DE2831579B2

DE2831579B2 - Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin, Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2831579B2
Application number: DE2831579A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Naganawa; Tomio Takeuchi; Kuniaki Tatsuta; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1977-08-05
Filing date: 1978-07-18
Publication date: 1980-01-24
Also published as: IT7868847A0; FR2399439B1; ES472306A1; DE2831579C3; FR2399439A1; NL7807906A; IE781566L; NL174147B; AU3844678A; DE2831579A1; HK18683A; BE869395A; DK152677B; JPS5647194B2; FI63420C; AU510946B2; FI63420B; IT1160574B; SG5383G; CA1120925A

Description

O	OH	O	— O \
OCH₃
A

(D

20

CH

R²O

NH₁

in der die Substituenten R¹ und R² folgende w Bedeutungen und Zuordnungen haben:

R' Wasserstoff

Tetrahydropyranyloxy

Hydroxy

Tetrahydropyranyloxy
R² Tetrahydropyranyl

Wasserstoff

Tetrahydropyranyl

in Form der sich in der Konfiguration an der C-2-Stellung der Tetrahydropyranyloxygruppe unterscheidenden Diastereomeren oder der Diastereomeren-Gemische sowie deren Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Daunomycin oder Adriamycin in an sich bekannter Weise mit 3,4-Dihydro-2H-pyran in einem inerten organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines sauren Katalysators umsetzt und gegebenenfalls eine Tetrahydropyranylgruppe durch partielle Hydrolyse oder Alkoholyse der gebildeten Bis-tetrahydropyranylverbindungen abspaltet, und die erhaltenen Tetrahydropyranylether isoliert und, gegebenenfalls nach Auftrennung in die jeweiligen Diastereomeren, gegebenenfalls in Säureadditionssalze überführt.

3. Pharmazeutische Zubereitungen, gekennzeichnet durch eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.

Eine Vielzahl von Anthracyclinglykosiden wird in der Literatur beschrieben. Erwähnt seien Daunomycin {US-PS 36 16 242 und GB-PS 10 03 383) sowie Adriamycin (US-PS 35 90 028 und 38 03 124). Die Verbindungen werden aus der Kulturbrühe bestimmter Streptomyce.; erhalten, besitzen ein breites Antitumorspektrum gegenüber verschiedenen experimentellen Tumoren und werden klinisch als wirksame chemotherapeutische Mittel eingesetzt. Trotz der Eignung von Adriamycin und Daunomycin als klinische Antitumormittel in es bekannt, daß sie erhebliche Nebenwirkungen aufweisen, wie beispielsweise eine Alopezie, Leukopenie sowie Kardiotoxizität.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von neuen Verbindungen, denen die vorstehend geschilderten Nachteile der bisher bekannten Substanzen nicht mehr anhaften.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gemäß dem Patentanspruch gelöst.

Die erfindungsgemäßen Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin besitzen eine ausgeprägte Antitumoraktivität und dabei eine niedrige Toxizität.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach dem Verfahren gemäß Patentanspruch 2 hergestellt werden. Zur Herstellung der Säureadditionssalze kann man anorganische oder organische Säuren verwenden, die insbesondere keine nichttoxischen Salze ergeben. Erwähnt seinen beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäut'e, Bromwassersioffsäure, Salpetersäure, phosphorige Säure, Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, Laurylsulfonsäure, Methansulfonsäure oder Naphthalinsulfonsäure.

Die Verbindungen der Formel (I) mit einem Tetrahydropyranyloxy-R²-Substituenten existieren als individuelle Diastereomere (die willkürlich nachfolgend als Isomeres a und Isomeres b bezeichnet werden) und unterscheiden sich in der Konfiguration an der C-2-Stellung der Tetrahydropyranyloxygruppe oder liegen als Gemische derartiger Isomerer vor. Die Erfindung umfaßt sowohl die getrennten Diastereomeren als auch die Diastereomeren-Gemische.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. I das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin (Isomeres a),

F i g. 2 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin (Isomeres b),

F i g. 3 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4',14-Bis-(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin (Isomeres a),

Fig.4 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4\14-Bis(0-tetrahydropyranyl)-adriamycin (Isomeres b),

Fig.5 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 14-O-Tetrahydropyranyladriamycin,

Fig.6 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-O-Tetrahydropyranyladriamycin (Isomeres a),

F i g. 7 das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von 4'-O-Tetrahydropyranyladriamycin (Isomeres b),

Fig.8 bis 14 Proton-NMR-Spektren (100 MHz, CDCI3) der Verbindungen in der Reihenfolge, in welchen vorstehend ihre Infrarotabsorptionsspektren angegeben werden.

Adriamycin und Daunomycin, die Ausgangsmaterialien zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, lassen Mch durch die Formeln wiedergeben.

