SE443565B - Tetrahydropyranylderivat av antracyklinglykosider - Google Patents

Description

i7soszo4-5 2 I i att tillhandahålla nya tetrahydropyranyleterderivat av adriamycín och daunomycin, som har den önskade starka antítumörverkan och låg toxicítet. - Översikt av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser vissa nya antracyklinglykosid- derivat med den allmänna strukturformeln vari R1 betecknar en väteatom, en hydroxyl- eller tetrahydropyran- -2-yl-oxigrupp och R2 betecknar en hydroxyl- eller tetrahydropyran- -2-yl-oxigrupp, varvid då R1 betecknar en väteatom eller hydroxyl- grupp, R2 betecknar en tetrahydropyran-2-yl-oxigrupp, och de icke toxiska syraadditionssalterna därav, varvid stereoisomera former, vilka skiljer sig åt i konfigurationen vid C-2-ställningen av tetrahydropyran-Z-yl-oxigruppen i betydelsen av R2, kan förekomma.

Föreningarna, som innefattas inom ramen för formeln I, uppvisar bå- de antimikrobiell verkan och antitumörverkan.

Såsom det användes häri och i kraven avser uttrycket "icke toxiskt syraadditíonssalt" att omfatta alla de organiska och oorganiska salter av föreningarna med formeln I, vilka salter vanligen användes såsom väsentligen icke toxiska salter av medicinska medel innehållande aminfunktioner. Belysande exempel skulle vara de salter, som bildas från sådana syror som svavel- syra, fosforsyra, saltsyra, bromvätesyra, salpetersyra, fosfor- syrlighet, ättiksyra, propionsyra, maleinsyra, oljesyra, palmitin- syra, citronsyra, bärnstenssyra, vinsyra, fumarsyra, glutaminsyra, pantotensyra, laurylsulfonsyra, mctansulfonsyra, naftalensulfon- syra, etc.

Föreningarna, som motsvaras av formeln I, med en tetra- hydropyranyloxisubstituent såsom R2 existerar såsom de individuella diastereomererna (godtyckligt betecknade häri såsom isomer a och :s ' 7808304-5 isomer b), som skiljer sig åt i konfigurationen vid C-2-stäl1- ningen av tetrahydropyranyloxigruppen, eller såsom blandningar av sådana isomerer. Inom ramen för föreliggande uppfinning om- fattas de separata diastereomererna så väl som de diastereomera blandníngarna.

Beskrivning av ritningarna Fig. 1 visar det infraröda absorptíonsspektrumet av 4'-0-tetrahydropyranyldaunomycin (isomer a).

Pig. 2 visar det infraröda absorptionsspektrumet 4'-0-tetrahydropyranyldaunomycin (isomer b).

Pig. 3 visar det ínfraröda absorptionsspektrumet (KBr) av 4',14-bis(0-tetrahydropyranyl)adriamycin (isomer a).

Pig. 4 visar det infraröda absorptionsspektrumet 4',14-bis(0-tetrahydropyranyl)adriamycin (isomer b). §ig¿_§ visar det infraröda absorptionsspektrumet (KBr) av 14-0-tetrahydropyranyl-adriamycin.

Pig. 6 visar det ínfraröda absorptionsspektrumet 4'-0-tetrahydropyrianyl-adriamycin (isomer a).

Pig. 7 visar det infraröda absorptíonsspektrumet (KBr) av 4'-0-tetrahydropyranyl-adriamycín (isomer b).

Fig. 8 till 14 visar proton NMR-spektra (100 MHz, CDC13) av föreningarna, som visas i samma ordníngsföljd som vid deras (KBr) (KBr) av (KBr) av (Kßr) av *1 infraröda absorptionsspektra ovan.

Detaljerad beskrivning Adriamycin och daunomycín, utgångsmaterial för framställning av:finenhuærna enligt föreliggande uppfinning, kan representeras av formlerna daunomycin 7808304-5 4 och 0 _ . adriamycin 51 --0 4' CHS 1, I uo 3 Zl NH Daunomycin har två reaktiva hydroxylgrupper (exklusive de två fenoliska hydroxylgrupperna) vid C-9 och C-4' och adríamycin har tre reaktiva hydroxylgrupper (igen exklusive de två fenolíska grupperna) vid C-9, C-14 och C~4'. Man har nu upptäckt att det under rätta förhållanden finns skillnader i reaktiviteten hos de olika reaktiva hydroxylgrupperna i dessa föreningar och att dessa skillnader kan utnyttjas för att framställa önskvärda nya derivat.

I all synnerhet har det visat sig, att när den fria basen av adriamycin eller daunomycin eller ett syraadditionssalt därav (t.ex. hydrokloriden) suspenderas eller löses i ett inert organiskt lösningsmedel och bringas att reagera med 3,4-dihydro-ZH-pyran i närvaro av en syrakatalysator olika nya tetrahydropyranyleter- derivat av utgångsglykosíderna bildas. De speciella bildade reaktionsprodukterna, förhållandena av de olika produkterna och reaktionsutbytena varierar med använda reaktionsförhållanden, t.ex. lösningsmedel, syrakatalysator, förhållande av reaktanter, temperatur, reaktionstid, etc.

