkten, sofern Überhaupt einen technischen ifert besitzen wegen der extremen Schwierigkeit, die Synthese des gewünschten 2-Azido-2-deoxyreagens, nämlich 6-0-Acetyl-2-azido-3,4-0-benzyl-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid, zu erreichen.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur wirksamen Herstellung der Verbindung 3,4,6-Tri-Qracetyl-2-azidor2-depxy-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIII) und ihre Verwendung bei Reaktionen mit Alkohol unter Bildung von 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosiden (A) bei geeigneten Könings-Khorr-Bedingungen für die Kondensation.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren, gemäß denen die Verbindung XXIII ein leicht verfügbares Reagens bei Reaktio-

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J-

nen-verwendet wird, die zu den. Produkten des Typs A führen. Somit ist es technisch möglich, die terminale antigene Trisacchariddeterminante für menschliches Bkrt-A zu synthetisieren, wie
sie in den Strukturen B für die Typ-1- und Typ-2-antigenen
Determinanten der Menschenblutgruppe A vorhanden ist. Das
Trisaccharid wird in einer Form synthetisiert, die für die
Herstellung künstlicher Antigene und Immunoabsorbentien, die . mit der menschlichen Blutgruppe A verwandt sind, nützlich ist.

(Typ-1-A-Determinante)

B
(Typ-2-Determinante )

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Die Bildung von α-Azido-ß-nitratoalkanen durch Umsetzung von Olefinen mit Natriumazid und Cer(IV)-ammoniumnitraten wurde von Trahanovsky und Robbins (J. Am. Chem. Soc, <££, 5256 (1971)) beschrieben. Das Ausdehnen der obigen Reaktion auf vinylische Äther oder Strukturen, die so komplex sind wie D-Galactaltriacetat, hat jedoch nicht nahegelegen, überraschenderweise wurde gefunden, daß die Addition von Azid-und Nitratgruppen zu 1,2-ungesättigten Zuckern in hoher wirtschaftlicher Ausbeute unter Bildung von 2-Azido-2-deoxyglycosylnitrat abläuft.

Gegenstand der Erfindung ist die Behandlung geschützter Glycale mit Azidionen in Anwesenheit von Cer(IV)-ammoniumnitrat, wobei eine Azidgruppe und eine Nitratgruppe an die C-2- und C-1-Stellungen des Glycale addiert werden. Diese neuen Produkte, nämlich die. anomeren (anomeric) Gemische aus 2-Azido-2-deoxyglycosylnitraten, ermöglichen einen Eintritt in die folgenden Klassen von Verbindungen:

(1) Die 2-Amino-2-deoxyzucker durch Hydrolyse der Nitratgruppe und Reduktion der Azidogruppe,

(2) die 2-Azido-2-deoxyglycosylhalide durch Ersatz des Glycosylnitrats, und

(3) die 2-Amino-2-deoxyglycoside durch Umsetzung der 2-Azido-2-deoxyglycosylhalide.

Die Wirkung der Azidogruppe ist die, daß sie ein nicht-teilnehmender Progenerator der Aminofunktion ist und als solcher die Synthese der 2-Amino-2-deoxy-a-D-glycoside nicht stört.

Erfindungsgemäß können die 2-Azido-2-deoxyglycosylnitrate zu den entsprechenden 2-Amino-2-deoxyzuckern durch Hydrolyse

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der Nitrat- und Schutzgruppen, und durch Reduktion der Äzidogruppe nach an sich bekannten Verfahren umgewandelt werden. Die Hydrolyse kann vor der Reduktion ablaufen oder vice versa. Die N-acetylierten Derivate der Aminozucker können nach an sich bekannten Verfahren erhalten werden.

Erfindungsgemäß können die 2~Azido-2-deoxyglycosylnitrate mit einem Halidsalz zum Ersatz der Nitratgruppe und unter Bildung der 2-Azido-2-deoxyglycosylhalide, die neue Verbindungen sind, behandelt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren ergibt die . Behandlung mit Jodidionen eines anomeren Gemisches aus Glycosylnitraten thermodynamisch günstigere Anomere, nämlich 2-Azido-2-deoxy-a-D-glycosyljodid. Das a-Glycosyljodid wird leicht mit einem Äquivalent Chloridion durch Inversion unter Bildung in hohen Ausbeuten von 2-Azido-2-deoxy-ß-D-glycosylchlorid substituiert. Dieser Weg zu dem ß-Halid ist von Vorteil, da er die Umwandlung von Nitraten in ein Reaktionsprodukt ermöglicht, das hauptsächlich das 2-Azido-2-deoxy-ß-i)-galactosylchlorid enthält, das für die Bildung eines 2-Deoxy-a-D-glacosids, einer integralen Einheit der Determinante der Blutgruppe A, nützlich ist. Das so beanspruchte Reagens ist 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deory-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIII).

Die 2-Azido-2-deoxyglycosylhalide können zur Herstellung von 2-Amino-2-deoxyglycosiden unter Glycosidierungsbedingungen verwendet werden, wie den Bedingungen, die normalerweise in der Kohlehydratchemie als Könings-Knorr-Bedingungen bekannt sind. Diese Reaktionen betreffen die Behandlung von Glycosylhalid mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators, damit der Ersatz des Halogens durch die Alkoxygruppe des Alkohols erfolgt. Das so erhaltene 2-Azido-2-deoxyglycosid wird nach an sich bekannten Verfahren unter Bildung von 2-Amino-2-deoxyglycosiden reduziert. Weiterhin können die Schutzgruppen zur Deblockierung des Glycosids entfernt werden. Insbesondere kann

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3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deo3jy-ß-D-galactopyranosylchlorid mit 8-Methoxycarbonylocty1-2-0-(2,3,4-tri-O-benzyl-a-L-f ucopyranosyl)-4,6-0-benzyliden-ß-D-galactopyranosyl in Anwesenheit eines Aktivators umgesetzt werden. Das Trisaccharidprodukt wird von der Schutzgruppe befreit bzw. entblockiert und die Azidogruppe wird zu dem Amin reduziert, das anschließend unter Bildung von 8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(a-L-fucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid acetyliert wird. Dieses letztere Produkt entspricht der antigenen Determinante für die menschliche Blutgruppe A und kann zur Herstellung von Immunoabsorbens verwendet werden, das für die Antikörper A spezifisch ist, durch Haftung bzw. Bindung an einen unlöslichen Träger. Dieses letztere Produkt kann weiterhin zur Inhibierung der Reaktion zwischen den Anti-A-Antikörpern und menschlichen A-Erythrocyten verwendet werden. Das Produkt kann ebenfalls zur Herstellung künstlicher Antigene verwendet werden, die das Züchten durch Immunisierung von monospezifischen Anti-A-Antikörpern in Testtieren ermöglichen. Die darauffolgende Isolierung dieser Antikörper unter Verwendung des Immunoabsorbens ergibt dann ein wichtiges und nützliches Reagens für Zeil- und Gewebebestimmungen.

Die Azidonitrierunffsreaktion;

In dem folgenden Formelschema sind die Formeln der Verbindungen I bis LII aufgeführt. In der Beschreibung und in den spezifischen Versuchsbeispielen, die die Erfindung erläutern, wird auf diese Formeln Bezug genommen.

In den Beispielen 1 bis 7 wird die Umsetzung geeignet geschützter Glycale mit Cerammoniumnitrat bzw. Cer(lV)-ammoniumnitrat und einem Azidsalz unter Bildung der entsprechenden 2-Azido-2-deoxyglycosylnitrate erläutert.

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Der Ausdruck "Glycal" betrifft 1,2-ungesättigte Zucker, die durch die Struktureinheit

charakterisiert sind. Der Ausdruck "geschütztes Glycal" bedeutet, daß die Hydroxylsubstituenten durch Schutzgruppen, wie Acetyl, Propionyl und Benzoyl, geschützt sind, die, da sie weniger reaktiv sind als die Hydroxylgruppe, nicht an den nachfolgenden Reaktionen teilnehmen. Auf diese Weise bleiben die Eigenschaften der Glycale ausgenommen der Unsättigung erhalten.

Beispiele geschützter Glycale sind 3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactal, I; 3,4,6-Tri-O-acetyl-Dr-glucal, VI; 3,4,6-Tri-O-benzoyl-D-galactal, X; Hexa-O-acetyl-D-lactal, XIII; und 3,4-Di-O-acetyl-D-xylal, XVI.

Bei der Azidonitrierung der Glycale, die in den Beispielen 1 bis 7 erläutert wird, werden die geschützten Glycale mit einem Überschuß eines 2:1(Mol/Mol)-Gemisches aus Cerammoniumnitrat und einem Azidsalz umgesetzt. Es ist bekannt, daß diese beiden Salze unter Bildung von Stickstoffgas als Produkt reagieren. Der geringe Überschuß an Reagens wird zur Kompen3ierung dieses Verlusts verwendet.

Man nimmt an, daß der folgende Mechanismus bei der Azidonitrierungsreaktion stattfindet. Dies soll jedoch keine Beschränkung sein.

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Ce⁺⁴ + N.

■ )0 -

AcO

3Ac

AcO

'OAc

no:

OAc

ΟΝΟ,

Ce(IV) ist ein starkes Oxidationsmittel und entnimmt bzw. streift ein Elektron von dem negativ geladenen Azidion ab. Das entstehende Azidradikal addiert sich längs der 1,2-ungesättigten Bindung des Glycals unter Bildung eines Zwischenradikals. Ein zweites Ce(IV)-ion kann das Zwischenradikal unter Bildung eines Oxycarboniums oxidieren. Die Addition eines Nitrations an die C-1-Stellung ergibt das 2-Azido-2-deoxyglycosyInitrat.

Das Azidsalz kann irgendeines der üblichen Alkalimetallazide sein. Vorzugsweise wird aus Kosten- und HandhabungsgrUnden Natriumazid verwendet, aber Lithium- oder Kaliumazide sind ebenfalls geeignet.

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Ein 2-Azidosubstituent ist -wünschenswert, da er die nachfolgende Bildung der a-Glycosidbindung an dem anomeren (C-1)-Zentrum nicht stört und zu einer Aminofunktion nach an sich bekannten Verfahren unter Bildung von 2-Amino-2-deoxyzuckern reduziert werden kann.

Es wird ein Lösungsmittel verwendet, das die drei Reagentien, das nicht-polare Glycal und die ionischen Salze in Mengen lösen kann, die ausreichende Konzentrationen von diesen Verbindungen in dem Reaktionsgemisch ergeben. Zusätzlich sollte das Lösungsmittel im wesentlichen.gegenüber den Reaktionsbedingungen inert sein und gegenüber dem Cer(IV)-salz oxidationsbeständig sein. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Acetonitril wegen seiner Oxidationsbeständigkeit und seiner Fähigkeit, eine geeignete Konzentration der reagierenden Spezies in Lösung zu ergeben. Andere Lösungsmittel können verwendet werden, wie Äthylacetat oder Essigsäure, aber im Falle des'letzteren sind die Nebenreaktionen ausgeprägt. Das Lösungsmittel wird bevorzugt vor der Verwendung getrocknet, da durch die Anwesenheit von Wasser die Nebenreaktionen begünstigt werden. Wegen der Unterschiedlichkeit der Löslichkeit der Reaktionsteilnehmer ist ein wirksames Rühren erforderlich, damit ausreichende Konzentrationai in dan Reaktionsgemisch erhalten werden und eine wirksame Reaktionsrate sichergestellt ist.

Der bevorzugte Reaktionstemperaturbereich beträgt von -25 bis +25⁰C. Die untere Grenze wird durch den Gefrierpunkt von Acetonitril, das bevorzugt verwendete Lösungsmittel, bestimmt, während die obere Grenze wüLkürlich als Temperatur verwendet wird, über der konkurrierende Nebenreaktionen wesentlich werden. Obgleich die reaktionskinetischen Werte bei niedrigeren Temperaturen etwas langsamer sind, und längere Reaktionszeiten erfordern, sind die Ausbeuten an den gewünschten Produkten besser.

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. Md-

Obgleich die Reaktion in Luft durchgeführt werden kann, wird eine Inertatmosphäre, wie Stickstoff, bevorzugt verwendet.

In den Beispielen 1 und 2 werden zwei unterschiedliche Verfahren, beide Gegenstand der vorliegenden Erfindung, für die Herstellung von 2-Azido-2-deoxynitraten von 3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactal erläutert. Das erste ist ein Verfahren, das für die technische Produktion geeignet ist, während das zweite Verfahren dem Versuch entspricht, der zu der Erfindung geführt hat. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch alle Variationen bei den Reaktionsbedingungen und Aufarbeitungsver-. fahren, die für den Chemiker nahegelegen haben, und alternative Verfahren, die nur Änderungen in den Reaktions- und Ext-raktionslösungsmitteln^ der Art der Zugabe, der Rührraten und den Temperaturbereichen umfassen.