O OH

Daunomycin

HO

NH,

O OH

Adriamycin

NH₂

Daunomycin besitzt zwei reaktive Hydroxylgruppen (ausschließlich der zwei phenolischen Hydroxylgruppen) an der C-9- und C-4'-Stellung, während Adriamycin drei reaktive Hydroxylgruppen (ausschließlich der zwei phenolischen Gruppen) an der C-9-, C-14- und C-4'-Stellung aufweist. Unter geeigneten Bedingungen liegen Unterschiede bezüglich der Reaktivität der verschiedenen reaktiven Hydroxylgruppen in diesen Verbindungen vor, wobei diese Unterschiede zur Herstellung von geeigneten neuen Derivaten ausgenutzt werden können. Insbesondere dann, wenn die freie Base von Adriamycin oder Daunomycin oder ein Säureadditionssalz dr.von (beispielsweise das Hydrochlorid) in einem inerten organischen Lösungsmittel suspendiert oder aufgelöst und mit 3,4-Dihydro-2H-pyrar in Gegenwart eines sauren Katalysators umgesetzt wird, verschiedene neueTrtrahydropyranylätherderivate der eingesetzten Glykoside gebildet weiden. Die jeweils gebildeten Reaktionsprodukte, die Mengenverhältnisse der verschiedenen Produkte sowie die Reaktionsausbeuun schwanken in Abhängigkeit von den eingehaltenen Reaktionsbedingungen, beispielsweise in Abhängigkeit von dem Lösungsmittel, dem sauren Katalysator, dem Verhältnis der Reaktantei·, der Temperatur, der Reaktionszeit.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin läßt sich durch die folgenden keaktionsschemata veranschaulichen:

Schemel I

O OH

- Λ

υ If

τ r

O OH

CCH₁

(HU

( il

IK)

)aiinom\an

O OH C (

OH

O OH O( W

.

■ (H. 4'-Ο !'Da 4 ■-() I¹Dh

Ml

HO

NH₂

vi iiiv r
Κ,ιΙ.ιΙν Mil

N! Ι

14-Ο-Ι'Λ

O OM Il O-.

I: ! ('· —CM,O —(

OH

O OM OCH-.

An. y

-- O

NH-

4'.14-BiS-O-PAa 4'.14-BiS-O-PAb

Hydrolyse

oder

Alkoholyse

C-CH₂OH

OH

4',14-Bis-O-PAal 4',14-Bis-O-PAbj

NH₂

Die Umwandlung einer reaktiven Hydroxylgruppe von Adriamycin oder Daunomycin in eine Tetrahydro- pyranyloxygruppe erfolgt durch Veretherung. Das als Ausgangsmaterial dienende Glykosid kann in Form einer freien Base oder in Form eines Säureadditionssalzes vorliegen.

Jedes nichtreaktive organische Lösungsmittel kann für die Tetra^v.ydropyranylierungsreaktion eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Xylol, Dimethylformamid, Acetonitril sowie Tetrahydrofuran. Das Reaktionslösungsmittel kann ein einfaches Lösungsmittel oder eine L.ösungsmittelmischung sein. Ein besonders bevorzugtes Lösungsmittel besteht aus wasserfreiem Dimethylformamid.

Der saure Katalysator kann aus jeder organischen Säure (beispielsweise Ameisensäure oder Trifluoressigsäure) oder anorganischen Säure (beispielsweise Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure) bestehen. Eine bevorzugte Klasse von sauren Katalysatoren sind die organischen Sulfonsäuren. Besor jers bevorzugte Katalysatoren sind die aromatischen Sulfonsäuren, wie p-Toluolsulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Ein ganz besonders bevorzugter Katalysator ist p-Toluolsulfonsäure.

Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch. Gute Ergebnisse werden bei der Durchführung der Verätherungsreaktion bei Zimmertemperatur erzielt, wobei jedoch auch Temperaturen eingehalten werden können, die oberhalb oder unterhalb dieser Temperatur liegen.

Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den jeweils ausgewählten Verfahrensbedingungen, beispielsweise der Temperatur, dem Katalysator, dem Lösungsmittel. Die Auswahl einer optimalen Reaktionszeit zur Gewinnung eines spezifischen Produktes oder einer Produktmischung kann durch Routineversuche unter Einsatz der nachfolgend beschriebenen Dünnschichtmethode ermittelt werden. Im allgemeinen liefern jedoch Reaktionszeiten von ungefähr 20 Stunden bis ungefähr 50 Stunden vorteilhafte Ergebnisse.

Wie bereits erwähnt, hängen die jeweiligen Reaktionsprodukte und Reaktionsausbeuten von verschiedenen Faktoren ab, wie der Konzentration der Ausgangsmaterialien, dem Verhältnis der Reaktanten. Wird Daunomycin als Ausgangsmaterial verwendet, dann bestehen die Hauptprodukte aus 4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin (abgekürzt 4'-O-PD) und 9-O-Tetrahydropyranyldaunomycin (abgekürzt 9-O-PD). Diese Produkte können in der Reaktionsmischung durch Kieselgeldünnschichtchromatographie unter Einsatz einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (80 : 20 :4, Volumen/Volumen) als Entwickler entdeckt werden. Die Produkte erscheinen bei einem R_f-Wert von 0,74 (4'-0-PD) und 0,15 (9-O-PD).