Ett förfarande för framställning av en antracyklinglykosid med den allmänna formeln I eller ett icke toxiskt syraaddítions- salt därav, omfattar reaktion av adriamycin eller daunomycin eller ett syraadditionssalt därav med 3,4~dihydro-2H-pyran- i ett inert organiskt lösningsmedel och i närvaro av en sy- rakatalysator för att omvandla en eller två av hydroxylgrupperna vid C-4' eller C-14 till tetrahydropyranyloxigrupper och, om så s 7808304-5 önskas, selektivt omvandla C-14-tetrahydropyranyloxígruppcn hos en ditetrahydropyranylprodukt till en hydroxylgrupp genom alkoholys eller hydrolys och, om så önskas, utföra ett eller flera av de ytterligare stegen, som utväljes från (a) omvandling genom i och för sig kända metoder av en produkt í form av den fria basen eller syraaddítionssaltet därav till ett icke toxiskt syraadditíonssalt därav eller (b) omvandling genom i och för sig kända metoder av en produkt i form av ett syraaddítíonssalt till den motsvarande fria basen.

De allmänna reaktionsförfarandena för framställning av föreningarna med formeln I kan lättare ses från följande reak- tíonsschema: Schema I / O s rukatalzsator daunomycin 4'-O-PDa 4'-0-PDb \ E c Vsossoßz-swiu: 6 ï CH (å \ C-CHÉ CH OH / 0 OK 0:33 __ syrakatnlyfsutor + o --------/ “s Ho Adriamyc in m2 O ll f 0 OR C-CHÉ 0 OCH O OH ï ln-o-m 0 “s OH OH 3 HO 0 ) 0 H 0 O O 9 o mango-O ox-r ' oc 3 b, ' ,1=s-a1-a_r,x.~_ 4 ' ,11æ-<1 L-o-vaz, CV L .

Ryd rolys C 1161' a] koho 1 y-s O ° I 4 uo-rm y H2 h v -o-mn In :n 7808304-5 \J Omvandling av en reaktiv hydroxylgrupp hos adriamycin eller daunomycin till en totrahydropyranyloxígrupp utföres genom företring.

Utgangsglykosiden kan vara i fri bas-form eller i form av ett syraadditionssalt. Emedan syraadditionssalter av tetrahydro- pyranyleterprodukterna i reaktionen kan omvandlas genom kända metoder till de motsvarande fria bas-produkterna eller till icke toxiska syraadditionssalter, är det inte nödvändigt för ett utgångs- salt att vara icke toxiskt.

Vilket icke reaktivt organiskt lösningsmedel som helst kan användas för tetrahydropyranyleringsreaktionen. Exempel på lämpliga lösningsmedel omfattar bensen, toluen, xylen, dimetyl- formamid, acetonitril och tetrahydrofurna. Reaktionslösnings- medlet kan vara ett enda lösningsmedel eller en blandning av lös- ningsmedel. Ett mest lämpligt lösningsmedel är vattenfri dimetyl- formamid.

Syrakatalysatorn kan vara vilken organisk (t.ex. myrsyra, trifluoroättiksyra) eller oorganisk (t.ex. saltsyra, Eosforsyra) syra som helst. En lämplig grupp av syrakatalysatorer omfattar de organiska sylfonsyrorna. Mera lämpliga katalysatorer är de aromatiska sulfonsyrorna, såsom p-toluensulfonsyra och bensen- fulfonsyra. En mest lämplig katalysator är p-toluensulfonsyra.

Reaktionstemperaturen är inte kritisk. Goda resultat i företringsreaktionen har uppnåtts vid rumstemperatur, fastän temperaturer högre och lägre än denna även kan användas.

Reaktionstiden kommer att variera med de speciella utvalda processförhâllandena, t.ex. temperatur, katalysator, lösnings- medel, etc. Val av optimal reaktionstid för att alstra en specifik produkt eller blandning av produkter kan göras med rutinexperiment under användning av tunnskiktsanalysen beskriven nedan. I allmänhet har emellertid reaktionstider från cirka 20 timmar till cirka 50 timmar visat sig ge fördelaktiga resultat.

Under det att som nämndes ovan de speciella reaktions- produkterna och reaktionsutbytet är beroende på sådana faktorer såsom koncentrationen av utgangsmaterialen, förhållandet av reaktanter etc, är när man använder daunomycin såsom ett utgångs- matorial, de huvudsakliga produkterna 4'-0-tetrahydropyranyl- ~daunomycin (förkortad såsom 4'-0-PD) och 9-0-tetrahydropyranyl- ~daunomycin (förkortad såsom 9-0-PD). Dessa produkter kan upp- täckas i reaktionsblandningen genom silíkalgektunnskíktskroamto- 7808304-5 s u: UI 40 grafi (Merck Co. "60Fë54) under användning av en blandning av kloroform-metanol-ättiksyra (80:20:4 volym/volym) sasom ett framkallande medel. Produkterna framträder vid Rf0,74 (4'-0-PD) och Rf 0,15 (9-0-PD).

Produkten 4'0-PD separerades i tvâ komponenter med Rf- värden på 0,46 och 0,65 med silkagel-TLC-kromatografi under användning av en blandning av kloroform-metanol (1011 volym/ volym). Dessa komponenter befanns vara díastereomercr av 4'-0-PD.

Komponenterna Rf 0,46 och RE 0,65 betecknades godtyckligt såsom 4'-0-PDa (isomer a) respektive 4-0-PDb (isomer b).

När man använder adriamycin såsom utgangsglykosid var huvudprodukterna, som upptäcktes genom ovan nämnda si1kagel-TLC- -förfarande, 14-0-tetrahydropyranyl-adriamycin (14-0-PA) med Rf = 0,12 och tvâ komponenter, som är diasteromerer av 4',14-di(0- tetrahydropyranyl)-adriamycin, dvs. 4',14-di(0-tetrahydropyrany1)- adríamycín (isomer a), förkortad 4',14~di-0-PAa, vid kf 0,55 och 4',14-di(0-tetrahydropyranyl)adriamycin (isomer b), förkortad 4',14-di-0-PAb, vid Rf 0,73. Föreningen 4',14-di(0-tetrahydro- pyranyl)adriamycin kan även benämnas 4',14-bis(0-tetrahydro- pyranyl)adriamycin.