Im folgenden werden Reaktionsschemata und Formeln der einzelnen Verbindungen aufgeführt.

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1· Azidonitrierungsreaktion

Reaktions s chemata

oo

co

CD

ίο

-J Ol

OAc

+ Ce(NO₃

3,4,6-Tri-O-acetyl- Cer (IV) -ammo.

τ-, τ j. -1 niumnitrat D-galactal (geschütztes Glycal)

Acetonitril

(geeignetes Lösungsmittel)

Na-

trium-

azid

KcO

O*c

OV)O,

N,

■■■' l W«

3,4,6-Tri-O- 3,4,6-Tri-O-acetylacetyl-2-azi-2-azido-2-deoxy-ßdo-2-deoxy-a-D-galactopyranosyli >-galactopy- nitrat ranosylnitrat
(2-Azido-2-deoxyglycosylniträte)

00

CD OO 4C--

- 14 -

2. Umwandlung von Glycosylhaliden In Glycoside

OAc

OO O CO OO

AcO

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy- ß-D-galactopyranosylchlorid (acyliertes 2-Azido-2-deoxyglyco- sylhalid)

CF,S0₂0"Ag⁺

Silber- Silbertri-

carbonat fluormethan-

sulfonat (Aktivator) 1 -*·οΑ«.

■t-Butanol (Alkohol)

t-Butyl-3,4,6-tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopy- ranosid

(acyliertes 2-Azldo-2-deoxyglycopyranosid)

oo

CO CO

3. Umwandlung von Azidonitraten in Aminozucker

»O&C

Ersatz der Nitrat-

gruppe durch die Acylgruppe

3,4>6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-ga- lactopyranosylnitrat

(acyliertes 2-Azido-2-deoxyglyeosylnitrat)

Reduktion der Azidogruppe

^zur Aminogruppe

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl 2-azido-2-deoxy-D-ga-

lactopyranose

(acylierte: 2-Azido-2-r deoxyglycose)

Säurehydrolyse der Acylgruppen

OAc

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-

(acylierte 2-Amino-2-deoxyglucose)

ein Salz von D-Galactosamin OO

Säuresalz einer 2-Amino-2-deo_X3£iLuco_Se)

- 16 -

4. Umwandlung der Azidonitrate in Azidohallde

OO O CO CD .*>

OKJOj.

OAc

Acetonitril

(geeignetes

LösungSf-

mittel)

AcO

3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxya-D-galactopyranosylnitrat (acylierte 2-Azido~2-deoxyglycosylnitrate)

3,4,6-Tri-0-ae@tyl« 2-azido-2-deo2ey-ß~ D-galactopyranosylnitrat

Tetraäthyl-

ammonium-

chlorid

(Halidsalz) 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxya-D-galactopyranoaylchlorid

(acylierte 2-Azido-

3,4,6-Tri-0-acetyl-2-

azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid 2-deoxyglycosylhalide)

Ohc

Aco

OAc I

3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactal

3,4,e-Tri-O-acetyl-Z-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylnitrat

3,4,6-Tr:L-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyrano- sylnitrat

3,4,ö-

2-deoxy-α-D-talopyranosylnitrat

N- (3,4,^J6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyrano sylacetamid)

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AcO

.OAe,

3, ^6-Tri-O-acetyl-D-glucal

3,4,ö-Tri-o-acetyl^-azido-2-deoxy-a-D-glucopyranosylnitrat

VIII

AcO

AtO

-OAc

OMO, j 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosylnitrat

OAe.

Ae-O 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-de oxy-a-D-mannopyranosylnitrat

ONJO,

3,4,6-Tri-O-benzoyl-D-galactal

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Oftr

83-

3,4,6-Tri-0-l)enzoyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylnitrat

οκίο

3,4,S-Tri-O-benzoyl-a-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosyl-

! nitrat

XIII

3,6,2»,3^l _t4^l,6^l-Hexa-O-acetyl-D-lactal

OKJO₂.

3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-a-D-glucopyranosylnitrat

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. Ql·

3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosylnitrat

Acc

XVII 3,4-Di-O-acetyl-D-xylal

3,4-Di-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-xylopyranosylnitrat

XVIII

AcP 3,4-Di-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-g-D-lyxopyranosylnltrat

! 3,4-Di-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-xylopyranosylnitrat

OAc

3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl- broniid

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AcO

3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylbromid

XXII

OAc

OAc

CJL 3,4,G-

2-deoxy-a-D-galactopyranosylchlorid

XXIII

CXJ 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyrano- sylchlorid

XXIV

oAc

KcD

3,4,6-Tri-0-acetyl~2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyrano- syljodid

CJL

3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl) ^-azido^-deo^-a-D-glucopyranosylchlorid

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XXVI

-A-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl) ^-azido-Z-deo^-a-D-glucopyranosylbromid

1»3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galacto- pyranose

XXVIII

1>3,4,6-Tetra-0-acetyl-2- :azido-2-deoxy-ß-D-galacto-.pyranose

XXIX

1,3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-de oxy-a-D-glucopyranose

1> 3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-mannopyra- nosa

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XXXI

Aco

OKc-

1,3,e-Tri-O-acetyl-^-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-α-D-glucopyΓanosβ

XXXII

Ol·*-

1,3,6-Tri-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-ß-D-glucopyranose

XXXIII nicht dargestellt XXXIV

2~Acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-a-D-galac- topyranose

XXXV

P.c-0

2-Acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetyl-2~deoxy-ß-D-galac- topyranose

AcNH

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XXXVI

i «ο

OH

HOU 2-Acetamido-2-deoxy-D galactose

XXXVII

D-Galactosaminhydrochlorid

XXXVIII

iS^_u 3,4,β-Tri-O-acetyi-D-galactosamin

XXXIX

H₁OH;

E-Deoxy-D-lactosaminhydrochlorid

2-Azido-2-deoxy-D-galactopyranose

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a* 89··

t-Butyl-3,A,6-tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galacto· pyranosid

AcO

Ac

t-Butyl-3,6-di-O-acetyl-A-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-ß-D-glucopyrano3id

OH

OH

t-Butyl-2-acetamido-2-deoxy-ß-D-lactosy!glycosid

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2-6 -

pAc

t-Butyl^^ö-tri-O-acetyl-^-azido^-deoxy-a-D-galactopyranosid

8-Methoxycarbonyloctyl-4,6-0-benzyliden-2-0-benzoyl^ß-. D-galactopyranosid

8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(3,4,6-tri-0-acetyl-2-azido-■2-deoxy-a-D-galactopyrano.syl )-4,6-0-benzyliden-2-0-beiizoyl-ß-D-galactopyranosid

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XLVIII

CfcUs-

28

6340

8-Methoxycarbonylo ctyl-2-0- (2,3,4-tri-0-"benzyl--a-L-fucopyranosyl) -4, 6-0~"benzyliden-ß--D-galactopyranosid

CW₅-

OAlC

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- 2βΓ

. 3a.

co-

L	R = OCH,
LI	R = MH-NH2
LII	R = Trägermolekül
LIII	R β fester Träger

8-Methoxycarl)onyloctyi-3-Ö-(2-acetamido-2-deo3cy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(α-L-f ucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid

BeisOiel 1

Die Umsetzung von 2.3.4-Tri-0-acetyl-D-galactal(l) mit Cer(IV)' ammoniumnitrat in Anwesenheit von Natriumazid

In einen 5-1-Dreihals-Rundkolben, der mit einem Einlaßrohr, einem Auslaßrohr-und einer wirksamen mechanischen Rührvorrichtung ausgerüstet ist, gibt man 899,90 g (1,64 Mol) festes Cer(IV)-ammoniumnitrat und 53,37 g (0,82 Mol) ftetes Natriumazid und kühlt auf -15⁰C unter Stickstof fatmoaphttre. 150 g (0,551 Mol) 2,3,4-Tri-O-acetyl-D-galactal wird in 3,4 wasserfreiem Acetonitril in einem 4-1-Dreihalskolben, der

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mit einem Einlaß- und Auslaßrohr ausgerüstet ist, gelöst. Diese Lösung wird auf -15°C unter Spülen mit Stickstoff abgekühlt. Durch. Anwendung eines positiven Stickstoffdruckes wird die Acetonitrillö3ung in den Behälter gepumpt, der die festen Reaktionsteilnehmer enthält. Man verwendet dazu ein inertes Rohr. Nach !Beendigung der Zugabe der Acetonitrillösung (etwa 1 min) beginnt man mit dem mechanischen Rühren und rührt während etwa 15 bis 20 h oder bis kein Glycal bei der Prüfung des Reaktionsgemisches durch Dünnschichtchromatographie (t.l.c.) an Silicagel bei der Elution mit Hexan/Äthylacetai^ (V/V) 6:4, nachweisbar ist. Zu diesem Zeitpunkt werden 1 1 Toluol und 1 kaltes Wasser zugegeben und der Reaktionsbehälter wird aus dem KUhlbad entfernt. Dieses Gemisch wird in einen 1Q-I-Behälter überführt und nach der Zugabe von 2 1 Toluol wird die organische Schicht abgetrennt und in einen Trenntrichter gegeben. Diese Lösung wird mit 3x11 kaltem Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird durch ein mit Toluol befeuchtetes Filterpapier filtriert und das Filtrat wird im Vakuum bei einer Temperatur unter 40°C zu 200 g Sirup konzentriert. Das protonmagnetische Resonanzspektrum (p'.m.r.) dieses* Sirups zeigt, daß er* hauptsächlich die 2-Azido-2-deoxynitrate -enthält.* Die Zusammensetzung des Produktes ist 37% 3f4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deo;*y-a-D-galactopyranosylnitrat (II), 5596 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylnitrat (III) und 896 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-talapyranosylni1arat (IV).

Die niedrige Ausbeute an der Verbindung IV zeigt an, daß die Azidonitrierungsreaktion hoch stereoselektiv an der C-2-Stellung verläuft.

Das Verreiben von 21 g des sirupartigen Produkts mit kaltem Äthyläther gibt 8,3 g der Verbindungen II und IV, die gemeinsam kristallisieren. Die Mutterlauge enthält fast reines ß-D-Nitrat, III (12,6 g).

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Die Verbindung III konnte nicht kristallisiert werden. Das Infrarotspektrum (IR) (Film) der Verbindung III zeigt Absorptionen bei 2120 cm"¹ (N₃) und I65O cm"¹ (ONO₂). Ihr Fartial-PMR-Spektrum in CDCl₅ ist (ppm) 5,71 (d, 1, J_{1 2}, 9,0 Hz, H-1), 5,42 (q, 1H, H-4), 5,08 (q, 1, J_{3 4}, 3,2 Hz, H-3), 3,8? (q, 1, J_2>3 10,8 Hz, H-2), 2,18, 2,10^ 2,03 (3s, 9, 3 OAC).

Die von Taloazid (IV) freie Verbindung II wird durch Anomerisierung des ß-D-Nitrats, III, mit Nitration erhalten. 9,50 g (25,5 mMol) einer Lösung von sirupartigem ß-D-Nitrat, III, und 3,50g (50,1 mMol) wasserfreiem Lithiumnitrat in 4:1 (V/V)-Acetonitril/Dimethylfonaamid (35 ml) werden 42 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wird die Lösung mit 250 ml Dichloraethan verdünnt und mit eiskaltem Wasser (3 x 125 ml) gewaschen. Die organische Lösung wird getrocknet und eingedampft und man erhält 9,0 g Sirup. Das PMR-Spektrum dieses Sirups zeigt, daß er ein Gemisch aus 63$S α- und 37& ß-Di-Nitraten, II und III, ist. Die Kristallisation aus Äthyläther ergibt 6,2 g a-D-Mtrat, II, Fp 103 bis 104°C, [a]|⁵ + 125° (c 1, Chloroform)«, Das Infrarotspektrum (Film) der Verbindung II zeigt Absorptionen bei 2120 cm"¹ (H₃) und 1550 cm"¹ (ONO₂). Sein Partial-PMR-Spektrum in CDCl₃ ist (ppm) 6,34 (d, 1, J₁

4.1 Hz, H-3), 4,12 (q, 1, J₂^₃ 11,5 Hz, H-2), 2,18, 2,09,

2.02 (3s, 3 OAC).

Ein Nebenprodukt (-^ 1095) der Reaktion konnte entweder durch Chromatographie an Silicagel des Reaktionsgessisches oder in einigen Fällen durch Verdampfen der drei wäßrigen Wasc&Lösungen, die während der Aufarbeitung des Reaktionsproduktes, wie oben beschrieben, erhalten wurden, hergestellt werden. Die Verbindung kristallisiert leicht aus den Waschfässern durch Verdampfen oder beim Verreiben mit Äthyläther und es konnte gezeigt werden, daß sie N-(3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxja-D-galactopyranosyl)-acetamid (V) ist. Fp 142 bis 143,5°C,

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[α]^ + 68,0° (c 1, Chloroform). Sein Partial-PMR-Spektrum ist in DMSO-db (ppm) 9,83, (d, 1, 2_{m Λ} 9,5 Hz, KH), 5,78 (q,

1, J_1f2 5,5 Hz, H-1), 5,48 .(1, q, J_£ ^ 11,3 Hz, H-3), 5,22 (.1, d, J₃[₄ 3,5 Hz, H-4), 4,22 (q, 1 H-2}.