Das Produkt 4'-O-PD wurde in zwei Komponenten mit R[-Werten von 0,46 und 0,65 durch Kieselgeldünnschichtchromatographie unter Einsatz einer Mischung aus Chloroform und Methanol (10:1, Volumen/Volumen) getrennt Diese Komponenten sind die Diastereomeren von 4'-O-PD. Die Komponenten mit den Rf-Werten von 0,46 und 0,65 wurden willkürlich als 4'-O-PDa (Isomeres a) bzw. 4'-0-PDb (Isomeres b) bezeichnet

Wird Adriamycin als Ausgangsmateria! verwendet, dann bestehen die unter Einsatz der vorstehend geschilderten Kieselgeldünnschichtchromatogrephie ermittelten Produkte aus 14-O-Tetrahydropyranyiadriamycin (14-O-PA) mit einem R_f-Wert von 0,12, wobei zwei weitere Komponenten ermittelt werden,

welche Diastercomere von 4',H Bis(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin iind, und zwar 4',14-Bis-(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin (Isomeres a), abgekürzt 4',14-Bis-OPAa bei eine.n Ri-Wert von 0,55, und 4',14-Bis-(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin (Isomeres b), abgekürzt 4',14-Bis-O-PAb mit einem Rf-Wert von 0,73.

Das Diastereomeren-Gemisch aus 4',14-Bis-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb kann auch in hoher Ausbeute durch Verätherung von 14-O-Tetrahydropyranyladriamycin oder eines Säureadditionssalzes davon mit 3,4-Dihydro-2H-pyran in einem inerten organischen Lösungsmittel sowie in Gegenwart eines sauren Katalysators hergestellt werden

Durch Ausnutzung des Reaktivitätsunterschiedes zwischen der primären C-14-Hydroxylgruppe und der sekundären C-4'-Hydroxylgruppe kann die Tetrahydropyranylgruppe an der C-14-Stellung von 4',14-Di-O-PAa und 4',14-DiO-PAb (oder ein SäureadditionssaL· davon) in selektiver Weise durch Hydrolyse oder A.lkoholyse entfernt werden, wobei in guter Ausbeute die entsprechenden Diastereomeren von 4'-O-PAa und 4'-0-PAb erhalten werden. Die Umwandlung der Tetrahydropyranyloxygruppe in eine Hydroxygruppe kann beispielsweise durch Hydrolyse mit angesäuertem Wasser (beispielsweise unter Einsatz einer anorganischen oder organischen Säure) oder durch Alkoholyse mit einem Alkohol oder Phenol (beispielsweise einem Ci-Ce-Alkanol) durchgeführt werden. Eine geeignete Methode besteht in einer Behandlung mit einer verdünnten Essigsäurelösung oder p-Toluolsulfonsäure/ Methanol-Lösung bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von ungefähr 30 Minuten bis 5 Stunden. Nebenreaktionen können dadurch auf einem Minimum gehalten werden, daß die Hydrolyse oder Alkoholyse im Dunkeln ausgeführt wird.

Die Produkte der Formel (I) können aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Methoden isoliert werden. Die Produkte der Tetrahydropyrariylierungsreaktion können durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches mit einer basischen Substanz (beispielsweise einem Alkalimetallcarbonat oder -bicarbonat), Extrahieren des neutralisierten Reaktionsgeiiiisches mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel (beispielsweise Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Methylisobutylketon), Extrahieren des organischen Extraktes mit einer verdünnten wäßrigen Säure (organischer Säure oder anorganischer Säure), Neutralisieren der wäßrigen sauren Schicht mit einer basischen Substanz, Extrahieren der neutralisierten wäßrigen Schicht mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und Konzentrieren des organischen Extrakts zur Trockne gewonnen werden. Das dunkelrote getrocknete Pulver, das auf diese Weise erhalten wird, kann durch Kieselgelsäulenchromatographie oder, im Falle einer kleinen Probe, durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt werden. Die Produkte der Hydrolyse- oder Alkoholysereaktion können aus dem Reaktionsgemisch durch Neutralisieren mit einer basischen Substanz, Extrahieren des neutralisierten Reaktionsgemisches mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und Konzentrieren des organischen Extrakts zur Trockne gewonnen werden.

Produkte, die in Form eines Gemisches von Diastereomeren (a und b Isomeren) erhalten werden, können in der vorstehend beschriebener. Weise durch Kieselgeldünnschichtchromatographie in die einzelnen Isomeren a und b in im wesentlichen reirer Form

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getrennt werden.