Den diastereomera blandningen av 4',14-di-0-PAa och 4',14- di-0-PAb kan även framställas i högt utbyte genom att företra 14-0-tetrahydropyranyl-adriamycin eller ett syraaddítíonssalt därav med 3,4-dihydro-2H-pyran i ett inert organiskt lösnings- medel och i närvaro av en syrakatalysator.

Genom att utnyttja skillnaden i reaktivitet mellan den C-14 primära hydroxylgruppen och den C-4' sekundära hydroxyl- gruppen kan tetrahydropyranylgruppen vid C-14 hos 4'-14-di-0- PAa och 4',14-di-0-PAb (eller ett syraadditíonssalt därav) selektivt borttagas genom hydrolys eller alkoholys för framställ- ning i gott utbyte av de motsvarande diastereomerorna av 4'-0-PAa och Ä-0-PAb. Omvandling av tetrahydropyranylgruppen till en hydroxígrupp kan utföras exempelvis genom hydrolys med surgjort vatten (dvs. vattenhaltig oorganisk eller organisk syra) eller genom alkoholys med en alkohol eller fenol (t.ex. en CT-Cêalkanol).

Ett lämpligt förfarande omfattar behandling med utspädd ättik- syralösníng eller p-toluensulfonsyra-metanollösning vid rums- temperatur under en tid av frän cirka 30 minuter till 5 timmar.

Sídoreaktion kan göras till ett minimum genom att utföra hydro- lysen eller alkoholysreaktionen i mörker. 40 9 7803504-s Produkterna med formeln I kan isoleras från reaktionsbland- ningen med vanliga förfaranden. Sålunda kan produkter fran tetra- hydropyranyloríngsreaktionen utvinnas genom neutralisering av reaktionsblandningen med en basisk substans (t.ex. ett alkali- metallkarbonat eller bikarbonat), extraktion av den neutraliserade reaktionsblandningen med ett med vatten icke blandbart organiskt_ lösningsmedel (t.ex. etylacetat, kloroform, metylenkloríd, metyl- isobutylketon, etc.), extraktion av det organiska extraktet med utspädd vattenhaltig syra (organisk eller oorganisk), neutralisering av det vattenhaltiga sura skíktet med en basisk substans, extrak- tíon av det neutraliserade vattenhaltiga skiktet med ett med vatten icke blandbart organiskt lösningsmedel och koncentration av det organiska extraktet till torrhet. Det sålunda erhållna mörkröda torkade pulvret kan renas genom silkagelkolonnkromatografi eller, vid fallet av ett litet prov, genom preparativ tunnskikts- kromatografi. Produkterna från hydrolys- eller alkoholysreak- tionen kan utvinnas från reaktionsblandningen genom neutralisa- tion med en basisk substans, extraktion av den neutraliserade reaktionsblandníngen med ett med vatten icke blandbart organiskt lösningsmedel och koncentration av det organiska extraktet till torrhet.

Produkter erhållna i form av en blandning av diastereomerer (a- och b-isomerer) kan separeras såsom beskrivits ovan med silikageltunnskiktskromatografi i de individuella a- och b- isomererna i väsentligen ren form.

Produkter, som erhållits i ovanstående reaktionsförfaranden, kan utvinnas i form av den fria basen, ett syraadditionssalt eller ett icke toxiskt syraadditionssalt. De fria bas-produkterna kan lätt omvandlas till icke toxiska syraadditionssalter, som är väsentligen ekvivalenta i terpeutisk verkan med de motsvarande fria bnscrna. Salterna bildas, isoleras, renas och beredos med metoderna, som vanligen användes i snltheredning nv antibiotika, t.ex. antracyklinglykosidantibiotika. Sålunda kan den fria basen bringas att reagera med en icke toxisk syra i ett lämpligt lös- ningsmedel och saltet utvinnas genom lyofílisering eller genom Fällning med ett antilösníngsmedel, dvs. ett lösningsmedel, i vilket det önskade saltet endast är svagt lösligt. Produkter i form av ett syraadditíonssalt kan omvandlas till den motsvarande fria basen genom neutralisation med en basisk substnns.Slntligen kan toxiska syraadditionssalter omvandlas till icke toxiska syra- 7808304-5 1,0 additionssalter genom neutralisatíon och behandling med en icke toxisk syra såsom beskrives ovan.

Fysikalisk-kemiska egenskaper Föreningarna enligt föreliggande uppfinning existerar i fast form såsom ett amorft eller kristallint rött pulver. Såsom fria baser är de lösliga i etylacetat, kloroform och etanol, svagt lösliga i vatten, n-hexan, petroluemeter etc. Etanollösníngar och sura lösningar av föreningarna har en röd färg, ger en positiv ninhyfirinreaktion och reducerar inte Fehlings lösning. Fígnrer 1-14 och tabell 1 visar elementaranalys, smältpunkt (sönder- delning), specifik vridning (C = 0,2 i CHCL3) UV och synligt absorptionsspektrum (metanol), infrarött absorptíonsspektrum (KBr-tablett) och kärnmagnetiskt resonansspektrum (100 MHz, CDC13).