Beispiel 2

Die Umsetzung von 3.4.6-Tri-O-acetyl-D-galactal (I) mit CerClV ammonfowwitrat in Anwesenheit von Natriumazid

21,1 g (0,007 M) destilliertes 2,3,4-Tri-O-acetyl-D-galactal (I) (Kp 147 bis 155⁰C bei 0,1 mm) werden in 420 ml trockenem Acetonitril gelöst und unter Stickstoffatmosphäre in der Dunkelheit auf -25°C gekühlt. Ein Gemisch aus 100,2 g (0,182 Mol) festem :Cer(IV)-ammoniumnitrat und 6,043 g (0,092 Mol) festem Natriumazid wird auf einmal zugegeben und die entstehende pension wird 15 h bei -25°C gerührt. Zu diesem Zeitpunkt werden 400 ml kalter Äthyläther zugegeben und das entstehende Gemisch wird zur Entfernung von Feststoffen filtriert. Der Filterkuchen wird mit Diäthyläther (2 χ 100 ml) gewaschen und die vereinigten Filtrate werden in 500 ml Eiswasser gegossen. Die organische Lösung wird abgetrennt und mit eiskaltem Wasser (3 χ 500 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Man erhält 21,0 g Sirup, dies entspricht einer Ausbeute von 73% der Rohnitrate (II und III). Die Prüfung mit DUnnschichtchromatographie an Silicagel, entwickelt mit 6:4(V/V)-Hexan/Ä*thylaceta-ti zeigt kein restliches Ausgangsmaterial. Die PMR-Prüfung zeigt, daß das Produkt im wesentlichen identisch ist wie dasjenige sirupartige Produkt; das im Beispiel 1 erhalten würde.

Wegen der Reaktivität der Glycosylnitrate allgemein muß man beim handhaben dieser Verbindungen vorsichtig sein, so daß keins unerwünschte Zersetzung oder solvolytische Reaktionen stattfinden. Das erhaltene Gemisch aus α- und ß-Nitraten kann

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manchmal, wie es im Beispiel 1 erläutert wird, variieren, da die Verbindungen sich leicht ineinander in Anwesenheit von Nitrationen umwandeln. Das Gemisch ist nützlich für ^edes der reinen Produkte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie im folgenden näher erläutert wird. Im allgemeinen unternimmt man keine Mihen, um die Verbindungen II und III zu trennen. Es wurde jedoch gefunden, daß das oc-Anomer (III) leicht in kristallinem Zustand erhalten wird, und wenn diese Verbindung gewünscht wird, kann die Ausbeute durch Anomerisierung des ß-Anomeren mit der thermodynamisch weniger stabilen Verbindung verbessert werden.

Die Azidonitrierungsreaktion, wie im Beispiel 1 erläutert wird, ist nicht auf das acetylierte Galactal I beschränkt, sondern findet allgemein nützliche Anwendung mit geeigneten O-ge-■schützten Glycalen. Dies wird im Beispiel .-3 erläutert, wo die ausgewählten Reaktionsteilnehmer Tri-O-acetyl-D-glucal (VI), ein anderes Hexal ist, und es wird weiter durch die Verwendung von Hexa-O-acetyl-D-lactal (XIII) mit einer Disaccharidstruktur im Beispiel :4 und von 3,4-Di-O-acetyl-D-xylal (XVI) als Pental im Beispiel 5 erläutert.

Im Beispiel 3 wird weiterhin erläutert, daß die Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, variiert werden kann, obgleich die Produktreinheit bei Reaktionstemperaturen über O⁰C abnimmt. Die Verwendung von Kaliumäzid ist ebenfalls erläutert.

Beispiel 3

Die Umsetzung von 3.4.6-Tri-O-acetvl-D-glucal (VI) mit CeHlV)-ammoniumnitrat in Anwesenheit von Kaliumäzid

Die Behandlung von 5_f86 g (21,5 mMol) 2,3,4-Tri-O-acetyl-D-

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glucal (VI) mit 27,8 g (50,7 mMol) Cer(IV>-anmionlxaiDnitrat und 2,39 g (25,7 niMol) Kaliumazid bei 25°C gemäß dem Beispiel 1 f ür Tri-O-acetyl-D-galactal beschriebenen Verfahren ergibt ein Gemisch aus 2-Azidonitraten in 60^iger Ausbeute. Das Gemisch aus Azidonitratprodukten enthält- 42,5% 3,4,6-Tri-0-acetyl~2-azido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosylnitrat (VIII), 24% 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-a2ido-2-deoxy-a-D-glucopyranosylnitrat (VII) und 3356 3,4, ö-Tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-a-D-maimopyranosylnitrat (IX) · Diese Zusammensetzung basiert auf den relativen Intensitäten der anomeren IMR-Signale, die den Verbindungen VII, IX und VIII zuzuordnen sind, die bei 6,4 ppm, J=4,Ö Hz, 6,23 ppm, J=1,8Hz und 5,72 ppm, J=8,8 Hz betragen. . .

Beispiel 4 ...... .... . - - . -

Die umsetzung von Hexa-O-acetyl-D-lactal(XIII) mit Cer(IV)-amTnoniumnitrat in .anwesenheit von Natriumazid

Die Azidonitrierung von Hexa-Ö-acetyl-D-lactal (XIII) dient als neuer Weg für das wichtige Disaccharid, das als Lactosamin bekannt ist und das ein Baustein von Oligosaccharide«, ist, die die Kernstruktur von Oligosacchariden, die in Menschenmilch auf treten, und die antigenen Strukturen von Substanzen der menschlichen Blutgruppe bilden.

Die Behandlung von 1,0 g (1,79 mMol) Hexa-O-acetyl-D-lactal (XIII) mit 2,45 g (4,48 mMol) Cer(IV)-ammoniumnitrat und 0,174g (2,685 mliol) Hatriumazid nach dem Verfahren von Beispiel 2 ergibt 0,89 g eines Gemisches der 2-Azidonitrate in einer Ausbeute über 75S&. Eine H5R-Prüfung zeigt Signale bei 6,30 ppm (d, 4,25 Hz) und 5,56 ppm (d, 8,5 Hz), die den anomeren Protonen der 2-Azidonitrate XIV und XV zuzuordnen sind. Das Verreiben dieses Sirups mit Äthyläther, ergibt 0,5 g kristallines 3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopy-

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ranosyl)-2-azido-2-deoxyl-ß-D-glucopyranosylnitrat (XV) in 42#iger Ausbeute, Pp 69 bis 70⁰C, [a]Jp + 15° (d, Chloroform). Das. Infrarotspektrum (Nujolflüssigkeit) der Verbindung XV zeigt Absorptionen bei 2120 cm"¹ (N,) und 1650 cm"¹ (ONO₂). Ihr Partial-PMR in CDCl, beträgt (ppm) 5,56 (d, 1, J₁ 8,5 Hz, H-1), 3,56 (q, 1, J^₃ 8,25 Hz, H-2).

Die Säulenchromatographie der Mutterlauge nach der Entfernung der kristallinen Verbindung XV an Silicagel unter Entwicklung mit Hexan/Äthylacetat/Äthanol, (V/V) 10:10:1 ergibt zusätzliche Mengen an Verbindung XV (0,05 g) und 3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4, ö-tetra-O-acetyl-ß-D-galuctopyranosyl) ~2-azido-2-deoxya-D-glucopyranosylnitrat (XIV) (0,31 g), die aus Äthyläther kristallisiert, Fp 138 bis 14O°C [a]^⁵ + 69,7° (c 1, Chloroform). Das Infrarotspektrum (Nujolflüssigkeit) der Verbindung XTV zeigt Absorptionen bei 2120 cm (N,) und I65O cm"¹ (ONO₂). Ihr Partial-PMR-Spektrum in CDCl, ist (ppm) 6,30 (d, 1, J^ 4,25 Hz, H-1), 3,72 (q, 1, J_{£ 3} 10,5 Hz, H-2).

Beispiel 5

Die Umsetzung von 3,4-Di-O-acetyl-D-xylal (XVI) mit Cer(IV)-ammoniumnitrat in Anwesenheit von Natriumazid

Im Beispiel 5 wird erläutert, daß die Anmeldung das Azidonitrierungsverfahrenauf Pentopyranoglycale ausdehnen kann.

Die Behandlung von 0,472 g (2,36 mMol) Di-O-acetyl-D-xylal (XVI) (29) mit 4,39 g (8,0 sMol) Cer(lV)-ammoniumnitrat und 0,260 g (4,0 mMol) Natriuiaazid gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ergibt ein Gemisch aus 2-Azidonitraten in 88jiiger Ausbeute. PMR-Prüfung des Produktsgemisches zeigt Signale bei 5,70 ppm (d, 7,5 Hz), 68^, 6,23 ppm (d, 4,0 Hz) = 16$5 und 6,56 ppm (d, 4,5 Hz) = 16%. Das Hauptprodukt ist

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3,4-Di-0-acetyl-2-a2ido-2-deoxy-ß-D-3cylop3rPanosylnitrat XVlI, wie durch Doppelbestrahlungsversuche nachgewiesen werden konnte, die die Anwesenheit eines Quartetts "bei 3,70 ppm mit J« ■* a 8,75 Hz und J_{1 2} « 7_t5 Hz zeigen, daß das H-2 der Verbindung XVII zugeordnet wurde. Die Produkte, die die restlichen 3296 des Gemisches an 2-Azido-2-deoxynitraten enthalten, müssen die α- und O-D-Lyxoanomeren XVIII sein, da die Anomerisierung des Gemisches aus Nitraten nach dem.im Beispiel 1 für die Verbindung III beschriebenen Verfahren das Auftreten einee neuen Signals im PMR-Spektrum dieses Produktgemisches bei 6,31 ppm ergibt (d, J* ο 3_t65 Hz). Dieses Signal wird dem anomeren Proton von Si^-Di-O-acetyl^-azido^-deoxy-a-D-xylopyranosylnitrat (XVIX) zugeordnet.

Beispiel 6

Die Reaktion von 3«4«6-Tri-0-benzoyl-D-galactal (X) mit Cer(IV)· ammoniumnitrat in Anwesenheit von Natriumazid

Die Azidonitrierungsreaktion ist nicht auf acetylierte Glycale beschränkt, sondern kann mit jedem geeigneten geschützten GIycal durchgeführt werden. Beispielsweise können die Schutzgruppen Propipnyl oder Benzoyl sein. Dies wird in diesem Beispiel erläutert, worin 3,4,6-Tri-O-benzoyl-D-galactal (X) als Ausgangsmaterial verwendet wird.

Die Behandlung von 7,18 g (12,2 mMol) 3,4,6-Tri-O-benzoyl-D-galactal (X) mit 20,2 g (36,6 mMol) Cer(IV)-ammoniumnitrat und 1,18 g (18,1 mMol) Natriumazid gemäß dem im Beispiel 1 für Tri-O-acetyl-D-galactal.beschriebenen Verfahren ergibt ein Gemisch aus 7,5 g 2-Azido-2-deoxynitraten in 75?&ger Ausbeute. Die Prüfung des PMR-Spektrums des Rohprodukts in CDCl^ zeigt, daß es 30§£ 2-Azido-3,4,6-tri-0-benzoyl-2-deoxy-cc-D-galactopyranosylnitrat (XI) und 45?S 2-Azido-3,4,6-tri-0-benzoyl-2-

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deoxy-ß-D-galactopyranosylnitrat (XII) enthält. Das anomere Signal des a-D-Nitrats wird bei 6,67 ppm mit J^ ₂ = 4,6 Hz beobachtet.. Obgleich das anomere Signal des ß-D-Anomeren maskiert ist, wird das H-2-Signal bei 4,20 ppm als großes Triplett mit J₁ 2=9i5 Hz beobachtet.

Beispiel 7

Umsetzung von 3«4_<6-Tri'-0-acetyl-D-galactal-mit Natriumazid und Cer(ry)-ammoniumnitrat in Äthylacetat

Obgleich Acetonitril das bevorzugte Lösungsmittel ist, ist die Azidonitrierungsreaktion nicht auf die Auswahl dieses Lösungsmittels beschränkt. Dies wird in diesem Beispiel erläutert, wo Äthylacetat als Lösungsmittel verwendet wird.