Die nach den vorstehend beschriebenen Reaktionsmethoden erhaltenen Produkte können in Form der freien Base oder eines Säureadditionssalzes gewonnen werden. Die Salze werden nach Methoden gebildet, isoliert, gereinigt und formuliert, wie sie im allgemeinen auf dem Gebiet der Salzbildung von Antibiotika angewendet werden, wobei sie durch Gefriertrocknen oder durch Ausfällen erhalten werden. Produkte, die in Form eines Säureadditionssalzes anfallen, können in die entsprechende freie Base umgewandelt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen folgende physikalisch/chemische Eigenschaften: sie existieren in fester Form als amorphes oder kristallines rotes Pulver. Als freie Basen sind sie in Äthylacetat, Chloroform und Äihanol löslich und gering löslich in Wasser, η-Hexan, Petroläther Äthanollösungen sowie saure Lösungen der Verbindungen besitzen eine rote

■> Farbe, ergeben eine positive Ninhydrinreaktion und bedingen keine Reduktion von Fehling'scher Lösung. Die Fig. 1 bis 14 und die Tabelle I zeigen die Elementaranalysen, die Schmelzpunkte (Zersetzung), die spezifischen Drehungen (C = 0,2 in CHCIi), das

in UV-Spektrum sowie das Spektrum im Sichtbaren (Methanol), das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Pr(IlIiHg) sowie das NMR-Resonanzspektruni (100 Mil /.CDC!,).

Tabelle 1

Physikalisch-chemische FJgenschalten von Pyranyldenvaten

Verbindungen

4'-0-1'Oa

An.ilyscwerie

(1) Elementaranalyse C: 60,82 (61,04)

H: 6,2" ■ 6,24)
( ) berechnet⁰/»* N: 2.:4( 2,22)

(2) Molekulargewicht 611,70

(3) Schmelzpunkt 193-196

( C) (Zersetzung)

(4) Spezifische
Dehnung

C - 0.2 CUCI,

(5) R,-Wert**

(6) Absorptionsspektrum im UV
und im Sichtbaren
(nm) (E₁ ¹I-J in
Methanol

125°

0.46

222 s (335), 234 (515)
252,5 (350), 289 (120)
480 (140), 496 (140)
532(80), 576(15)

4'-0-PDb C: 61,48(61,04)
FI: 6,37 ( 6,24)
N: 1.97 ( 2.22)

611.70

190-193 (Zersetzung)

[a]h- + 162.5° 4'.l4-His-O-PA.i

C: 61,12(60,89)
Fl: 6,75 ( 6,50)
N: 1,86 ( 1,92)

⁷11.83

180-186
(Zersetzung)

kl;,⁴ + 25°

0,65 0,55

222s (330), 234,5 220s (320), 234,5

(485) (480)

252,5 (350). 290 (115) 253 (360), 290 (110)

(135), 498 (140) 480s (145), 498 (155)

532(85). 576(20) 532 (110), 577 (40)

4',14-Bis-O-PAb

C: 61,25(60,89) Fl: 6.81 ( 6,50) N: 1,84 ( 1,92)

711,83

178-182
(Zersetzung)

la I;,⁴ + 125°

0,73

22Os (310). 234.5

(460)

253(350), 290(105)

480 s (140), 497(150)

532(105), 576 HO)

* Berechnet als Monohydrat,
** Kieselgeldünnschichtchromatographie.

CHCl : CH₃OH = 10 : 1 (V/V). 26 C.
Tabelle I (Fortsetzung)

Verbindungen

14-O-PA

Analysewerte 4'-0-PAa

4'-0-PAb

(1) Elementaranalyse

( ) berechnet %*

(2) Molekulargewicht

(3) Schmelzpunkt (⁰C)

(4) Spezifische Drehung C = 0,2 CKC13

C: 59,71 (59,52)
H: 6,23 ( 6,10)
N: 2,33 ( 2,17)

627,70

195-202
(Zersetzung)

J 162,5° C: 59,65 (59,52)
H: 6,33 ( 6,10)
N: 2,21 ( 2,17)

627,70

172-177
(Zersetzung)

Mb⁶+ 150°

C: 59,71 (59,52) H: 6,24 ( 6,10) N: 2,05 ( 2,17)

627,70

188-192
(Zersetzung)

+ 150°

(5) RrWert**

0,12 0.32

0,49

Tabelle I (Fortsetzung)

Verbindungen

I4-O-PA

Analysewerte

4'-0-PAa

4'-0-PAb

(6) Absorptionsspektrum
im UV und im Sichtbaren (nm)
Eil;in Methanol

220 s (340), 234 (530)
252,5 (400), 290 (115)
480s (160), 497 (170)
532 (135), 577 (65)

220 s (350), 234 (515)
252,5 (360), 290 (120)
480 (150), 497 (160)
532 (100), 577 (30)

220 s 065), 234 (480)
252(350),290(110)
480s (135), 498 (140)
531,5 (100), 580 (45)

* Berechnet als Monohydrat
** Kieselgeldünnschichtchromatographie.
CHCl₃: CH₃OH = 10 : 1 (V/V), 26X.

Was die Struktur der Verbindungen 4'-O-PDa, 4'-OPDb. 4'.14-BiS-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb. 14-O-PA. 4'-O-FAa und 4'-O-PAb gemäß vorliegender Erfindung betrifft, so läßt sich die Anzahl der Tetrahydr^pyranylgruppen, die mit den Verbindungen verknüpft sind, als entweder 1 oder 2 durch die Signalintensität des Methinpropons an der C-2-StelIung sowie des Methylenprotons an der C-3-, C-4-, C-5- und C-6-Stellung der Tetrahydropyranylgruppe ermitteln. Die Bindeposition der Tetrahydropyranylgruppe kann durch chemische Verschiebung des C-4'-Protons in dem Daunosaminanteil in Richtung auf ein niedrigeres Feld (im Vergleich zu demjenigen von Daunomycin) infolge der Bildung der glykosidischen Bindung an der C-4'-Stellung analysiert werden.