H 7808304-5 Qwcofiw _ maflmswswmw ß_|O|wUm ¶ ß.|O|wUv @.|_ß|mw|O|fi>m »..A@|@w|O|w>v >:u~%fimmwm amfim fi_V mwmaoaflmwf nu oc_mN ~o_.o»v nu ødvßw fim¿.s@v nu o_~_w ñaovmmv nu @fl.Nw ^oo_m@w šää :n 93 A 9%: :n Fä m FNS :N Fä ñ FE: F 92 m P2; u.. c ä? z" PE A PNS z" 32 n få z" få A få. 2" få n fo: RV varwfåíwfi ïrä 233 :få ïfå G. mæäfivsuwfi BT/...mß äcïiâ :å Lä. SMWLMWN A09 ^mm:mwfimmH:.v fimm:mmw@oH:.U ^mm:@mwmm~D.u ~wmdmoHmm~b.~ ~ßv mfimnwmww Sflšäw 11% + 3% É .W + ärm.. 3%» + än 3%» + :wo n u PN nmnf flwg wm| wamm *» a.ß@ :.@w ovmw ø.¶w fiov G< m%dwwm NNNm^wwwv.Nu>^mgmv ~NNm^mwov~mwß“m^>wwq NNomfiw~ov.Nuß~m^>mov NNomnmAcuvww»“wfi@oov wcmøfififiwob Nw~,w^uwov.~mwñ¿NcU NmN.m~wwov.woc^__mU Nww^wmcv.Nwom¿_ov Nwm^wwov.~@o-om4 wworflficš »æc^_>ov.»w@^_@ov >mo^_wwv.»wwfi_@cv >mom~_>wu.ßmw~_wwv @wom~_»og.@@<~¿m@v fiflšv wmNmmov,mwofi_mv mmN^wwv.mov mwN^¿omv.mwo^»ov flw Am _nEv *wøfimwzmm mwmoë äosorwawmfi ** mwwwwmmmw earn nmnwmnnmwor u don; ^ wa 7808304-5 wowfim. m< fiævmflælw .awoswnmmw _ flà|c|w> ß.|O|v>m ß_|O|fl>ï >:m~%flwwwc zman ^_v m~mšo:~mw| ”En än» .k mv wwfl. w nu m@.<_ ^w@,m~v mn @.~w ~ @._oV zu ~.ww fi_N.A~v ~ an w@.@m ^w@.m~, :U @.ww A @._@V vu N.N_ Å ~._¶v nu w@.¶_ ~w@.m~u mn @.~» ^ @._oV zu ~.cm A ~.ä¶, ñwv Zo~mw%~ fiwv mwwHáw==w» _@m>LN@~ _¶Nk@_¶¶ _w@\<_@~ A nu ^mm:mwHmoH:.~ ^mm:@o«møH:.V ^mmb@m~@mHs.u hav wwonwmww n n o.N nznww N» *__ U + _@~,w0 A2; w@ + .mao _ .Nm øfiæd + dmoo .k ñmv wfi| c.¿N =.M~ o ha u Aag c< m%dHwm mvmofivfiwos mwmwfifizä fisav ¿w _n5 m ~N@mflwà@v.~w>^mw@V NwN.m~>Q=V.~@c^__mv ßw=m^_@ov.>@¶^_¶QV wmN^@wmv.w¶Q^ ßmv wwom^wmov.Nwnñm_mU NmN.w^møcv.moo^dNov aæo^¿wsv.ßm¶nAocv wwN^áocv.w<< A wav -cmñwmmv.ww~maæ:v NmN^wwoU.~osn_¿oq ßmomfi¿wmQ.ßmw^_>ov mM_.w^_@@v.mm=^ »mv *_ø nïnfiwnnzwoz n Jc". ^ mkv 13 7808304-5 Med avseende pá strukturen av föreningarna 4'-0-PDa, An-o-Pnbfix',14-<1i-o-PA@., 4',14-<11-n-PA1>, 14-o-PA, 4'-o-P1\a och 4'-0-PAb enligt föreliggande uppfinning kan antalet tetrahydro- pyranylgrupper bundna vid föreningarna analyseras till att vara antingen en eller två genom signalintensiteten av metinprotonen vid C-2 och metylenprotonen vid C-3, C-4, C-5 och C-6 ställ- ningarna hos tetrahydropyranylgruppen. Bindníngsställníngen i tetrahydropyranylgruppen kan analyseras genom den kemiska för- skjutníngen av C-4' protonen i daunosamindelen mot ett lägre fält (jämfört med det för daunomycin) beroende på bildning av glykosid- bindningen vid C'-4.

Skillnaden i konfiguration mellan 4'-0-PDa och 4'-O-PDb, 4'-0-PAa och 4'-0-PAb och 4',14-di-0-PAa och 4',14-di-0-PAb anses vara skillnaden i absolut konfiguration R och S vid C-2 av tetra- hydropyranylgruppen emedan de kemiska förskjutningarna och kopp- lingskonstanterna (J-värde) vid C-2 och C-3 protonerna skiljer sig från varandra. Den absoluta konfigurationen för a- och b- isomererna är emellertid ännu okänd. Tabell 2 visar de kemiska förskjutningarna (från fig. 8-14) vid C-2 av tetrahydropyranyl- gruppen och vid C-4' protonen av daunosamindelen.

Tabell 2 Proton 4'-THP* 14-THP* DS4'** (ppm) (ppm) (ppm) Förening 4'-O-PDa ,š8 - 3,52 4'-0-PDh 4,72 - 3,54 4'-0-PAa 4,36 - 3,70 4'-0-PAb ,7Z - 3,70 4',14-di-0-PAa 4,3\ 4,70 3,60 4',14-di-O-PAb 4,72 4,72 3,66 14-Û-PA - 4,71 3,48 Daunomycin - - 3,49 *THP: Kemisk förskjutning vid C-3 mctin hos substitucrnd tetrahydropyrnnylgrupp **DS4':Kemísk förskjutning vid C-4' metin hos daunosamin. 7808304-5 14 Från ovanstående bestämdes strukturerna hos föreningarna enligt föreliggande uppfinning att vara såsom angivits ovan.