Die Behandlung von 0,30 g (1,09 mMol) Tri-O-acetyl-D-galactal (I) mit 1,41 g (2,57 mMol) Cer(IV)-ammoniumnitrat und 0,084 g -(1,29 mMol) Natriumazid in 5 ml Äthylacetat gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ergibt ein Gemisch aus 2-Azidonitraten mit einer Ausbeute von über 60$. Die PMR-Prüfung des Produkts zeigt, daß die 2-Azidonitratzusammensetzung ahn·' lieh ist wie die im Beispiel 1 beschriebene. Eine Prüfung der Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Entwicklung mit 6:4(V/V)-Hexan/Äthylacetat zeigt jedoch, daß Nebenreaktionen bei diesem Lösungsmittel stattfinden.

Umwandlung der Azidonitrate in Aminozucker

Die acylierten 2-Azido-2-deoxynitrate können in die entsprechenden 2-Amino-2-deoxyzucker durch Hydrolyse der Nitrat- und Acylgruppen und Reduktion der Azidogruppe nach an sich bekannten Verfahren überführt werden. Die Hydrolyse kann der Reduktion vorhergehen oder vice versa. Die Aminozucker_f

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insbesondere Galactosamin und Lactosamin, und ihre N-acetylierten Derivate sind wichtige Baueinheiten für die antigenen Determinanten der Blutgruppensubstanz. Die N-acetylierten Derivate werden aus den Aminozuckern nach an sich bekannten Verfahren hergestellt. Die Aminozucker können ebenfalls zur Herstellung von 2-Acetamido-2-deoxyglycosen verwendet werden.

Die Reduktion der Azidogruppen zu Aminogruppen ist gut bekannt und kann in im wesentlichen quantitativer Ausbeute unter einer großen Reihe von .Bedingungen einschließlich der Reduktion mit Metallen, wie Natrium oder Zink, der Reduktion durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Katalysatoren, wie Nickel, Platin oder Palladium, der Reduktion unter Verwendung von Hydriden, wie Natriumborhydrid, Boran und Lithiumaluminiuiahydrid, der elektrolytischen Reduktion und der Reduktion mit Schwefelwasserstoff bei alkalischen Bedingungen, durchgeführt werden.

Allgemein gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung eines acylierten 2-Azido-2-deoxy-glycosylnitrats in eil» 2-Amino-2-deoxyglycose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Azidogruppe zu einer Aminogruppe reduziert und die Acyl- und Nitratgruppen hydrolysiert.

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Die Reduktion der Azidgruppe kann durchgeführt werden, indem man das Nitrat mit einer wässrigen Säure über feinverteiltem, Zinkmetall umsetzt. Die wässrige Säure kann Essigsäure sein. Alternativ kann die Reduktion der Azidgruppe durch Hydrierung des Nitrats über einen Katalysator, wie über Palladium, Platin oder Nickel,erfolgen.

Bei einem weiteren Verfahren kann .die Azidogruppe des acylierten 2-Azido-2-deoxyglycosylnitrats zu einem Amin reduziert werden und das Reduktionsprodukt kann mit einer wässrigen Mineralsäure, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, unter Bildung des Säuresalzes der 2-Amino-2-deoxyglycose behandelt werden.

Weiterhin kann die Nitratgruppe des acylierten 2-Azido-2-deoxyglycosylnitrats durch eine Acyl-, beispielsweise Acetyl-, Gruppe ersetzt werden und in irgendeiner Reihenfolge kann die Azidogruppe zu dem Amin reduziert und mit einer wässrigen Mineralsäure, beispielsweise Chlorwasserstoff säure, unter Bildung des Salzes der 2-Amino-2-deoxyglycose hydrolysiert werden.

Ein spezifisches Beispiel dieses Verfahrens ist eins, bei dem: der Ersatz der Nitratgruppe durch ein Acetat durch Auflösen eines anomeren Gemisches aus 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitrat in einer Lösung aus Natriumacetat in Essigsäure und Erhitzen der Lösung erfolgt und die Reduktion der Azidogruppe zu dem Amin durch Zugabe von Zinkstaub und Essigsäure unter Rühren unter Bildung des anomeren Gemisches aus 2-Acetamido-1^»^-tetra-O-acetyl-D-galactopyranose erfolgt. Das Produkt kann durch Lösungsmittelextraktion nach der Zugabe von Wasser oder durch Verdampfen im Vakuum isoliert werden, und das Produkt kann mit wässriger Chlorwasserstoffsäure unter Bildung von D-Galactosaminhydrochlorid behandelt werden.

Ein solches Verfahren kann ebenfalls mit einem anomeren Gemisch aus 3,6-Di-O-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopy-

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ranosyl) ^-azido^-deoxy-D-glucopyranosylnitrat durchgeführt werden. Das letztere anomere Gemisch kann alternativ mit Natriumacetat in Essigsäure durch Ersatz des Nitrats, Reduktion des Azids, Acetylierung des Produkts und dann Abspaltung der Äcetylgruppe an dem Sauerstoffatom unter Bildung von N-Acetyllactosamin hergestellt werden.

Bei einem weiteren Verfahren, das den Ersatz der Nitratgruppe, aber ohne Reduktionsstufe erläutert, wird ein anomeres Gemisch aus 3»^»6-TTi-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitrat mit Natriumacetat in Essigsäure unter Bildung von 1,3»4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylacetaten behandelt, das Produkt wird isoliert und in wässriger Säure unter Bildung von 2-Azido-2-deoxy-D-galactose hydrolysiert. Die 2-Azido-2-deoxy-D-galactose kann dann in Anwesenheit von einem Mol Äquivalent einer Säure unter Bildung des entsprechenden Säuresalzes von D-Galactosamin reduziert werden. Bei der N-Acetylierung des D-Galactosaminprodukts wird N-Acetyl-D-galaetosamin gebildet»

Die ^Nitratgruppe des acylierten 2-Azido-2-deoxynitrats kann durch eine Acylgruppe nach an sich bekannten Verfahren vor der Hydrolyse oder Reduktion ersetzt werden. Beispielsweise kann die Nitratverbindung mit Natriumacetat in Essigsäure, wie in den Beispielen 14 bis 16 erläutert, behandelt werden.

Beispiel 8

Herstellung der anomerBn 1,3t4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D^galactopvranosen (XXVII) und (XXVIII).

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Eine Lösung von 0,15 g (O,40 mMol) reinem 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylnitrat (III) und 0,65 g (0,80 mMol) Natriumacetat in 2 ml Eisessig wurde auf 100⁰C 15 min erhitzt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt die Prüfung der DUnnschichtchromatographie an Silicagel unter Entwicklung mit 6:4(V/V)-Hexan/Äthylacetat, da ein homogener Fleck mit einem niedrigeren R^-Wert als die Verbindung III vorhanden ist. Die Lösung wird mit 5 ml Dichlormethan verdünnt und mit 5 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Das Verdampfen des Lösungsmittels nach dem Trocknen über Natriumsulfat und der Filtration ergibt 0,134 g eines Sirups (90#ige Ausbeute), der spontan beim Verreiben mit Sthyläther kristallisiert.

Umkristallisation aus Äthyläther oder kaltem Äthanol liefert eine analytisch reine Probe von 1,3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-oc-D-galactopyranose (XXVII), Fp 114 bis 115°C, [a]j-⁵ + 91,70 (c 1,05, Chloroform), IR (Film 2120 cm (-N₃).

Das PMR-Spektrum der Verbindung XXVII in CDCl₃ zeigt teilweise (ppm) 6,38 (d, 1, J_{1 2} 3,7 Hz, H-1), 5,50 (q, 1, J₃ ^ 3 Hz, H-4), 5,36 (q, 1, J_2>3 7 Hz, H-3), 3,97 (q, 1, H-2).

Eine Lösung von 1,01 g (2,70 mMol) rohem 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylnitrat und 0,43 g (5,20 mMol) Natriumacetat in 10 ml Eisessig wird auf 100⁰C während 20 min erhitzt. Die Reaktionslösung wird dann mit 50 ml Dichlormethan verdünnt und mit 250 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Das Verdampfen des Lösungsmittels nach dem Trocknen über Natriumsulfat und Filtration ergibt 1,0 g Sirup. Die Prüfung dieses Sirups durch PMR-Spektroskopie zeigt, daß er 30Ji Verbindung XXVII und 60Js 1,3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxyß-D-galactopyranose XXVIII enthält. Das anomere Proton des ß-Anomeren (XXVIII) wird dem Doublett mit· J » 8,5 Hz, bei "5,61 ppm zugeordnet.

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Die Verbindungen XXVII und XXVIII werden.in einem fast 3:1-Gemisch durch Acetolyse in Essigsäure, die Natriumacetat enthält, des Gemisches der Verbindungen II und III erhalten, wobei das Gemisch gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt wird.

Beispiel 9

Herstellung von 1«3.4»6-Tetra-0-acetyl-2~azido-2-deo3cy-a-D-gluco- und -manopyranosen (XXIX und XXX).

Ein Gemisch aus 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-mannopyranoeylnitrat (IX) und den α- und ß-Anomeren des 3,4,6-Tri-O-acetyl^-azido-^-deoxy-D-glucopyranosylnitrat (VII und VIII), erhalten gemäß Beispiel 3, wird mit einer Lösung aus 0,350 g (4,26 mMol) Natriumacetat in 10 ml Essigsäure bei 100⁰C während 1 h behandelt. Die Aufarbeitung des Produktgemischs gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 ergibt 0,70 g Schaum. Die Säulenchromatographie (30 χ 2 cm) an Silicagel (70 g) unter Eluierung mit Hexan/Äthylacetat/Äthanol, (V/V) 10:10:1, ermöglicht die Trennung von Gluco-(XXIX) und Mano-(XXX)-2-azido-2-deoxyacetaten, 0,340 g bzw. 0,310 g.

0,211 g (21SS) reines i^^.o

α-D-glucopyranose (XXIX) werden durch Umkristallisation aus Äthyläther erhalten, Fp 117 bis 113°C, [α]*⁵ + 123° (c 0,9, Chloroform). Das Teil-FMR-Spektrum der Verbindung XXIX in CDCl₃ ergibt (ppm) 6,29 (d, 1, J₁^₂ 3,5 Hz, H-1), 5,45 (t, 1, J_{3 k} 9,0 Hz, H-3), 5,08 (t, 1,^fJ_4>5 9,0 Hz, H-4), 3,65 (q,

1 J' ⁹° ^ ^H2) 0,220 g (229S) reines i^^ö

a-D-mannopyranose (XXX) werden durch umkristallisation aus

Äthyläther erhalten, Fp 131 bis 132^QC, [a]|⁵ + 73,6 (c, 1,02,

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Chloroform). Das Partial-PMR-Spektrum der Verbindung XXX in CDCl₃ ergibt (ppm) 6,09 (d, 1, J_{1 2} 1,8, H-1).

Beispiel 10

Herstellung der anomeren Formen von 1.3»6-Tri-0-acetyl-4-0-(2.3*4,6-tetra-O-acetyl-O-D-galactopyranosyl)~2~azido-2-deoxy-D-glucopyranose (XXXI und XXXII)

Die Behandlung von 3»50'g des anomeren Gemisches aus 3,6-Di-0-acetyl-d-O-(2,3,4,ö-tetra-O-acetyl-ß-galactopyranosyl) -2-a2ido-2-deoxy-D-glucopyranosylnitrat (XIV und XV), das etwa 7095 des ß-Anomeren (XV) enthält, mit 2,16 g (26,3 mMol) Natriumacetat in Essigsäure gemäß dem im Beispiel 15 beschriebenen Verfahren ergibt 2,43 g kristallines 1,3,6-Tri-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-O-D-galactopyranosyl) ^-azido^-deoxya-D-glucopyranose (XXXI) in 73$iger Ausbeute. Die Umkristallisation aus Äthylacetat/Pentan ergibt das reine cc-Anomere (XXXI), Fp 77 bis 7B°C, Ca]Jp + 55,4° (c 1, Chloroform). Das Partial-PMR-Spektrum der Verbindung XXXI in CDCl₃ ist (ppm) 6,22 (d, 1, J_1>2 3,65, H-1), 3,46 (q, 1, J_2j3 10,5, H-2).

Die ähnliche Behandlung des reinen α-Nitrats XIV auf die oben beschriebene Weise ergibt kristalline 1,3,6-Tri-0-acetyl-4-0-(2,3,4,ö-tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranose (XXXII) in guter Ausbeute (70%).