Der Unterschied der Konfiguration zwischer 4'-OPDa und 4'-O-PDb, 4'-0-PAa und 4'-O-PAb sowi 4',14-Bis-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb geht, wie mar annimmt, auf den Unterschied der absoluten Konfigura tion R und S an der C-2-Stellung der Tetrahydropyra nylgruppe zurück, da die chemischen Verschiebunge und Kupplungskonstanten (J-Wert) an dem C-2- un 3-3-Proton erheblich voneinander differieren. Di< absolute Konfiguration für die Isomeren a und b is jedoch noch unbekannt. Die Tabelle II zeigt di< chemischen Verschiebungen (aus den Fig.8 bis 14) ai der C-2-Stellung der Tetrahydropyranylgruppe sowi an dem C-4'-Proton des Daunosaminanteils.

Tabelle II	Proton	14-TH P*	DS 4'"
Verbindungen	4'-THP*	(ppm)	(ppm)
	(ppm)	-	3,62
	4,38	-	3,64
4'-O-PDa	4,72	-	3,70
4-O-PDb	4,36	-	3,70
4'-0-PAa	4,72	4,70	3,60
4'O-PAb	4,38	4,72	3,66
4',14-Bis-O-PAa	4.72	4.71	3,48
4',14-Bis-O-PAb	-	-	3,49
Ι4-Ο-ΡΛ	-
Daunomycin

* THP: Chemische Verschiebung an dem C-2-Methin der

substituierten Tetrahydropyranylgruppe.
** DS4': Chemische Verschiebungen dem C-4'-Methin von Daunosamin.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß die Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen wie weiter oben angegeben sind.

Was die antiobiotische Aktivität betrifft, so besitzen die Verbindungen der Formel (I) eine antimikrobiell Aktivität gegenüber einer Vielzahl von pathogene hi Mikroorganismen. Die minomalen inhibierenden Kon zentrationen (bestimmt nach der Brüheverdünnungsme thode) repräsentativer Verbindungen gemäß vorliegen der Erfindungen gehen aus der Tabelle IH hervor.

Tabelle ΙΠ

Minimale inhibierende Konzentration (MIC, mcg/ml)

Testorganismen	Getestete	Verbindungen	4'-O-PAa	4'-(J-PAb
	4'-0-PDa	4'-O-PDb	6,25	6,25
Staph. aureus	6,25	6,25
FDA209P			6,25	6,25
Staph. aureus Smith	12,5	3,12	3,12	3,12
Bacillus subtilis	3,12	1,56
NRRLB-558			«,25	6,25
Bacillus cereus	6,25	6,25
ATCC 10 702			3,12	3,12
Bacillus megaterium	6,25	3,12
APF			0,78	0,78
Sarcina lutea PCI 1001	0,39	0,39	3,12	3:12
Micrococcus flavus	0,78	1,56
FDA 16			3,12	3,12
Corynebacterium bovis	0,78	0,78
1810			>100	>100
Pseudomonas	>100	> 50
aeruminosa A 3			>100	>100
Escherichia coli NIHJ	>100	>100	100	100
Mycobacterium	6,25	6,25
smegmatis ATCC 607			>100	> 50
Candida albicans	> 50	25

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als Antibiotika, insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) zeigen eine ausgeprägte Antitumoraktivität mit niedriger Toxizität, wie aus Standardtests hervorgeht.

A. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine ausgeprägte inhibierende Wirkung auf das Wachstum sowie auf die Nukleinsäuresynthese von

L1210 Leukämiezellen in Kultur.

Beispielsweise wurden L1210-ZelIsn (5 · W Zellen/ml) auf ein RP. J 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640) auf geimpft, das 20% Kälberserum enthielt und bei 37° C in Gegenwart von 0,1 und 0,5 μg/ml der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem CO2-Inkubator gezüchtet. Die Anzahl der Zellen wurde periodisch gezählt und die Wachstumsinhibierungsrate (%)der Kontrolle ermittelt (vgl. Tabelle IV).

Tabelle IV	Tetrahydro-	Konzentration	0.5_μβ/ιηΙ
	pyranylderivaten auf L 1210 Zellen in Kultur	Inhibierungsrate (°/<	95,0
Wachstumsinhibierende Wirkung von	Verbindungen	0,1	88,8
		79,2	72,7
	74,6	81,1
4'-0-PDa	68,8	92,9
4'-0-PDb	65,9	58,3
Daunomycin	78,1	80,8
4'-0-PAa	7,6	72,1
4'-0-PAb	37,5	84.2
14-0-PA	25,5
4',14-Bis-O-PAa	70.7
4',14-Bis-O-PAb
Adriamycin

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Nukleinsäuresynthese wurde wie folgt untersucht:

1 · 10⁵ Zellen/ml von L1210 Zellen wurden in einem RPMI-Medium suspendiert, das 10% Kälberserum enthielt, bei 37° C während einer Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden in einem CCh-Inkubator vorgezüchtet, worauf die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Medium in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wurden. Nach 15 Minuten dauernden Bebrütung wurde ¹⁴C-Ur-

idin (0,05 μα/ml) oder »C-Thymidin (0,05 μΟ/ιηΙ) zugesetzt, worauf bei 37° C während einer Zeitspanne von 60 Minuten bebrütet wurde. Trichloressigsäure (TCA) (10%) wurde dem Bebrütungsmedium zum Abstoppen der Reaktion und zum Ausfällen der säureunlöslichen Materialien zugesetzt, worauf der Niederschlag dreimal mit 5 bis 10% TCA, gelöst in Ameisensäure, gewaschen wurde. Die Radioaktivität wurde gemessen und als 50%ige Inhibierungskonzentration des Einbaus zum Ausdruck gebracht

Tabelle V

50%-Inhibierungskonzentration von ¹⁴C-Thymidin- und ¹⁴C-Uridineinbau in L 1210 Zellen in Kultur

Verbindungen	50% Inhibierungskonzentration,	Thymidin
	ug/ml	0,28
	Uridin	0,32
4'-0-PDa	0,13	0,7-7
4'-0-PDb	0,20	0,37
Daunomycin	0,40	0,50
4'-0-PAa	0,20	0,42
4'-0-PAb	0,24	0,55
14-O-PA	0,17	0,97
4',14-Bis-O-PAa	0,23	2,1
4',14-Bis-O-PAb	0,24
A/namycin	0,50

B. Beim Testen gegenüber verschiedenen experimentellen Tiertumoren zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine ausgeprägte Antitumoraktivität mit einer verminderten Toxizität im Vergleich zu Adriamycin und Daunomycin. Daher sind die Verbindungen therapeutisch geeignet zur Inhibierung des Wachstums von Säugetiertumoren.

Beispielsweise wurden BDF|-Mäuse intraperitoneal mit 1 ■ 10«-Zellen/Maus L1210 Leukämiezellen beimpft.

24 Stunden nach der Beimpfung wurden an die Mäuse die erfindungsgemäßen Verbindungen intraperitoneal einmal täglich während 10 aufeinanderfolgender Tage verabreicht, worauf während einer Zeitspanne von 45 Tagen beobachtet wurde. Die Antitumoraktivität geht

aus dem gesteigerten Verhältnis der Überlebenstage

•ti (T/C, %) zu den Überlebenstagen von Kontrollmäusen, die mit physiologischer Salzlösung gespritzt worden sind, hervor. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle VI.

Tabelle VI

Antitumoraktivität von Tetrahydropyranylderivaten (T/C, %)

Verbindungen	Dosis (mg/kg/Tag)	2,5	1.25	0,6	0,3	0.15
	5	>320	122	115	96	90
4'-0-PDa	>32O	256	122	115	103	90
4'-0-PDb	>32O	173	180	187	120	127
4'-0-PAa	-	>36O	>373	293	160	113
4'-0-PAb	>375	130	126	113	110	103
14-O-PA	142	115	109	96	103	96
4',14-Bis-O-PAa	154	109	103	103	96	115
4',14-Bis-O-PAb	161	231	218	230	165	128
Adriamycin	toxischer Tod

Aus den Ergebnissen bezüglich toxischem Tod und Körpergewichtsverlust der bei diesem Versuch eingesetzten Mäuse geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Derivate eine Toxizität besitzen, die um ein Drittel bis die Hälfte niedriger ist als die Toxizität von Adriamycin und Daunomycin, den Ausgangsmaterialien gemäß vorliegender Erfindung.

C. Die gemäß A und B ersichtlichen ausgeprägten Antitumorwi« kungen wurden durch die Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Inaktivierung durch hepatische NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase bestätigt NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase, die aus einem Rattenleberhomogenat gereinigt worden war, wurde mit den erfindungsgemäßen Verbindungen bei 25° C während einer Zeitspanne von 25 Minuten in einer Stickstorfgasphase bebrütet Das dabei gebildete Produkt, und zwar 7-Desoxyaglykon, wurde ermittelt, wobei die Ergebnisse aus der Tabelle VII hervorgehen.

Tabelle VII

Stabilität von TetrahydropyranySderivaten gegenüber Ratten-NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase

Verbindungen

Produkt (nMol/Rohr) (7-Desoxyglykon)

4'-0-PDa	37,3	0,2 mM
4'-0-PDb	46,6	O₁IM
Daunomycin	65,8	0,1 mM
4'-0-PAa	10,9	4,6 μg/ml
4'-0-PAb	15,8	(Tris-HCl = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)
14-O-PA	18,4
4',14-Bis-O-PAa	13,1
4',14-Bis-O-PAb	15,8
Adriamycin	47,2
Zusammensetzung der Reaktionsmischung:
NADPH
Tri£-HCl(pH8,0)
Substrat
Enzym

Die Verbindungen 4'-0-PDa, 4'-O-PDb, 4',14-Bis-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-0-PAa und 4'-0-PAb sowie ihre Säureadditionssalze sind neue Antibiotika, die sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin eignen. Sie besitzen eine ausgeprägte inhibierende Wirkung gegenüber bösartigen Säugetiertumoren, und zwar sowohl gegenüber festen als auch aszitischen Typen.