Antihiotisk verkan Föreningarna med formeln I har visat sig ha antimikrobiell verkan mot en mängd patogena mikroorganismer. De minimala hämmande koncentrationerna (bestämda genom odlingslösningsspädningsmetoden) för representativa föreningar enligt föreliggande uppfinning visas i tabell 3.

Tabell 3 Minimal hämmande koncentration (MIG, mcq/ml) Testad förening Försöksorganismer 4'-0-PDa 4'-0-PDb 4'-0-PAa 4'-0-PAb Staph. aureus 6,25 6,25 6,25 6,25 FDA 209P Stagh. aureus 12,5 3,12 6,25 6,25 Smith Bacillus subtilís 3,12 1,56 3,12 3,12 NRRLB-S58 .

Bacillus cereus 6,25 6,25 6,25 6,25 ATCC 10702 Bacillus meqaterium 6,25 3,12 3,12 3,12 APP Sarcina lutea 0,39 0,39 0,78 0,78 PCI 1001 Micrococcus flavus 0,78 1,56 3,12 3,12 FDA 16 Corxnebacterium bovis 0,78 0,78 3,12- 3,12 1810 Pseudomonas aeruqinosa >100 >50 >100 >100 A3 Escheríchia coli >100 >100 >100 >100 NIHJ Mycobacterium smegmatis 6,25 6,25 100 100 ATCC 607 ' Candida albicans >50 25 >100 >50 Såsom angavs i tabell 3 är de föreliggande föreningarna användbara såsom antibíotíska medel, speciellt mot grnmpositiva bakterier. 7808304-5 Aliltimaëiysrlssie Föreningarna med formeln 1 visar utpräglad antitumörverkan med låg toxlcitet i standardförsök.

A. Föreliggande föreningar befanns ha en utpräglad hümmande verkan på tillväxten och nukleinsyrasyntesen av L1210 leukemi- celler i odling. g Exempelvis ympudes L1Zl0 celler (5 x 104 celler/ml) i RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute 1640) inne- hållande 20% kalvserum och odlades vid 37OC i närvaro av 0,1 och 0,5 ug/ml av föreningarna enligt föreliggande uppfinning i en C02-odlingsapparat. Antalet celler räknades periodiskt och till- växthämningshastigheten (%) av kontrollen bestämdes såsom visas i tabell 4.

Tabell 4 Tillväxthämmande verkan av tetrahydropyranyl- derivat på L1Zl0 celler i odling Koncentration Hämningshastighet (%) É Föreningar 0,1 0,5 ng/ml ' 4'-0-PDa 79,2 95,0 4'-0-PDb 74,6 88,8 Daunomycin 68,8 72,7 4'-0-PAa 65,9 81,1 4~-o~PAb 78,1 92,9 14-0-PA 7,6 58,3 4',14-di-0-PAa 37,5 80,8 4',l4-di-0-PAb 25,5 72,1 Adrínmycin 70,7 81,2 Verkan av föreningarna enligt föreliggande uppfinning på nukleínsyrasvntesen undersöktes på följande sätt: 1 X 105 celler/ml av L1210 celler suspenderades i RPMI-medium innehållande 10% kalvserum, Eörodlades vid 37°C i 1 till 2 timmar i en CO,-odlingsapparat och sedan sattes föreningarnaenligt före- liggande uppfinníngtill mediet vid olika koncentrationer. Efter minuters odling tillsattes 140-uridín (0,05 uCi/ml) eller 14C-tymidín (0,05 nüí/ml) och man odlade vid 37°C i 60 minuter. 17808304-5 16 Trikloroättiksyra (TCA) (10%) sattes till odlingsmediet för att stoppa reaktiunen och utfälla de syra-olösliga materialen och sedan tvëttades fällningen tre gånger med S till 10% TCA löst i myrsyra. Radíoaktiviteten mättes och uttrycktes såsom 50% häm- ningskoncentration av införlivandet.

Tabell 5 14_ 50% hämningskoncentration av 14C-tymidín- och C- uridininförlívande í L1210 celler i odling 50% hämning Koncentration ng/ml Föreningar Uridin Tymidin 3 I 4'-0-PDa 0,13 0,28 4'-0-PDb 0,20 0,32 Daunomycin 0,40 0,70 4'-0-PAa 0,20 0,37 4'-0-PAb 0,24 0,50 , 14-0-PA 0,17 0,42 4',14-di-u-PAa 0,23 0,55 4',14-di-o-PAb 0,24 0,97 Adriamycin 0,50 2,1 B. När de testades mot olika experimentella djurtumörer visar föreliggande föreningar en utpräglad antitumörverkan med minskad toxícitet relativt adriamycin och daunomycin. Följaktligen är föreningarna terapeutiskt användbara vid hämning av tillväxten av däggdjurstumörer.

Såsom ett exempel ympades BDF1-möss intraperitonealt med 1 X 106 celler/mus av L1210 leukemíceller. Efter det att 24 timmar har förflutit sedan ympningen, administrcrades till mössen föreningarna enligt föreliggande uppfinning intraperitonealt en gång dagligen i 10 pa varandra följande dagar och observerades under en 45-dagars period. Antitumörverkan visades genom förläng- ningsförhallandet av överlevnadsdagar (T/C, %) till överlevnads- dagar för kontrollmöss injicerade med fysiologisk saltlösning.