Ausgezeichnete Ausbeuten an Verbindung XXXII werden ebenfalls durch Behandlung von 0,264 g (O,414 mMol) 3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-cx-D-glucopyranosylchlorid (XXV) oder des entsprechenden a-Bromids" XXVI mit 0,137 g (1,656 inMol) Silberacetat in 5 ml Essigsäure bei Umgebungstemperatur während 1 h erhalten. Zu diesem Zeitpunkt wird die Reaktionslösung mit 20 ml Dichlor-

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methan verdünnt, filtriert und 2-mal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird getrocknet und eingedampft. Man erhält 0,250 g eines weißen Schaums. Die Kristallisation dieses Materials aus heißem Methanol ergibt 1,3,6-Tri-O-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-ß-D-gluoopyranose (XXXII). Das Partial-PMR-Spektrum der Verbindung XXXII in CDCl₃ ist (ppm) 5,51 (d, 1, J_{1 2} 8,75 Hz, H-1), 3,57 (q, 1, J₂^₃ 10,0 Hz, H-2).

Beispiel 11

Herstellung von 2-Acetamido-1,3«4_t6-tetra-0-acetyl-2-deoxy-atrad -ß-D-galactopyranosen (XXXlV und XXXV)

Dieses Beispiel erläutert ein wirksames Verfahren durch Reduktion mit Zink für die Umwandlung eines Gemisches der anomeren 1,3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactosen, XXVII und XXVIII, die gemäß Beispiel 8 erhalten wurden, in ein anomeres Gemisch aus 1,3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-acetamido-2-deoxygalactopyranosen (XXIV und XXV), und daß dieses Gemisch für die Herstellung von D-Galactosaminhydrochlorid (XXXVII) nützlich ist. - - ··

200 ml Eiseseig und 8,2 g (0,1 Mol) Natriumacetat werden zu 32 g (0,03 Mol) des cc- und ß-anomeren Gemisches aus 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylnitraten (II und III), hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 2, gegeben. Das Gemisch wird 1 h bei 100⁰C gerührt. 12,8 g (0,2 Mol) Zinkmetall werden dann zu der auf 6O⁰C gekühlten Lösung gegeben und dann wird 15 min gerührt. 17 ml Essigsäureanhydrid werden zugegeben und da3 Gemisch wird auf einem Dampfbad (100°C) während 1 h erhitzt und filtriert. Die Lösung wird in 100 ml Wasser gegossen und 1 h gerührt. Dann werden 300 ml Wasser zugegeben und das Gemisch wird dreimal mit 100 ml Dichlormethan

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extrahiert. Die Extrakte vrerden vereinigt, durch ein mit Dichlormethan befeuchtetes Papier filtriert und zu einem dicken Sirup eingedampft, der zu einer kristallinen Masse beim Verreiben mit Äther gehärtet wird. Das PMR-Spektrum dieses Produkts steht in Übereinstimmung mit dem erwarteten für ein 4:1-Gemisch der α- und ß-Anomeren von 2-Acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-D-galactopyranose.

Die Umkristallisation aus Äther ergibt das reine a-Anomere (XXXIV) in 55&Lger Ausbeute, Fp 177 bis 178°C, [a]jp + 99° (c 1, Chloroform).

Die Mutterlaugen werden vereinigt und man erhält 14 g eines sirupartigen Produktes, das fast ein 1:1-anomeres Gemisch der Tetraacetate XXXIV und XXXV ist. Das Gemisch wird in 150 ml 4N-wäßriger Chlorwasserstoffsäure gelöst und die Lösung wird 7 h auf 100⁰C erhitzt. Die Lösung wird mit Aktivkohle entfärbt und· mit 500 ml n-Butanol verdünnt, bevor sie zu einem braunen Sirup (10 g) eingedampft wird. Das Produkt wird durch Vergleich der Papierchromatographiemobilität und dem PMR-Spektrum in D₂O mit einer authentischen Probe als D-Galactosaminhydro.chlorid XXXVII identifiziert. Reines D-Galactosaminhydrochlorid kann leicht durch Kristallisation unter Verwendung von Äthanol/Wasser/Aceton erhalten werden, wie es in der Literatur für die Reinigung dieser Verbindung beschrieben wird.

2-Acetamido-2-deoxy-D-galactose (XXXVl) kann durch einfache N-Acetyllerung des D-Galactosaminhydrochlorids nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden und es stellt ebenfalls ein Zwischenprodukt bei der Säurehydrölyse der Verbindungen XXXIV und XXXV dar.

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Beispiel 12

•ill·

Herstellung von 2-Acetamido-1.3.4,6-tetra-Q-acetyl-2-deo3cytt-D-galactopyranose (XXXIV). .

Die Hydrierung von 0,20 g (0,536 mMol) 1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-;galactopyranose (XXVII), gelöst in 3 ml Äthanol, das 0,25 ml Essigsäureanhydrid enthält, mit 0,80 g 5?6igem Palladium auf Holzkohle ist in 1 h bei Zimmertemperatur unter .einem Druck von 1 at Wasserstoff beendigt. Die Filtration durch Diatomeenerde und die Verdampfung des Lösungsmittels ergeben 0,206 g eines weißen Schaums. Der Prüfung durch Schichtchromatographie an Silicagel unter Entwicklung mit 5:5s1(V/V)-Benzol/Äthylacetat/Äthanol zeigt die Anwesenheit von zwei Verbindungen, die durch Silicagel-Säulenchromatographie "(20 χ 1 cm) unter Elution mit dem gleichen Lösungsmittel leicht getrennt werden können. Man erhält 0,10 g 2-Acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetyl-2-deoxy-a-D-galactopyranose-(XXXIV) (50%ige Ausbeute), das aus Äthyläther uinkristallisiert wird, Pp 177 bis 178°C, [a]Jp + 99° (c 1, Chlarofora).

Die FMR-Werte für die Verbindung XXXIV sind in guter Übereinstimmung mit denjenigen, wie sie zuvor beschrieben wurden.

Die zweite Verbindung ist 2-(N-Acetyl)-apetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-a-D-galactopyranose (0,068 g), was eine Prüfung mit PMR-Spektrum und ein Vergleich mit den Werten mit den zuvor aufgeführten zeigt.

Beispiel 13

Reduktion von 1,3_<4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranose (XXVH) mit Schwefelvrasserstoff in Anwesenheit von Triäthylamin

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- Xi -

Eine Lösung von 1,0 g (7,68 mMol) des anomeren Gemisches aus 2-Azido-2-deoxynitraten II und III wird in 5 ml Essigsäure, die 0,10 g 5%iges Palladium auf Holzkohle enthält, bei 1 at und Zimmertemperatur während 5 h hydriert. Nach Entfernung des Katalysators durch Filtration und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 0,85 g 3,4,6-Tri-O-acetyl-D-galactosamin (XXXVIII) als Schaum. Die Behandlung dieses Schaums nut 10 ml 2N-wäßriger Chlorwasserstoffsäure bei Umgebungstemperatur während 2 bis 3 h und anschließende Verdünnung mit 5 ml n-Buta- nol und Verdampfen ergibt 0,50 g D-Galactosaminhydrochlorid XXXVII, das aus Butanol/Äthanol/Wasser umkristallisiert wird.

Beispiel 15

Herstellung von D-Galactosaminhydrochlorid (XXXVII) aus den cc- und ß-1,3,4«6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galacto-pyranosen (XXVII) und (XXVIIl).

D-Galactosaminhydrochlorid kann ebenfalls in hohen Ausbeuten aus einem anomeren Gemisch aus den 2-Azido-2-deoxyacetaten XXVTI und XVIII durch Säurehydrolyse und anschließende Reduktion hergestellt werden.. Dieses Verfahren wir.d wie folgt erläutert.

Ein Gemisch der anomeren Verbindungen XXVII und XXVIII (1,0 g, 2,68 mMol) wird in 10 ml 2N-Chlorwasserstoffsäure gelöst und 2 bis 3 h bei Zimmertemperatur gerührt. Verdünnen mit 5 ml n-Butanol und Verdampfen des Lösungsmittels ergeben 0,510 g eines v/eißen Feststoffs. Die Umkristallisation dieses Feststoffs aus Äthanol durch Verdampfen ergibt 0,40 g (72?sige Ausbeute) reines 2-Azido-2-deoxy-D-galactopyranosa XL, Fp 173 bis 175⁰C (Zersetzung), Ca]²J⁵ + 53,7° ■* 76,9° (c 0,93, Wasser). Die Reduktion der Verbindung XL unter sauren Bedingungen ergibt D-Galactosaminhydro.chlorid XXXVII.

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.50-

Dieses Beispiel "beschreibt ein alternatives Verfahren für die Reduktion der Azidogruppe zu Amin. Schwefelwasserstoff wird durch eine Lösung von 0,20 g (0,53 mMol) Verbindung XXVII und 0,135 g (1,34 mMol) Triäthylamin, gelöst in 5 ml Dichlormethan, bei O⁰C geleitet. Nach 20 min zeigt die Prüfung des Reaktionsgemisches durch Dünnschichtchromatographie, entwickelt mit 10:10:1 (V/V)-Hexan/Äthylacetat/Äthanol, daß kein restliches Ausgangsmaterial -mehr vorhanden ist und daß ein homogener Fleck mit niedrigem R_f-Wert auftritt. Beim Stehen bildet sich ein gelber Niederschlag. Dieses Suspension wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird in 2 ml Pyridin und 0,5 ml Essigsäureanhydrid gelöst. Nach 15 h wird die Reaktionslösung mit 20 ml Dichlormethan und 10 ml Wasser verdünnt. Die organische Schicht wird abgetrennt, getrocknet und eingedampft. Man erhält 0,17 g eines braunen Sirups, der die gleiche Mobilität an Silicagel zeigt wie 2-Acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetyl-2-deoxy-a-D-galactopyranose (XXXIV). Das K3R-Spektrum dieses Sirups in GDCX₅ ist identisch mit dem der Verbindung XXXIV.

Beispiel 14

Herstellung von D-Galactosaminhydrochlorid (XXVII) aus den α- und ß-5_T4,6-!Eri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitraten II und III

D-Galactosaminhydrochlorid (XXXVII) kann direkt aus den anomeren Gemisch der 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deaxygalactöpyranosylnitraten II und III durch Hydrierung unter Bildung von 3,4,6-Sri-O-acetyl-D-galactosamin (XXXVIII), gefolgt von der sauren Hydrolyse, erhalten werden, wie es in diesem Beispiel erläutert wird_e

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Die Substitutions- bzw. Ersatzreaktion, die in den Beispielen 8 bis 13 erläutert wird, umfaßt die Behandlung der neuen 2-Azido-2-deoxyglycosylnitrate mit einem Halidsalz unter Bewirkung der Verdrängung bzw. des Ersatzes der Nitratgruppe durch Substitution durch das Halid. Diese Reaktion Ist gut bekannt und führt unter Verwendung der neuen Ausgangsmaterialien zu der Bildung von neuen 2-Azido-2-deoxyglycosylhaliden.

Ähnlich wie bei den Nitraten sind die cc-Glycosylhalide stabiler als ihre entsprechenden ß-Anomeren. Dies folgt aus den Beispielen 17 bis 21, wo das a-Anomere das überwiegende Produkt ist. Die ß-Glycosylhalide werden zu der stabileren α-Form in Anwesenheit einer großen Konzentration an Halidionen anomerisiert. Die Anomerisierungsrate der Halide nimmt in der Reihenfolge ab:

Jodid > Bromid > Chlorid

Wie es im Beispiel 22 erläutert wird, kann das ß-Anomere in hoher Ausbeute bei Bedingungen, bei denen eine kinetische Kontrolle stattfindet, gebildet werden. Die 2-Azido-2-deoxyglycosylhalide sind nützlich für die Herstellung von 2-Amino-2-deoxyglycosiden. Die a-Glycoside sind wichtige Baueinheiten in biologischen Systemen, sie können in guter Ausbeute über den Weg der ß-Halide erhalten werden.

Die bevorzugten Halidsalze für die Halogenierungsreaktion sind die Tetraalkylammoniuahalide und die Alkalimetallhalide, aber das Verfahren ist auf diese nicht beschränkt.

Das bevorzugte Lösungsmittel ist Acetonitril, aber andere aprotische, inerte Lösungsmittel, wie Aceton, Dimethylformamid und Äthylacetat, sind ebenfalls geeignet.

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Man kann ebenfalls 2-Azido-2-deoxygalactopyranose (XL) durch ähnliche Behandlung von N-(3,4,6-Tri-0-acetyl~2-azido-2-deoxya-D-galactopyranosyl)-acetamid (V) herstellen.

Beispiel 16 Herstellung von 2-Deoxy-D-lacto3aminhydrochlorid (XXXIX)

Im Beispiel 6 wird die Synthese von D-Lactosaminhydrochlorid (XXXIX) aus 2-Azido-2-deoxylactosylacetaten XXXI und XXXII beschrieben.