Durch die Erfindung wird ferner eine pharmazeutische Zubereitung geschaffen, die aus einer therapeutisch wirksamen antimikrobiellen oder tumorinhibierenden Menge von 4'-0-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-Bis-O-PAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-O-PAa oder 4'-O-PAb oder einer Mischung davon oder einem Säureadditionssalz davon in Kombination mit einem pharmazeutischer Träger oder Verdüi nungsmittel besteht. Derartige Zubereitungen können in jeder pharmazeutischen Form hergestellt werden, die für eine parenteral Verabreichung geeignet ist.

Zubereitungen für eine parenteral Verabreichung bestehen aus sterilen wäßrigen oder nichtwäßrigen Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können ferner in Form von sterilen festen Zubereitungen hergestellt werden, die in sterilem Wasser, in einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einem anderen sterilen initiierbaren Medium unmittelbar vor der

ι ο Verwendung aufgelöst werden können.

Die tatsächlich bevorzugten Dosierungsmengen schwanken in Abhängigkeit von der jeweils eingesetzten Verbindung, der jeweils formulierten Zubereitung, der Verabreichungsmethode sowie der jeweiligen Stelle, dem befallenen Säugetier sowie der behandelten Krankheit. Im allgemeinen werden die Verbindungen intraperituneal, intravenös, subkutan oder lokal in nichtmenschliche Säugetiere sowie intravenös oder lokal in Menschen eingespritzt Viele Faktoren, weiche

die Wirkung des Wirkstoffes ir ;difizieren, sind zu berücksichtigen, beispielsweise das Altrr, das Körpergewicht, das Geschlecht, die Nahrung, die Verabreichungszeit, der Verabreichungsweg, die Menge an Ausscheidung, der Zustand des Patienten, die Wirkstoffkombinationei, die Reaktionssensibilitäten sowie die Schwere der Krankheit. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Optimale Verabreichungsrate bei einer vorherbestimmten Kombination von Bedingungen

lassen sich unter Anwendung herkömmlicher Dosierungsermittlungstests unter Berücksichtigung der vorstehenden Richtlinien ermitteln.

Als antimikrobielle Mittel werden die Verbindungen im allgemeinen in der Weise verabreicht daß die

J5 Konzentration des Wirkstoffs größer ist als die minimale inhibierende Konzentration des jeweils behandelten Organismus.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

·*'· Beispiel!

4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin
(4'-O-PDaund4'-O-PDb)

Zu einer Lösung von 60 mg Daunomycintiydrochlorid

4> in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid weiden 1 ml 3,4-Dihydro-2H-pyran und eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur im Dunkeln wird das Reaktionsgemisch zu 20 ml einer wäßrigen 0,1 η

>n Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben und mit Chloroform (4-10 ml) extrahiert Nachdem der <"hloroformextrakt mit l%iger Essigsäurelösung (iO · 10 ml) extrahiert worden ist. wird die erhaltene saure wäßrige Schicht mit Natriumhydrogencarbonat neutra-

ϊ5 lisiert und dan mit Chloroform (!0 · 20 ml) reextrahiert. Die Chloroformschicht vird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Die 44 mg des dabei erhaltenen Rückstandes werden ί jf eine präparative Kieselgeldünn-

bo Schichtchromatographieplatte aufgebracht und mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (10 :1), (V/V) entwickelt.

Kieselgelbanden, die einem Rf-Wert von 0,46 und 0,65 entsprechen, werden aus der Dünnschicht herausgekratzt, mit der G.loroform/Methanol-Mischung (10 : 1. V/V) eluiert und zur Trockne konzentriert. Jeder Rückstand wird in Methylenchlorid aufgelöst, durch Zugabe von tert.-Butanol unter Kühlen eingefroren und

unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 10,1 mg eines rötlich braunen Feststoffs aus 4'-0-PDa sowie 103 rng eines roten Feststoffs aus 4'-O-PDb aus den Fraktionen mit einem Rr-Wert von 0,46 bzw. 0,65.

4'-O-PDa und 4'-0-PDb sind Diastereomere von 4'-O-Tetrahydropyranyldaunomycin. Ihre physikalischchemischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I hervor.

Beispiel 2

4',l4-O-Bis-(tetrahydropyranyl)-adriamycin

(4',14-BiS-O-PAa und 4',14-Bis-O-PAb) und

14-O-Tctrahydropyrany !adriamycin (14-O-PA)

aus Adriamycin

Zu einer Lösung von I 30 mg Adriamycinhydrochlorid in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 2 ml 3.4-Dihydro-2H-pyran und eine kaialytische Menge p-Toluolsulfonsäure gegeben. Nach Stehenlassen während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Reaktionsgemisch zu 20 ml einer wäßrigen 0.1 η Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben und mit 5 ■ 20 ml Äthylacetat extrahiert. Nach dem Extrahieren der Äthy'acetatschicht mit einer l%igen Essigsäurelösung (4 · 40 ml) wird die wäßrige saure Schicht mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (10 · 20 ml) extrahiert. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Die 160 mg des erhaltenen Feststoffs werden durch eine präparative Kieselgeldünnsehichtchromatographie entwickelt und gereinigt, wobei eine Chloroform/Methanol-Mischung (10:1. V/V) verwendet wird. Die Banden oei R_f-Werten von 0,12 und 0,55 werden aus der Dünnschicht ausgekratzt und nach der Methode von Beispiel 1 gereinigt.