Resultaten visas i tabell 6.

*I 7808304-5 Tabell 6 Antitumörverkan av tetrahydropyranylderivat (T/C, %) Dos (mg/kg/dag) Föreningar 5 2,5 1,25 0,6 0,3 0,15 4'-0-PDa >3Z0 >320 122 115 96 90 4'-0-PDb >320 256 122 115 103 90 4'-0-PAa i - 173 180 187 120 127 4'-0-PAb >375 >S60 1 >373 293 160 113 14-0-PA _ 142 130 Ä 126 113 110 103 4',14~dí-0-FAQ 154 115 109 96 103 96 4',14-di-0-"AB 161 109 EI 103 103 96 115 Adriamycin toxíäcdöd 231 1 218 230 165 128 Daunomyein ltoxíæcdöd 118 191 105 132 118 Från resultaten av toxisk död och kroppsviktförlust hos mössen i detta experiment visas det att derivaten enligt före- liggande uppfinning är 1/3 till 1/2 lägre í toxicitet än adria- mycin och daunomycín, som är utgângsmaterialen i föreliggande uppfinning.

C. De utpräglade antitumörverkningarna sedda från A och B ovan bekräftades genom stabiliteten av föreliggande föreningar vid in- aktiveringen med hepatisk reduktas NADPH-cytokrom P450. Ut- tryckligen odlades NADPH-cytokrom P450-reduktas, som renats från råttlever homogenat, med föreningarna enligt föreliggande upp- finning vid 25°C i 25 minuter i kvävgasfas och bildad odlings- produkt, 7-deoxiaglykon, bestämdes såsom visas i tabell 7.

Tabe11_1 Stabilitet av tetrahydropyranylderivat på reduktas NADPH~cytokrom P450 från råtta Produkt (nmol/rör) Föreningar (7-deoxiaglykon) 4'-O~PDa 37,3 4'-0-PDb 46,6 Daunomycin 65,8 4'-0-PAH 10,9 4*-0-Pnb 15,8 14-0-PA 18,4 4',14-di-0-PAn 13,1 4',14-di-0-PÅD 15,8 Adrinmycin 47,2 40 7808304-5 mi Reaktionsblandningens sammansättning: NADPH 0,2 mN Tris-HCI (PH 8,0) 0,1 M Substrat 0,1 mM Enzym 4,6 ng/ml (Tris-HCl=Tris(hydroximetyl)aminometan) Terapeutisk användning .,Såsom nämndes ovan är föreningarna 4'-0-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-di-0-PAa, 4',14-di-0-PAb, 14-0-PA, 4'-O-PAa och 4'-0-PAb och deras icke toxiska syraaddítionssalter nya antibiotika, använd- bara inom både human- och veterinärmedicinen, och de har även ut- präglad hämmande verkan mot maligna däggdjurstumörer, omfattande både solida och ascites-typer.

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahâlles en metod för terapeutisk behandling av en däggdjursvärd drabbad av en mikrobiell infektion(speciellt en grampositiv bakteriell infektion) eller av en malign tumör (dvs. en tumör av solidtyp eller ascítes-typ, såsom L1210 leukemi), som omfattar administrering till nämnda värd en verksam antimikrobiell eller tumörhämmande dos av 4'-O-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-di-0-PAa, 4',14-di-0-PAb, 14-0-PA, 4'-0-PAa eller 4'-0-PAb eller ett icke toxiskt syra- additionssalt därav, eller en blandning därav.

Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhanda- hâlles en farmaceutisk komposition, som omfattar en terapeutisk verksam antimikrobiell eller tumörhämmande mängd av 4'-0-PDa, 4'-0~PDb, 4',14-di-0-PAa, 4',14-di-0-PAb, 14-0-PA, 4'-0-PAa eller 4'-0-PAb eller en blandning därav, eller ett icke toxiskt syraadditionssalt därav, i kombination med en farmaceutisk bärare eller spädningsmedel. Sådana kompositioner kan tíllredas i vilken farmaceutisk form som helst lämplig för parenteral administrering.

Proparat för parcntera] administrering omfattar sterila vattenhaltiga eller icke vattenhaltiga lösningar, suspensionor eller emulsioner. De kan även tillverkas i form av sterila fasta kompositioner, som kan lösas i sterilt vatten, fysiologisk salt- lösning eller något annat sterilt injiccrbart medium omedelbart före användningen.

Det kommer att inses att de aktuella lämpliga använda doseringsmüngdernu, kommer att variera enligt den speciella Eöreningen, som användes, den speciella beredda kompositionen, I.) b! 'Jl in 40 19 0 7808504-5 tíllförselsättet och det speciella läget, värden och sjukdomen, som behandlas. I allmänhet ínjiceras föreningarna intraperitonealt, intravenöst, subkutant eller lokalt i icke mänskliga däggdjur och intravenöst eller lokalt i människor. Många faktorer, som modífierar verkan av läkemedlet kommer att tagas hänsyn till av fackmannen, t.ex. ålder, kroppsvikt, kön, diet, administreringstid, administreringssätt, nvsöndringshastighet. patientens tillstånd, läkemedelskombínatíoner, reaktionskänsligheter och sjukdomens allvarlighet. Administrering kan utföras kontinuerligt eller periodiskt inom den maximalt tolererade dosen. Optimala till- förselhastigheter för en given uppsättning betingelser kan fast- ställas av fackmannen under användning av konventionella pröv- ningar för bestämning av doseringen med hänsyn till ovanstående riktlinjer.