Ein anomeres Gemisch aus 5,0 g (7,75 mMol) 2-Azido-2-deoxylactoseacetat, Verbindungen XXXI und XXXII, wird in 20 ml wasserfreiem Methanol, das 5% Chlorwasserstoff enthält, gelöst und 2 bis 3 h bei Zimmertemperatur gerührt. Die Verdünnung dieser Lösung mit 10 ml n-Butanol und Verdampfen des Lösungsmittels ergibt 1,40 g hellgelben Sirup. Die Reduktion dieser Verbindung mit Wasserstoff in Anwesenheit von Palladium und Chlorwasserstoffsäure ergibt 2-Deoxy-D-lactosaminhydrochlorid (XXXIX).

Umwandlung der Azidonitrate in Azidohalide

Die stark elektronegativ wirkende Nitratgruppe dient als gute austretende Gruppe und insbesondere, wenn sie an dem anomeren Zentrum der Zuckerstrukturen vorhanden ist, wird sie leicht durch Nukleophile ersetzt. Von besonderem Interesse ist die Herstellung aus zuvor erwähnten 2-Azido-2-deoxyglycosylnitraten von 2-Azido-2-deoxyglycosylhaliden, da diese letzteren Substanzen für die Herstellung von 2-Azido-2-deoxyglycosiden unter Bedingungen für die Glycosidierung verwendet werden können, wie sie im allgemeinen in der Kohlehydratchemie· bekannt bzv/. üblich sind.

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Allgemein gesagt, ist Gegenstand der Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von a-Azido-a-deoxyglycosylhalid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein acyliertes 2-Azido-2-'deoxyglycosylnitrat mit einem Halidsalz in einem geeigneten Lösungsmittel umsetzt.

Ein bevorzugtes Beispiel dieses Verfahrens ist eins, "bei dem das Glycosylnitrat 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitrat oder 3,6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3-,4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-D-glucopyranosylnitrat ist.

Das Chloridsalz kann durch Umsetzung eines acylierten 2-Azido-2-deoxy-glycosylhalids, bevorzugt des Iodids, mit einem Chloridsalz, beispielsweise einem,Alkallmetallchlorid oder einem Tetraalkylammoniumchlorid in einem Moläquivalent, in einem geeigneten Lösungsmittel unter Bildung des acylierten 2-Azido-2-deoxyglycosylchlorids hergestellt werden.

Das Iodidsalz kann ebenfalls durch Umsetzung des Glycosylnitrats mit einem Überschuß an Lithiumiodid, vorzugsweise in Acetonitril, hergestellt werden.

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Genauer wird ein anomeres Gemisch aus 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitrat II und III mit Tetraäthylammoniumchlorid in Acetonitril unter Bildung eines anomeren Gemisches aus 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylchlorid umgesetzt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das ß-Chlorid in hoher Ausbeute durch Umsetzung eines anomeren Gemisches aus 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-B-galactopyranosylnitrat II und III. mit wasserfreiem Lithiumiodid in Acetonitril unter Bildung von 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-oc-D-galactopyranosyljjodid (XXIV) als Hauptprodukt hergestellt. Das Produkt wird sofort mit einem molaren Äquivalent von Tetraäthylammoniumchlorid in Acetonitril behandelt. Das Gemisch wird abgekühlt und die Extraktion ergibt 3,4,6-Tri~0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIII) in einer Ausbeute von etwa 60?S.

Die 2-Azido-2-deoxyglycosylhalide sind nützlich bei der Herstellung νοή\ 2-Azido-2~deoxyglycosiden unter Bedingungen für die Glycosidierung, wie sie im allgemeinen in der Kohlehydratchemie als Könings-Knorr-Bedingungen bekannt sind. Diese Reaktionen werden später erläutert.

Beispiel 17

Herstellung von 3«4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-q-D-galactopyranosylbromid (XX)

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0.50 g (1,34 mMol) 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylnitrat (II) werden in 4 ml wasserfreiem Acetonitril bei Zimmertemperatur, das 0,80 g (9,38 mMol) Lithiumbromid enthält, gelöst. Nach 40 min wird die Lösung mit 25 ml Dichlormethan verdünnt und mit 25 ml eiskaltem Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält 0,40 g klaren Sirup. Das PMR-Spektrum dieses Sirups besitzt ein Doublett bei" J=4Hz, bei 6,51 ppm, 'was dem anomeren Proton von 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylbromid (XX) zuzuordnen ist. Diese Verbindung konnte nicht kristallisiert werden. -

Beispiel 18

Herstellung von 3«4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-q-D-galactopyranosylchlorid (XXII)

0,377 g (1,01mMol) eines 1:2-Gemisches aus den α- und ß-Anomeren von 3,4, ö-Tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-D-galactopyranosylnitrat werden in 6 ml Acetonitril, das 0,924 g (5,05 mMol) Tetraäthylammoniumchlorid enthält, gelöst und die Lösung wird bei Zimmertemperatur während 48 h stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit 25 ml Dichlormethan verdünnt, mit 25 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum ergibt 0,325 g eines Sirups, der Doubletts mit Abständen von 9,0 und 3,5 Hz bei 65,15 und 6,20 ppm in dem in CDCl, gemessenen PMR-Spektrum zeigt. Diese Signale werden den ß- (XXIII) und a-Anomeren (XXII) für 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylchlorid zugeordnet. Aus den relativen Intensitäten der Signale kann man schließen, daß das Produkt fast ein 10:1-Gemisch der α- und ß-Anomeren (XXII und XXIII) ist.

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Beispiel 19

Herstellung von 3.6-Di-O-acetyl-4-O-(2.3.4.6-tetra-Q-acetylß-D-^alactopyranosy^^-azido^-deo^-tt-D-glucopyr allylchlorid (XXV)

1,0 g (1,5 mMol) eines Gemisches von α- und ß-Anomeren von 3»6-Di-O-acetyl-4-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-D-glucopyranosylnitrat (XIV) und (XV) wird mit einer Lösung aus 20 ml Acetonitril, die 1,30 g (7,8 mMol) Tetraäthylammoniumchlorid enthält,- bei Umgebungstemperatur während 1 h "behandelt. Danach wird die Lösung mit 50 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 50 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Man erhält einen Sirup, der sich schnell verfestigt. Die Umkristallisation dieses Peststoffs aus Äthylacetat/Äthyläther ergibt 3,6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxya-D-glucopyranosylchlorid (XXV), Fp 167 bis 168°C, [α]]*⁵ + 59,3° (c 1, Chloroform), in 66<&Lger Ausbeute.

Das Partial-FMR-Spektrum der Verbindung XXV in CDCl, ist (ppm) 6,08 (d, 1, J₁^₂ 3,9 Hz, H-1), 3,74 (q, 1, J_£;3 10Hz, H-2).

Beispiel 20

Herstellung von 3«6-Di-0-acstyl-4-0-(2.3,4.6-tetra-0-acetylß-.i)^^alactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-a-D-^lucopyranosylbromid (XXVI)

Die Behandlung von 1,0 g (1,5 mMol) eines Gemisches aus den o- und ß-Anomeren von 3,5-Di-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)^-azido^-deoxy-D-glucopyranosylnitrat (XIV) und (XV) mit 2 ml einer Lösung· aus Acetonitril,

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die 0,130 g (1,5 mMol) Lithiumbromid enthält,,bei Umgebungstemperatur während 2 bis 3 h und die anschließende Aufarbeitung des Produktgemisches nach dem im Beispiel 12 beschriebenen Verfahren ergibt 0,850 g weißen Schaum beim Verdampfen. Die Kristallisation dieses Materials aus Äthylacetat/Äthyläther er gibt reines 3f5-Di-0-acetyl-4-0-acetyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-a-D-glucopyranosylbromid (XXVI), Fp 156 bis 157°C, [α]²,⁵ + 87° (c 0,93, Chloroform), in 4i#iger Ausbeute.

Das Partial-PMR-Spektrum der.Verbindung (XXVl) in CDCl₃ ist (ppm) 6,36 (d, 1, J_1>2 3,9, H-U 3,65 (q, 1, J₂^₃ 10,2, H-2).

Beispiel 21

Synthese von 3,4_r6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-P-fralactopyranosyl.iodid (XXIV) in Aceton

32,5 g (0,087 Mol) 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylnitrat (II) werden mit einer Lösung von 64,29 g (0,43 Hol) wasserfreiem Natriumiodid, gelöst in 259 ml Aceton, bei Zimmertemperatur während 20 min behandelt. Dann wird die Reaktionslösung gemäß dem Verfahren von Beispiel 19 behandelt. Man erhält,37,6 g Sirup. Die Prüfung dieses Sirups durch PMR zeigt, daß er hauptsächlich 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxya-D-galactopyranosyljodid (XXIV) enthält.

Beispiel 22

Herstellung von 5_f4_T6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galacto-pyranosylchlorid (XXIII)

ObgMch 3,4,ö-Tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-a-D-galactopyranosylbromide und -chloride leicht für die spätere Verv/endung

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. si- ²⁸¹⁶³⁴°

hergestellt werden können, hat sich herausgestellt, daß da3 entsprechende ä-Jodid hoch reaktiv ist und nicht leicht gereinigt werden kann. Seine hohe Reaktivität ist jedoch für die Herstellung des ß-Chlorids (XXIlI) bei solchen Bedingungen, vo eine kinetische Kontrolle stattfindet, geeignet. Das Ct-Jodid kann mit Chloridion unter Bildung des ß-Chlorids (XXIII) in einer Rate umgesetzt werden, die wesentlich größer i3t als die Anomerisierung des ß-Chlorids zu dem α-Chlorid XXII.- " Die Herstellung des reinen ß-Chlorids wird in dem folgenden Beispiel erläutert.

0,781 g (2,09 mMol) eines Gemisches aus 3_t4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a- und ß-D-galactopyranosylnitraten (II und III), hergestellt wie im Beispiel 1 oder 2 beschrieben, werden zu einer Suspension aus 1,86 g (14 mMol) wasserfreiem Lithiumiodid in 3 ml wasserfreiem Acetonitril zugegeben. Das Gemisch wird in der Dunkelheit bei Zimmertemperatur 15 bis 17 min gerührt und dann in einer eiskalten 1§6igen wäßrigen Lösung aus Natriumthiosulfat gegeben. Ein 10-ml-Dichlormethanextrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Man erhält einen weißen Schaum, der sich beim Stehen verfärbt. Das EMR-Spektrum dieser Verbindung in CDCl, zeigt kein restliches Ausgangsmaterial und enthält ein Doublett mit J=4,0 Hz bei 6,93 ppm, was dem anomeren Proton von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylaodid (XXIV) zugeordnet wird. Dieses a-D-Jodid (XXIV) (2,09 mMol) wird unmittelbar mit einem molaren Äquivalent entweder von 0,344 g (2,09 mMol) Tetraäthylainmoniumchlorid, gelöst in 2 ml wasserfreiem Acetonitril, oder mit 0,081 g (2,0 mMol) Lithiumchlorid bei Umgebungstemperatur ■behandelt. Nach 1,5 min wird die Lösung in 10 ml eiskaltes Wasser gegossen und mit 10 ml kaltem Dichlormethan extrahiert. Die organische Lösung wird getrocknet und eingedampft. Man erhält einen hellgelben Sirup, der beim Verreiben mit Äthyiäther kristallines 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-

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2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlörid (XXIII) in 50- "bis 6C$iger Ausbeute, Fp 102 bis 104°C, [α]^⁵ - 16,5 (c 1, Chloroform).

Das PMR-Spektrum der Verbindung XXIII in CDCl₃ ist teilweise (ppm) 5,91 (q, 1, J₃^₄ 3 Hz, H-4), 5,15 (d, 1, J^₂ 9 Hz, H-1), 4,86 (q, 1, J_2j3 10,5 Hz, H-3), 3,88 (q, 1, H-2).'

Umwandlung von Glycosylhaliden zu Glycoslden

Die Glycosidierung unter Königs-Knorr-Bedingungen umfaßt die Behandlung der Glycosylhalide mit einem Alkohol, ROH, in Anwesenheit eines Aktivators. Der Aktivator ist üblicherweise ein Salz oder eine Verbindung, die ein schweres Atom, wie Silber, Blei oder Quecksilber, enthält, das sich mit dem Halogenatom koordinieren kann, so daß die Spaltung seiner Bindung mit dem anomeren Kohlenstoffatom erleichtert wird. Das Halogen wird durch die Alkoxygruppe -OR unter Bildung des Glycoside ersetzt.

Die neuen a-Glycosylhalide von 2-Azido-2-deoxy-D-galactose XX und XXII, hergestellt wie in den Beispielen 17 und 18 aufgeführt, und von 2-Azido-2-deoxy-D-lactose XXV und XXVI, wie in den Beispielen 19 und 20 gezeigt, können für die Herstellung der neuen 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranoside (Beispiele 23, 24) und 2-Azido-2-deoxy-ß-D-lactoside (Beispiel 25) unter den Bedingungen der Königs-Knorr-Reaktion verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxyß-D-galactopyranosylhalia, /(ΧΧΙΪΙ7 mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators unter Bildung von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-r2-deoxy-a-D-galactopyranosiden umsetzt.

