DE2705670B2

DE2705670B2 - Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Elastin-Hydrolysaten

Info

Publication number: DE2705670B2
Application number: DE2705670A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dipl.-Chem. Dr. 3450 Holzminden Berg; Klaus Dipl.-Chem. Dr. 6940 Weinheim Braeumer; Zdenek Dipl.- Chem. 6900 Heidelberg Eckmayer; Rolf Dr. 6100 Darmstadt Monsheimer; Ernst Dipl.-Chem. 6100 Darmstadt Pfleiderer
Original assignee: Carl Freudenberg KG; Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1977-02-11
Filing date: 1977-02-11
Publication date: 1980-11-27
Also published as: DE2705670C3; IT7847528A0; FR2380294B1; IT1103101B; CH635109A5; JPS6035114B2; DE2705670A1; FR2380294A1; JPS53101592A; US4179333A; ES465732A1

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alkalische Proteinasen aus Badllusstämmen verwendet werden, wie z.B. Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus. Bacillus firmus, Bacillus licheniformis. Bacillus alcalofilus und/oder Proteinasen aus Streptomyces speciae, wie z.B. Streptomycin grisens.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hersteilung von wasserlöslichen Hydrolysaten aus Elastin enthaltenden Rohstoffen, wie Hautabfällen, Sehnen, Nackenbändern und dergleichen. Hierbei wird ein Produkt erhalten, daß als kosmetischer Wirkstoff geeignet ist und Eiweißstoffe in einem bestimmten mittleren Molekulargewicht enthält

Elastin ist in Rohstoffen wie beispielsweise Hautabfällen und Sehnen enthalten. Insbesondere die Nackenbänder (Ligamen tum nuchae) von Schlachtvieh wie Rindern oder Schweinen enthalten hohe Elastin-Anteile. Diese Schlachtabfälle fallen bei der fleischverarbeitenden Industrie und in Schlachthöfen und Metzgereien an und mußten bisher als lästiger, schnehverderblicher Abfall beseitigt werden, nachdem keine Möglichkeit der Aufarbeitung bzw. Verwendung, auch nicht als Tierfutter, bekannt war.

Elastin befindet sich grundsätzlich in Bindegewebsteilen neben Kollagen. Die elastischen Fasern erhielten ihren Namen wegen der Gummielastizität, einer Eigenschaft, die den Kollagenfasern vollständig fehlt Elastinfasern sind von entscheidender Bedeutung für die Elastizität von Gefäßwänden und Sehnen. Der Elasiinzustand z. B. der Gefäße ist deshalb mitbestimmend z. B. bei Arteriosklerose, einer der gefährlichsten Gefäßkrankheiten. In der Hau( spielen Elästinfäsefn elfte große Rolle. Sie durchziehen spinngewebartig die Papillar- und den oberen Rand der Retikularschicht und obgleich ihre Menge nur etwa '/rotel der Kollagefasern beträgt sind sie für die Elastizität der Haut voll verantwortlich.

Im Gegensatz zu Kollagen sind Elastinfasern sehr widerstandsfähig und konnten bisher nicht abgebaut werden. Bei der Aufarbeitung von Haut und Hautabfällen fielen die Elastinfasern stets als nicht verwertbarer Rückstand an. Die Fasern sind hoch resistent selbst gegen heiße Säuren, Alkalien und sogar gegen Enzyme. Ihre große Widerstandsfähigkeit kann zwar zur Isolierung det. Elastins von anderen Eiweißstoffen der Bindegewebe dienen und so wird z. B. Kollagen durch Oberführen in Gelatine und Auswaschen mit heißem Wasser von Elastin getrennt, jedoch ist es gerade diese

ίο Widerstandsfähigkeit, weiche die praktische Ausnutzung der an sich bekannten ausgezeichneten Eigenschaften von Elastinfasern z. B. in der Hautbehandlung verhindert hat
Elastinfasern sind genau wie andere z. B. durch

is Hydrolyse verarbeitbare Hautabfälle Eiweißprodukte, die an sich ais brauchbarer kosmetischer Wirkstoff geeignet erscheinen, weil ihre Fähigkeit, die Elastizität von Haut und Gefäßen zu steigern ebenfa'i.s an sich bekannt ist. Während jedoch andere Hautproteine, z. B.

kollagener Herkunft, durch chemische, alkalische oder saure Hydrolyse!: gewonnen werden können, erwiesen sich die Elastine als resistent, Hydrolyseprodukte aus Hautabfällen werden bekanntlich in großem Umfange in der Haut- und Haarkosmetik eingesetzt Insbesondere in der Haarkosmetik ist es aber denkbar, daß die Geschmeidigkeit und Festigkeit der Haare durch Elastin gesteigert werden könnte. Vergleichbares gilt für die Hautkosmetik, insbesondere bei der Behandhing von physiologisch älterer Haut, deren Elastizität nachläßt bzw. verlorengegangen ist, durch Kollagunhydrolysate. Die Wirkung von KoUagenhydrolysaten beruht im wesentlichen darauf; daß die Hydrolysate die Hautfeuchtigkeit erhalten helfen bzw. dafür sorgen, daß trockene Haut auf natürliche Weise wieder mit Feuchtigkeit beladen wird. Viel wichtiger erscheint es aber, daß die Wirkung der Kollagenhydirolysate nicht nur auf die Oberfläche der Haut begrenzt wird. Es ist denkbar, daß bestimmte Molekularfraktionen von Eiweißhydrolysaten die Oberschicht der Haut durchdringen und somit eine Verbesserung des Hautzustandes durch vermehrten Kollagengehalt bewirken.