För användning såsom ett antimikrobiellt medel administreras i allmänhet föreningarna på så sätt att koncentrationen av den aktiva bestândsdelen är större än den minimala hämmande koncentra- tionen för den speciella organismen, som behandlas.

Följande exempel tillhandahålles för belysande ändamål.

Exemnel 1 Förfaronde för framställning av 4'-0-tetrnhydropyranyl- -daunomycin (4'-0-PDa och 4'-0-PDb Till en lösning av daunomycín-hydroklorid (60 mg) i 5 ml vattenfri dimetylformnmid sattes 1 ml 3,4-dihydro-ZH-pyran och en katalytisk mängd p-toluensulfonsyra. Efter att fått stå över natten vid rumstemperatur i mörker sattes reaktionsblandningen till ml 0,1 N vattenhaltig natriumvätekarbonatlösníng och man extrahcrade med kloroform (10 ml x 4). Efter det att kloroform- extraktet extraherats med 1-procentig ättiksyralösning (10 ml X ), neutraliserades erhållet surt vattenhaltigt skikt med natríumvätekarbonat och sedan extraherade man åter med kloroform (20 ml x 10). Kloroformskíktet torkades över vattenfritt natrium- sulfnt och koncentrerades till torrhet.4¥Hm mfsâlunda erhallen återstod anbringades för preparativ sílikagel-tunnskiktskromato- grafi (Merck Co. "60F254") och framkallades med en kloroform- -metanol-blandning (l0:1) (volym/volym).

Silikagelband motsvarande Rf 0,46 och 0,65 skrapades fram fràn tunnskíktet, eluerades med kloroform-metanol-blandningen (10:1) (volym/volym) och koncentrerades till torrhet. Varje åter- stod löstes i metylenklorid, frystes genom tillsats av t-hutanol '7sosso4-5 Ü, 'vi UI 40 under kylning och torkades under reducerat tryck. Han erhöll ,1 ml rödaktigt brunt fast ämne av 4'-0-PDa och 10,3 mg rött fast ämne av 4'-0-PDb från Rf 0,46- respektive 0,65-fraktionerna. 4'-0-PDa och 4'-0-PDb är diastereomerer av 4'-0-tetrahydro- pyranyldaunomycin och deras fysikalisk-kemiska egenskaper är sä- som visas i tabell 1. Éšemgel 2 Pörfarande för framställning av 4',14-0-bís(tetrahydro- .pyranyljadriamycin (4',14-di-0-PAa och 4',14-di-0-PAb) och 14-0-tetrahydropvranyladriamycin (14-0-PA) från adriamycin Till en lösning av adriamycin-hydrokloríd (130 mg) i 10 ml vattenfri dimetylformamid sattes 2 ml 3,4-dihydro-ZH-pyran och en katalytisk mängd p-toluensulfonsyra. Efter att fått stå i 48 timmar vid rumstemperatur i mörker sattes reaktionsblandningen till 20 ml 0,1 N vattenhaltig natriumvätekarbonatlösníng och man extraherade med etylacetat (20 ml x 5). fter extraktíon av etyl- acetatskiktet med 1-procentig ättíksyralösning (40 ml x 4) neutraliserades det sura vattenhaltiga skiktet med natriumväte- karbonat och extraherades med kloroform (20 ml x 10). Kloroform- skiktet torkades över vattenfritt natriumsulfat och koncentrerades till torrhet. 160 mg averhâllet fast ämne framkallades och renades genom en preparativ silikagel-tunnskiktskromatografi under använd- ning av en kloroform-metanol-blandning (10:1) (volym/volym).

Banden vid Rf 0,12 och 0,55 skrapades fram från tunnskiktet och renades enligt metoden i exempel 1.

Man erhöll 35 mg rött fast ämne av 14-0-PA, 16 mg rött fast ämne av 4',14-di-O-PAa och 14 mg rött fast ämne av 4',1¿-di-0-Pnb från Rf 0,12-, 0,55- respektive 0,73-fraktíonerna. 4',14-di-0-PAa och 4',14-di-0-PAb är diastereomerer av 4',14-bis(0-tetrahydropyranyl)adriamycin och deras fysikalisk- -kemiska egenskaper är såsom visas i tabell 1.

Exemgel 3 Förfarande för framställning av 4',14-bis(0-tetrahydro- pyranv])adríamyein från 14-0-tetrahydropyranyladriamvcin Till en lösning av 35 mg 14-0-PA i 2 ml vattenfri dimetyl- formamíd satte man 0,5 ml 3,4-díhydro-ZH-pyran och en katalytisk mängd p-toluensulfonsyra. Efter att fått stå i 40 timmar vid rums- temperatur i mörker sattes reaktionsblandningen till 10 ml 0,02 N vattenhaltig natriumvätekarbonatlösning och man extraherade med etylacetat (S ml X 4). Efter extraktíon av etylacetatskiktet '_12 '.r| 40 21 7808304-5 med 1-procentig ättiksyralösníng (10 ml x 3) neutralíserades det sura vattenhaltiga skiktet med natriumväteknrbonat och man extraherade med kloroform (10 ml x 5). Kloroformskiktet torkades över vattenfri natriumsulfut och koncentrerades till torrhet.

Erhâllen återstod kromatograferades under användning av ett silíkageltunnskikt enligt exempel 2 och 8,4 mg rött fast ämne av 4',14-di-0~PAa och 8,1 mg rött fast ämne 4',14-di-0-PAb erhölls fran Rf 0,55- respektive 0,?3-fraktíonerna. Deras fysikalisk- -kemíska egenskaper överensstämde med de för föreningarna erhållna i exempel 2.