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' έ,/l· 28163A0

Das vollständige Verfahren für die Herstellung der Glycoside umfaßt somit beispielsweise:

Umsetzung von 3»4,6-iri-O-acetyl-D~galactäl mit Cer(IV)-ajnmoniumnitrat und einem Azidsalz in einem geeigneten Lösungsmittel unter Rühren unter Bildung von 3»4,6-Tri-O-acetyl-2-deoxy-D-galactopyranosylnitraten;

Umsetzung der 3»4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitrate mit einem Halidsalz, beispielsweise einem Iodidsalz, in einem geeigneten Lösungsmittel unter Herstellung von 3t4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylhalid, beispielsweise Iodid;

gegebenenfalls Umsetzung, wenn das Iodid verwendet wurde, des 3»^»e-T-ri-O-acetyl^-azido^-deoxy-oc-D-galactopyranosyliodids mit einem Mol Äquivalent eines Chloridsalzes in einem geeigneten Lösungsmittel unter Bildung von 3,4,6-¹OrI-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid; und

Umsetzung von 3r^,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylhalid, beispielsweise Chlorid mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators unter Bildung von 3,4, o-Tri-O-acetyl-^-azido^-deoxy-a-D-galactopyranosid.

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'.-62.

Der Alkohol besitzt bevorzugt die Formel ROH, worin R = (CH₂JnGO₂R¹ bedeutet, η = 3 bis 19 bedeutet und R¹ eine Alkyl- oder Arylgruppe bedeutet, oder worin R ein geeignet geschütztes Monosaccharid oder sein Disacchariä der Struktur

0(CH₂JnCO₂R¹

OBn

ist, worin η = 3 bis 19 bedeutet und R¹ eine Alkyl- oder Arylgruppe, beispielsweise 8-Methoxycarbonyloctyl-2-0-(2, 3,4-tri-O-benzyl-a-L-fucopyranosyl)-4,6-0-benzyliden-ß-D-galactopyranosid. » ,

Ein anderes Ausgangsma-terial wäre ein peracyliertes 2-Azido-2-deoxy-a-D-lactosylhalid, das, wenn es mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Aktivators umgesetzt wird, peracylierte:2-Azido-2-deoxy-ß-D-lactoside ergibt.

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Spezifischer wird 3,4,6-Tri-0-acetyl~2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIII) mit 8-Methoxycarbonyloctyl-2-0-(2,3,4, -tri-O-benzyl- a-L-f ucopyr ano syl) -4,6-0-benzylidenß-D-galactopyrano3id (XLVII) in Anwesenheit von Silbertrifluormethansulfonat und Silbercarbonat in dem Lösungsmittel Dichlormethan unter Bildung von e-Methoxycarbonyloctyl-S-O-( 3»4,S-tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(2,3,4-tri~0-benzyl-cc-L-fucopyranosyl)-4,6-0-benzyliden-ß-D-galactopyranosid (XLVIII) umgesetzt. Dieses Produkt wird nach an sich "bekannten Verfahren isoliert und behandelt, so daß die folgenden Reaktionen ablaufen: Abspaltung, d.h. Umwandlung der Acetyl-, Benzyl- und Benzylidengruppen in Hydroxylgruppen, Reduktion der Azidogruppe in ein Amin und Acetylierung des Amins. Das Endprodukt dieser Stufen ist 8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(2-acetamido-2-deoxy-+-D-galactopyranosyl)-2-0-(a-L-f ucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid, die terminale -bzw. endständige Trisaccharid-Antigendeterminante für die menschliche Blutgruppe A.

Beispiel 23

Herstellung von t-Butyl-3«4,6-tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxyß-D-^alactopyranosid (XLI)

0,90 g (2,28 mMol) 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosylbromid (XX), hergestellt entweder durch Umsetzung von 1,3,4,6-Tetra-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-galactopyranose (XXVII) mit Bromwasserstoff in Methylenchlorid oder gemäß dem Verfahren von Beispiel 17 werden zu 0,236 ml (2,40 mMol) t-Butylalkohol, gelöst in 3 ml Methylenchlorid, das Ί»δ g (6»74 mMol) Silbercarbönat und ein 4&-Molekularsieb enthält, gegeben. Nach dem Rühren während 1 h bei Zimmertemperatur wird das Produkt in an sich bekannter Weise isoliert. Man erhält einen Sirup. Die PMR-Prüfung dieses Sirups zeigt

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ein Doublett bei 4,64 ppm mit J_{1 2}= 9 Hz und ein Singlett bei 1,31 ppm, die dem anomeren Proton bzw. Aglycon von t-Butyl-3,4,6-tri-0-acetyl-2-azido-2-deox7-ß-D-galactopyrano-. sid (XLI) zugeordnet werden, das in einer Ausbeute von 75% erhalten wird.

Baispiel 24

Herstellung von 8-Metho3cyoctylcarbonvl-3«4, 6-tri-O-acetvl-2-acetamido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosid (XL)

Eine Lösung aus 1,0 g (2,54 mMol) 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-a2ido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylbromid (XXI), gelöst in 2 ml Dichlormethan, wird zu einem Gemisch aus 0,565 g (2,79 mMol) 8-Methoxycarbonyloctanol, 4Ä-Molekularsieben und 2,30 g (8,37 mMol) Silbercarbonat in 5 ml Dichlormethan gegeben. Anschließend wird 3 h bei Zimmertemperatur gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Lösung filtriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält 1,30 g Sirup. Dieser Sirup wird in 10 ml Essigsäure, die 10 ml Essigsäureanhydrid enthält, gelöst und 1,17 g (18 mMol) Zinkmetall werden unter Rühren zugegeben. Nach 20 min werden die Feststoffe abfiltriert und das Filtrat auf etwa 2 oder 3 ml konzentriert. Dieses wird mit 25 ml Dichlormethan verdünnt und mit 20 ml gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und 10 ml Wasser gewaschen. Das Trocknen der organischen Lösung und das Eindampfen ergibt 1,0 g (75?Sige Ausbeute) eines Sirups, der, wie durch Prüfung des PMR-Spektrums in CDCl, gezeigt werden konnte, im wesentlichen reines 3-Methoxyoctylcarbonyl-2-acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-ß-D-galactopyranosid (XLII) ist. Ein Partial-PMR dieser Verbindung in CDCl₃ ergibt (ppm) 6,40 (d, 1, J_{Iffi £} 8,2 Hz, NH), 4,70 (d, 1, J₁ 2 ⁸»° Ηζ,Η-1). Die große Kupplungskonstante von 8,0 Hz für das H-1-Proton wird durch die Bildung der ß-D-Giycosylbindung bestätigt.

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- 6-r -

^28163A0

Beispiel 25

Synthese von t-Butyl^.o-di-O-acetyl^-O-(2-3.4.6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)^-azido-ff-deoxy-ß-D-glucopyranosid (XLIII)

Behandlung von 1,0 g (1,46 mMol) 2-Azido-2-deoxy-lactosylbromid (hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 23 während 2 h) ergibt nach üblicher Aufarbeitung 0,80 g (80%) der Verbindung XLIII.

Die Deacetylierung und Reduktion der Azidogruppe, gefolgt durch N-Acetylierung der Verbindung XLIII gemäß dem Verfahren von Beispiel 11, ergibt das entsprechende 2-Acetamido-2-deoxyß-D-lactosylglycosid (XLIV).

Es ist ein. wesentliches.Merkmal der Erfindung, daß 3,4_r6f-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIH) als Reagens für die Herstellung von 2-Amino-2-deoxy-a-D-galactopyranosiden, wie in der Formel A dargestellt, zur Verfügung gestellt wird.

In den folgenden Beispielen wird die Verbindung XXII zur Herstellung eines einfachen Glycosids (Beispiel 26), eines Disaccharide (Beispiel 27) und einer antigenen Trisacchariddeterminate für die menschliche Blutgruppe A (Beispiel 28) verwendet.

Beispiel 26 Synthese von t-Butyl-^^.e-tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-a-D-

(XLV)

•Eine Lösung von 0,160 g (0,458 mliol) frisch hergestelltem

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3,4, ö-Tri-O-acetyl^-azido^-deoxy-a-D-galactopyranosyl Chlorid (XXII) in 1 ml Dichlormethan wird tropfenweise zu einem Gemisch' aus 0,010 g <0,039 mMol) Silbertrifluormethansulfonat, 0,443 g (1,61. mMol) Silbercarbonat, 0,150 g 4S-MoIekularsleben und 55 ul (0,533 mMol) t-Butanol in Dichlormethan. gegeben. Dieses Gemisch wird 2,5 h in der Dunkelheit gerührt und dann filtriert. Das entstehende Filtrat wird zur Trockene eingedampft und man erhält 0,150 g Sirup. Das PMR-Spektrum dieses Materials in CDCl* zeigt die Anwesenheit von etwa 6096 cc-t-Butylglycosid (XLV) durch die Anwesenheit eines Singletts bei 0,30 ppm. Das anomere Proton war schwer zu erkennen wegen der Signale für H-4 und H-3 nahe bei 5,1 ppm.

Beispiel 27

Herstellung von 8-Methoxycarbonylocty1-3-0-(2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid (XLVII)

Eine Lösung von 0,335 g (0,96 mMol) frisch hergestelltem 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid XXIII in 1 ml Dichlormethan wird zu einem Gemisch aus 0,022 g (0,085 mMol) Silbertrifluormethansulfonat, 1,06 g (3,85 mMol) Silbercarbonat, 0,70 g 4Ä-Molekularsieben und 0,250 g (0,461 mMol) 8-Methanoxycarbonyloctyl-4,6-0-benzyliden-2-0-benzoyl-ß-D-galactopyranosid XLV in 4 ml Dichlormethan gegeben. Nach 4 h bei Umgebungstemperatur wird das Gemisch durch Diatomeenerde filtriert, die mit 10 ml Dichlormethan gewaschen wird. Diese Lösung wird eingedampft. Man erhält einen Sirup, der in einer geringen Menge von 1:1(V/V)-Benzol/Äthylacetat gelöst und an 15 g neutralem Aluminiumoxid in einer Säule (10 χ 2 cm) unter Elution mit dem gleichen Lösungsmittel chromatographiert wird. Man erhält 0,524 g Sirup. Die Kristallisation dieses . Sirups aus Äthylacetat/Pentan ergibt rohes 8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(3,4,6-tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galacto-

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pyran"osyl)-4,6-0-benzyliden-2-0-benzoyl-ß-D-galactopyranosid (0,324 g) in 79?6iger Ausbeute. Die Umkristallisation ergibt die reine Verbindung, Fp 175 bis 176⁰C, [α]²⁵ + 119,7° (c 1, Chloroform), IR (Film) 2120 cm"¹ (-N^).

Das PMRrSpektrum dieser letzteren Verbindung in CDCl, zeigt teilweise bei 4,62 ppm ein Doublett mit J^ _o = 8,0 Hz, das dem H-1 zugeordnet wurde. Das Signal für H-1' wurde teilweise durch die Signale für H-3'und H-4¹ überlagert. Daß üie neu gebildeten Interzuckerglycosidbindungen α sind, wurde durch die Anwesenheit des Signals in dem ^C-Spektrum der Verbindung in CDCl, bei 95,4 ppm, das dem C-1' zugeordnet wurde, gezeigt. Das dem C-1 zugeordnete Signal wird bei 100,7 ppm beobachtet. Die Hydrierung, gefolgt von der N-Acetylierung und Entfernung der Acetyl- und Benzoylschu.tzgrupp.en, wie. im Beispiel 27 für die Herstellung der Verbindung L gezeigt, ergibt kristallines 8-Methoxycarbonylocty1-3-0-(2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid (XLVII). Die Umkristallisation aus Methanol/Äthyläther ergibt reines XLVIII, Fp 214 bis 216⁰C, [α]²)⁵ + 126,3° (c 0,98, Wasser).

Beispiel 28

Herstellung von 8-Hethoxycarbonyloctyl-3-0~(2-acetamido-2-deoxy-«-D-galactoOyranosyl)-2-0-(oc-L-f ucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid L

In diesem Beispiel besitzt der Alkohol eine Disaccharidstruktur und das Glacosidierungsprodukt wird durch Umwandlung der Acetyl-, Benzyl- und Benzoylgruppen in Hydroxylgruppen (Schutzgruppenabspaltung)behandelt- und dann wird" die Azidogruppe zu Amin reduziert, das dann acetyliert wird.. Die Verfahren, die für die Schutzgruppenabspaltung, Reduktion und Acetylierung verwendet v/erden, sind dem Fachmann geläufig.