Man erhält 35 mg eines roten Feststoffs aus 14-O-PA, 16 mg eines roten Feststoffs aus 4',14-Bis-O-PAa und 14 mg eines roten Feststoffs aus 4',14-Bis Ü-PAb aus den Fraktionen mit R_f-Werten von 0,12,0,55 bzw. 0,73.

4',14-Vis-O-PAa und 4'.14-BiS-O-PAb sind Diastereomere von 4',!4-Bis(O-Tetrahydr':pyranyl)-adriamycin. Ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I hervor.

Beispiel 3

4'. 14-Bis(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin aus
H-O-Tetrahydropyranyladriamyciti

Zu einer Losung von 35 mg 14-O-PA in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,5 ml 3,4-Dihydro-2H-pyran und eine katalytisch^ Menge p-Toluolsulfonsäure gegeben. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 40 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln wird das Reaktionsgemisch zu 10 ml einer wäßrigen 0,02 η Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben und mit Äthylacetat (4 - 5 ml) extrahiert Nach dem Extrahieren der Äthylacetatschicht mit l%igsr Essigsäurelösung (3 - 10 ml) wird die saure wäßrige Schicht mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (5-10 ml) extrahiert Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert

Der erhaltene Rückstand wird unter Anwendung der Kieselgeldünnschichtchromatographiemethode gemäß Beispiel 2 Chromatographien. Man erhält 8,4 mg eines roten Feststoffes aus 4',14-Bis-O-PAa und 8,1 mg eines roten Feststoffs aus 4',14-Bis-O-PAb aus den Fraktionen -. mit Rf-Werten von 0,55 bzw. 0,73. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften fallen mit denjenigen der Verbindungen, die gemäß Beispiel 2 erhalten worden sind, zusammen.

Beispiel 4

4'-O-Tetrahydropyranyladriamycin aus
4'-,14-Bis(O-tetrahydroDyranyl)-adriamycin

a) 12,4 mg 4',14-Bis-O-PAa werden in 1,5 ml einer ι > 10%igen F.ssigsäurelösung aufgelöst und 4,5 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird zu 10 ml Wasser gegeben, mit Natriumhydrogencarbonatpulver neutralisiert und mit Chloroform (2 ■ 15 ml) extrahiert.

>n Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Die 11 mg des erhaltenen Rückstands werden nach einer Kieselgeldünnschichtehromatographiemethode, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, gereinigt,

2-i wobei eine Chloroform/Methanol-Mischung (10:1, V/V) verwendet wird. Die Hauptbande bei einem Rf-Wert von 032 wird ausgekratzt und mit der Chloroform-Methanol-Mischung (10:1, V/V) eluiert. Das Eluat wird zur Trockne konzentriert. Der

κ» Rückstand wird in Methylenchlorid aufgelöst, wobei tert.-Butanol unter Kühlen zum Einfrieren zugesetzt wird und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 7 mg eines roten Feststoffs aus 4'-0-PAa. Die physikalischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I

si hervor.

b) 16 mg 4',14-Bis-O-PAb werden in 5 ml einer 0.05 π p-Toluolsulfonsäure/Methanol-Lösung aufgelöst und bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde im Dunkeln stehengelassen. Das Reaktionsge-

-ifi misch wird mit 10 ml einer wäßrigen 0,01 η Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert und mit Chloroform (4 10 ml) extrahiert Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und gemäß (a) behandelt. Man erhält 7,2 mg eines roten Feststoffs von

j-, 4-O-PAb, das einen RcWert von 0,49 bei der Kieselgeldünnschichtchromatographie unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zeigt Die physikalisch-chemischen Eigenschaften gehen aus der Tabelle I hervor.

so 4'-O-PAa und 4'-O-PAb sind Diastereomere von 4'-0-Tetrahydropyranyladriamycin.

Beispiel 5

Salzbildung

Als Beispiel für die Methoden, die man zur Herstellung von Säureadditionssalzen anwenden kann kann die freie Base von 4'-O-PDa, 4'-O-PDb, 4',14-Bis-OPAa, 4',14-Bis-O-PAb, 14-O-PA, 4'-OPAa oder 4'-O-PAb in Äthylacetat aufgelöst werden, woraul ungefähr 1 Äquivalent HQ zugesetzt wird. Beim Gefriertrocknen wird das entsprechende Hydrochlorid erhalten.

Hierzu 14 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Tetrahydropyranylether von Daunomycin und Adriamycin der allgemeinen Forme!

O OH

C-CH₂R¹

OH