Exempel 4 Förfarande för framställning av 4'-0-tetrahydropyranyl- -adríamycin från 4',14-bis(0-tetrahydropyranyl]adriamycín a) 4',14-di-0-PAa (1Z,4 mg) löstes i 1,5 ml 10-procentig ättíksyralösning och fick stå i 4,5 timmar vid rumstemperatur i mörker. Reaktionsblandningen sattes till 10 ml vatten, neutraliserades med natriumvätekarbonatpulver och extraherades med kloroform (15 ml X 2).

Kloroformskiktet torkades över vattenfrítt natríumsulfat och koncentrerades till torrhet. 11 mg av erhållen återstod renades med en silíkagel-tunnskíktskromatografi såsom beskrivits ovan under användning av en kloroform-metanol~blandning (10:1) (volym/volym). Huvudbandet vid Rf 0,32 skrapades fram och eluerades med kloroform-metanol-blandningen (10:1) (volym/volym).

Eluatet koncentrerades till torrhet. Återstoden löstes i metylen- klorid, tillsättande t~butanol under kylning för att frysa, och torkades under reducerat tryck. Man erhöll 7 mg rött fast ämne av 4'-0-PAa och dess fysikalisk~kemíska egenskaper är visade 1 tabell 1. b) 4',14-di-0-PAb (16 mg) löstes i 5 ml 0,005 N p-toluen- sulfonsyra-metanol-lösning och fick stå i 1 timma vid rums- temperatur i mörker. Reaktíonsblandningen neutraliserades med ml 0,01 N vattenhaltig natriumvätekarbonatlösníng och extra- herades med kloroform (10 ml x 4). Kloroformskiktet torkadcs över vattenfrítt nntriumsulfat och behandlades såsom visas í (a) man erhöll 7,2 mg rött fast ämne av 4'-0-PAb som visar Rf 0,49 pá ett sílikagel-tunnskikt under förhållandena beskrivna ovan. Dess fysikalisk-kemiska egenskaper är visade i tabell 1. 4'-0-PAa och 4'-0-PAb är díastereomerer av 4'-0-tetra- hydropyranyladriamycin. 7808304-s 22 Exemge] 5 Saltbildníng Belysande för förfarandena, som kan användas för att fram- ställa syraaddítíonssalter, kan den fria basen av 4'-0-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-di-0-PAa, 4',14-dí~0-PAb, 14-0-PA, 4'-0-PAa eller 4'-0-PAb lösas i etylacetat och cirka I ekvivalent HC1 tíllsättas. Vid lyofílísering erhålles lämpligt hydrokloridsalt.

Claims (5)

n, vsoszrm-sw PATENTKRAV 1. Antracyklinglykosid k ä n n e t e c k n a d av den allmänna formeln I E? \ f! tf" c-CHZR, f” i: I/TTW \ / - x Z

1. I. \r/ r OCHÉ 0 OH ' " O !A“""0 å (I) / Clí- :\ J ,f R2 NH vari H1 betecknar en väteatom eller en hydroxyl~ eller tetrahydro- pyran-2-yl-oxígrupp och R2 betecknar en hydroxyl- eller tetrahyd- ropyran-2-yl-oxigrupp, varvid när R1 betecknar en väteatom eller en hydroxylgrupp R2 betecknar en tetrahydropyran-2-yl-oxigrupp, eller ett icke toxiskt syraadditionssalt därav, varvid stereo- isomera former, vilka skiljer sig åt i konfigurationen vid C-2- ställningen av tetrahydropyran-2-y1-oxigrupper i betydelsen av R kan förekomma. 23

2. Antracyklinglykosid enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den utgöres av U'-0-tetrahydropyranyldaunomycin (a) eller U'-O-tetrahydropyranyl-daunomycin (b) med formeln I vari R1 betecknar en väteatom och R2 betecknar en tetrahydropyran- yloxigrupp, eller ett icke toxiskt syraadditíonssalt särav, var- vid konfigurationerna av (a) och (b) är olika vid C-2-ställningen av tetrahydropyran-2-yl-oxigrupper. 5. Antracyklinglykosid enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den utgöres av 1U-0-tetrahydropyranyl-adriamycin med formeln I, vari R1 betecknar en tetrahydropyranyloxigrupp och

3. H2 tionssalt därav. betecknar en hydroxylgrupp, eller ett icke toxiskt syraaddi- 7808304-5 2H

4. U. Antracyklinglykosid enligt krav 1, k ä n n e t e c k- n a d därav, att den utgöres av H',lä-bis(0-tetrahydropyranyl) adríamycin (a) eller H',1H-bís(0-tetrahydropyranyl)adriamycin (b) med formeln I, vari R1 och R2 betecknar en tetrahydropyranyloxi- grupp, eller ett icke toxiskt syraadditíonssalt därav, varvid konfígurationerna av (a) och (b) är olika vid C-2-ställningen av tetrahydropyran-2-yl-oxigrupper.

5. Antracyklinglykosid enligt krav 1, k ä n n e t e c k- n a d därav, att den utgöres av H'-0-tetrahydropyranyladriamycin (a) eller H'-0~tetrahydropyranyl-adriamycin (b) med formeln I, vari R1 betecknar en hydroxylgrupp och H2 betecknar en tetrahydro- pyranyloxígrupp, eller ett icke toxiskt syraadditionssalt därav, varvid konfigurationerna av (a) och (b) är olika vid C-2-ställ- ningen av tetrahydropyran-2-yl-oxigrupper.