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Eine Lösung aus 0,583 g (1,6 mMol) frisch hergestelltem 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlorid (XXIII), gelöst in 2 ml Dichlormethan, wird zu einer Lösung von 0,035 g (0,136 mMol) Silbertrifluormethansulfonat, 1,70 g (6,18 mMol) Silbercarbonat, 1,12 g ^-Molekularsieben und "0,787 g (0,9 mMol) 8-Methoxycarbonyloctyl-2-0-(2,3,4-tri-0-benzyl-a-L-fucopyranosyl)-4,6-0-benzyliden-ß-D-galactopyranosid (XLVIII) in 5 ml Dichlormethan gegeben. Nach 4 h bei tfaigebungstemperatur wird das Gemisch mit 10 ml Dichlormethan verdünnt und durch Diatomeensilica filtriert·. Das Filtrat wird eingedampft und man erhält 1,25 g Sirup. Dieser Sirup wird an einer Säule (44 χ 2 cm) von Silicagel mit 2:1(V/V)-Benzol/ Äthylacetat als Eluierungsmittel chromatographiert. Man erhält 0,780 g (75#ige Ausbeute) reines 8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(3»4,6-tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(2,3,4-tri-O-benzyl-a-L-f ucopyranosyl)-4,6-a-benzylidenß-D-galactopyranosid XLIX, [a]jp + 15,5° (c 1, Chloroform), IR (Film) 2110 cm"¹ (-N₃).

Das PMR-Spektrum der Verbindung XLIX in CDCl₃ besitzt teilweise 5,47 (d, 1, J₁^₂B 3,4 Hz, H-1"), 5,32 (d, 1, J₁,_>2, 3 Hz, H-1¹). Ibr ¹³-C-HI4R-Spektrum in CDCl₃ zeigt klar die beiden a-Glycosidinterzuckeranomer-Kohlenstoffatome mit Signalen -bei 97,9 ppm und 94,0 ppm für. C-1* der Fucosyleinheit und C-1" der 2-Azido-2-deoxygalactosyleinheit. Das Signal, das dem C-1 der Galactosyleinheit zugeordnet wird, tritt bei 100,5 ppm auf.

0,10 g (0,035 mMol) Verbindung L v;erden in 2 ml Ithylacetät, das 0,2 ml Essigsäureanhydrid enthält, gelöst und in Anwesenheit von 5?oigem Palladium auf Kohle (0,06 g) bei 7,03 kg/cm² (100 psig) und Umgebungstemperatur hydriert. Nach 23 h wird die Lösung filtriert und eingedampft. Man erhält einen Schaum. Das Infrarotspektruia dieser Verbindung zeigt die Abwesenheit

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einer Azidgruppe. Die Verbindung wird von ihren Schutzgruppen befreit und deacetyliert mit Natriummethoxid in 5 ml wasserfreiem Methanol bei Umgebungstemperatur während 15 h. Nach der Deionisierung und Filtration sowie Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 0,08 g Schaum. Die Hydrierung dieses Materials in 3 ml Äthanol in Anwesenheit von 0,065 g 5#igem Palladium auf Kohle bei Umgebungstemperatur und 7,03 kg/cm während 40 h, gefolgt von.der Filtration und Verdampfung, ergibt 0,046 g (78#ige Ausbeute) e-Methoxycarbonyloctyl-S-O-^-acetamido^- deoxy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(a-L-fucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid (XLIX) als weißen Feststoff.

Das PMR-Spektrum der Verbindung L in D₂O ist in Übereinstimmung mit der zugeordneten Struktur und zeigt teilweise (ppm) 5,62 (d, 1, J₁, ₂, 1Hz, H»), 5,46 (d, 1, J₁,,^,, 3,5 Hz, H-1^B), 2,24 (s, 3, NAcJ. Diese Verbindung ist die antigene Trisacchariddeterminante für die menschliche Blutgruppe A.

Beispiel 29

Herstellung eines Immunoabsorbens (LII). das für die Anti-A-AntikÖrper spezifisch ist

Die antigene Trisacchariddeterminante (L) für die menschliche Blutgruppe A kann zur Herstellung eines künstlichen Antigens durch Bindung bzw. Haftung an einem löslichen Trägermolekül, wie Proteine, rote Blutzellen, Polypeptide und lösliche aminierte Polysaccharide, unter Verwendung bekannter Verfahren verwendet werden.

Das Glycosid L kann ebenfalls zur Herstellung eines Immunoabsorbens verwendet werden, das für die Anti-A-Antikörper spezifisch ist, durch Haftung bzw. Bindung an einen unlöslichen· Träger, wie aminiertes Glas, aminiertes Polyacrylamid,

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aminiertes Polyvinyl, aminierter Agarose und andere unlösliche aminierte Polysaccharide (aminiert = dem angelsächsischen Ausdruck aminated). Dieses Verfahren wird im folgenden erläutert.

0,044 g (0,063 mMol) 8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(a-L-f ucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid (L) werden mit 2 ml 85^igem Hydrazinhydrat bei Zimmertemperatur während 90 min gerührt. Die Prüfung durGh DünnschichtChromatographie des Reaktionsgemische an Silicagel zeigt bei der Entwicklung mit 7:1:2(V/V)-Isopropanol/Ammoniumhydroxid/Wasser kein restliches Ausgangsmaterial. Diese Lösung wird mit 1 ml'50%igem wäßrigen Äthanol verdünnt und zur Trockene eingedampft. Man erhält 0,044 g eines weißen Schaums. Das Material wird in 2 ml Wasser gelöst und gegenüber destilliertem Wasser in einer Ultrafiltrationszelle diälysiert, wobei fünfmal ausgetauscht wurde, und die Zelle mit einer. Membran mit einem Molekulargewicht schnitt von 500 ausgerüstet ist. Es wird dann gefriergetrocknet. Man erhält 0,039 g des entsprechenden Hydrazide LI als weißen Feststoff.

Das PMR-Spektrum der Verbindung L in D₂O steht in Übereinstimmung mit der zugeordneten Struktur und zeigt teilweise (ppm) 5,58 (d, 1, J 1 Hz, H-1·), 5,44 (d, 1, J₁,,^,, 3,5 Hz, H-1"), 2,30 (s, 3, WAc).

0,35 g (0,05 mMol) des Hydrazids LI werden in 0,7 ml Dimethylformamid gelöst und auf -25°C abgekühlt. Eine Lösung von 0,057 ml Dioxan, die 3,5N-Chlorwasserstoffsäure enthält, wird zugegeben und dann werden 0,007 g (0,069 mMol) t-Butylnitrat, gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid, zugegeben. Dieses Gemisch wird 30 min bei -25°C gerührt, danach werden 0,0049 g (0,052 mMol) Sulfamidsäure zugegeben. Nach 15 min wird diese Lösung tropfenweise zu 5,0 g silylaminierten Glasperlen, die in

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28163*0-

25 ml Pufferlösung, 0,08M in Na₂B^O₇ und 0,35Μ· in KHCO, bei 0°C suspendiert sind, zugegeben. Die Suspension wird langsam bei 3 bis 5°C 26 h in einer Trommel bewegt, danach wird der Träger abfiltriert und mit 500 ml ¥asser gewaschen. Die Perlen werden in 30 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung suspendiert und 30 ml 5$£iges wäßriges Essigsäureanhydrid werden zugegeben. Dann wird 15 min gerührt. Die Perlen werden dann filtriert und mit 500 ml Wasser gewaschen und in 25 ml phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7) suspendiert und 15 min reduziertem Druck ausgesetzt. Die Filtration und Waschen mit 100 ml Wasser ergibt 11,2 g hydratisiertes Immunoabsorbens LIII. Eine Phenol/Schwefelsäure-Analyse für die Gesamthexose dieses Immunoabsorbens vor der Acetylierung zeigt eine Beladung von 6 11 Mol Hapten pro g Träger.

Es wurde gefunden, daß das Immunoabsorbens LIII selektiv Anti-A-Blutgruppenantikörper aus Menschensera entfernt. Beispielswelse werden durch Behandlung von 1 ml Serum, das wirksam Menschen-A-Blutzellen agglutiniert, mit 200 mg des Imoonoabsorbens LII diese Antikörper, die für die Agglutination verantwortlich sind, innerhalb 20 min entfernt. Die Verwendung des Immunoabsorbens in Form der gepackten Säule ist noch wirksamer.

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Claims (10)

1. Patentansprüche

   V 1. ^verfahren zur Herstellung von O-geschützten 2-Azido-2-aeoxy-glycosylnitraten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein O-geschü*tztes Glycal, beispielsweise ein O-acyliertes Derivat einer der folgenden Verbindungen: D-Galatal, D-Glucal, D-Xylal, D-Arabinal, L-Fucal, D-Lactal oder D-Maltal, mit Cer(lV)-. mmoniumnitrat und einem Azidsalz, beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Lithiuinazid, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril, unter Rühren und Bilden der O-geschützten 2-Azido-2-deoxy-glycosylnitrate umsetzt.
2. 2. Verfahren zur Umwandlung eines O-geschützten 2-Azido-2-deoxy-glycQsylhalids, dadurch gekennzeichnet, daß man das beispielsweise nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellte Nitrat mit einem Halidsalz in einem geeigneten Lösungsmittel umsetzt.
3. 3. Reagens, ausgewählt unter O-geschützten 2-Azid-2-deoxyglycosylnitraten, beispielsweise einem Gemisch der α- und ß-Anomeren von 3t^t5-5ri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-galactopyranosylnitrat, einem Gemisch der α- und ß-Anomeren von 3,^,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-glucopyranosylnitraten und 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy~D-mannopyranosylnitrat,

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   TCLBPON (O··) 93 3*ea TELEX Ο·-2·3·Ο T(LCQRtMMt MONAPAT TELSKOPIERRR

   ORIGINAL INSPECTED

   einem Gemisch der α- und ß-Anomeren von 3,4-Di-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-D-xylopyranosylnitrat oder einem Gemisch der α- land ß-Anomeren von 3>6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3>4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)^-azido^-deoxy-D-glucopyranosylnitrat und O-geschützten -2-Azido-2-deoxyglycosylhaliden, beispielsweise einem 3»4-i6-'Eri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-gaiactopyranosylhalid, wi.e 3,4j6-Tri-0-acetyl-2-azldo-2-deoxy-a-D-galactopyranosyliodid, 3.4,6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-ß-D-galactopyranosylchlörid, 3 , ö-Di-O-acetyl-^O- (2, 3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-a-D-gluGopyranosyl-halid, wie 3».6-Di-O-acetyl-4-O-(2,3>4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-a-D-glucopyranosylchlorid oder 3»6-Di-0-acetyl-4-0-(2,3>4,6-tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-a-D-glucopyranosilbromid, oder 3»6-D.i-O-acetyl-4-0-(2,3>4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-azido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosylchlorid. ■ . . ■
4. 4. Verfahren zur Herstellung von 2~Amino-2-deoxygly.cose oder 2-Acetamido-2-deoxyglycose aus einem O-geschützten 2-Azido-2-deoxy-glycosylnitrat,z..B^ hergestellt naph dem Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gegebenenfalls die Nitratgruppe durch eine Acylgruppe ersetzt und in einer beliebigen Reihenfolge die Azidogruppe gegebenenfalls in Anwesenheit von Essigsäureanhydrid zu einer Aminogruppe reduziert und hydrolysiert.
5. 5. Verfahren zur Herstellung eines O-geschützten 2-Azido-2-deoxyglycosids oder eines 2-Amino-2-deoxyglycosids aus einem O-geschützten 2-Azido-2-deoxyglycosylhalid, dadurch gekennkennzeichnet, daß man das Halid, das beispielsweise nach einem Verfahren gemäß Anspruch 2 hergestellt wurde, mit AIkQ-hol in Anwesenheit eines Aktivators umsetzt und gegebenenfalls die Azidogruppe zu einer Aminogruppe reduziert.

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6. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man die Azidogruppe zu einer Aminogruppe reduziert und das Amin acetyliert.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man von der O-geschützten Gruppe die Schutzgruppe abspaltet.
8. 8. Produkt, ausgewählt unter O-geschützten 2-Azido-2-deoxyglycosiden, wie 3f^»6-Tri-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-a-D-gaiactopyranoside und O-geschützte· 2-Acetamido-2-deoxy-glycoside.
9. 9. Glycosidprodukt der Struktur

   3H

   OH

   OH

   0(CH₉JnCOR

   OH

   809842/1Q7S

   worin η = 3 bis 19 bedeutet und R¹ eine Alkyl- oder Arylgruppe bedeutet, beispielsweise e-Methoxycarbonyloctyl-^-O-(2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-2-0-(a-L-fucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid oder 8-Methoxycarbonyloctyl-3-0-(2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid.
10. 10. Immunoabsorbens, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem 2-Acetamido-2-deoxyglycosid, wie es in Anspruch 9 beansprucht wurde, hergestellt worden ist, ader daß es nach einem Verfahren nach Anspruch 7 erhalten worden ist und an einen unlöslichen Träger gebunden ist.

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