Trotz der an sich erkannten guten Eigenschaften des Elastins wurde es bisher hingenommen, daß auch bei schonendem enzymatischem Abbau von Gerüsteiwei-Ben, z. B. gemäß GB-PS 14 14 634, im wesentlichen Collagenfraktionen erhalten wurden, während Elastin als unaufgeschlossenes Abfallprodukt zurückblieb. Es galt als gesicherte Tatsache, daß Elastin durch Proteasen nicht angreifbar ist, mit Ausnahme des Enzyms Elastase aus Säugetierpankrea* Elastase nimmt aber unter den Enzymen in soweit eine Sonderstellung ein, als dieses Enzymsystem in technischem Maßstabe nicht einsetzbar ist Elastase wird bereits beim Schütteln inaktiviert (J. Biochem. 59,459 - 464 [1955]). Überdies ist

Elastase gegen Salzsäure sehr empfindlich und wird innerhalb kurzer Zeit desaktiviert. Auch bei Zugabe von Salzen tritt ein vergleichbarer Wirkungsabfall ein.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Aufschlußverfahren für Elastin-Fasern zu entwickeln, wobei die Herstellung von wasserlöslichen Hydrolysaten angestrebt wird. Das Verfahren soll insbesondere die Hydrolyse von bisher nicht verwertbaren Rohstoffen betreffen, wie z. B. den Nackenbändern und Sehnen von Schlachtvieh. Dieses Verfahren wird im Hinblick darauf entwickelt, daß Elastin ein für die kosmetische Industrie sehr begehrter Wirkstofl ist und ein geeignetes Hydrolysat aus Elastin bessere Werte beim Durchbringen und Geschmeidigmacben gealterter oder

strapazierter Haut darstellt Wegen der an sich bekannten, gut reproduzierbaren und schonenden Abbaumethode mit Hilfe von Enzymen soll ein Verfahren gesucht werden, daß es ermöglicht auch Elastin enzymatisch abzubauen, und zwar mit Hilfe von ■> Enzymen, welche gegenüber der bekannten Elastase wesentlich besser und auch in industriellem Maßstabe handhabbar sind.

Es wird ein Verfahren zum Herstellen von wasserlöslichen Hydrolysaten aus Elastin enthaltenden Rohstoffen, wie Hautabfällen, Sehnen, Nackenbändern und dergleichen beansprucht, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß die gereinigten Rohstoffe

f) bei Temperaturen oberhalb 80⁰C und pH-Werten unter 2 bzw. unter 4 für die Dauer von wenigstens 3 Stunden einer Hydrolyse mit anorganischen bzw. organischen Säuren und anschließend nach Reinigen mit Wasser

b) bei Temperaturen von 30 bis 70°C und pH-Werten von wenigstens 3,5 in Gegenwart von Alkalien und " 0,01 bis Λ,ϋτΜάη Harnstoff niitteis alkalischer Bakterien-Proteinasen eines pH-Optimums zwischen 9 und 13 einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen werden, die im jeweiligen pH-Optimum des eingesetzten Enzyms erfolgt, worauf

c) nach, beendetem Abbau die Enzyme hitzeinaktiviert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu Elastin-Hydrolysaten, weiche bei Verwendung als kosmetischer jo Wirkstoff insbesondere die an sich bekannten günstigen Eigenschaften der Cohagen-Hydrolysate ergänzen. Dies rührt daher, daß die Aminosäc;ezusa>'jnensetzung des Produktes genau der Zusammensetzung der elastischen Hautfasern entspricht Auch die eiastirCpischen Aminosäuren Desmosin und Iso-Desmosin sind in dem erfindungsgemäß hergestellten Hydrolyseprodukt vorhanden. Das Produkt enthält weiterhin Lipoproteine, Proteoglycane, Glycosaminoglycane und andere in natürlichem Elastin vorhandene Stoffe. Diese Zusammensetzung bewirkt die guten Eigenschaften des Produktes als Nährstoff für die Haut, deren Elastizität durch die infolge der Hydrolyse*Produkte beschleunigte hauteigene Elastin-Synthese noch wesentlich verbessert wird. is

Durch die Kombination der sauren Behandlung mit der alkalischen Hydrolyse in Gegenwart spezieller Enzyme ist es möglich, niedrige und bei jedem Ansatz reproduzierbare Molekulargewichte der Eiweißfraktionen zu erreichen. Die Hydrolysate sind bis zu hohen so Konzentrationen wasserlöslich. Hierdurch ist eine besonders gute Einarbeitung in Kosmetikprodukte gewährleistet

Der technische Aufwand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist geling. So kann die Zerkleinerung des Ausgangsmaterialii in üblicher Weise mit Hilfe einer fleischwolfartigen Vorrichtung erfolgen, wobei das Material gleichzeiliig homogenisiert wird Die homogenisierten HautaufäJle und die aus Schlachtabfällen, z. B. von Rindern oder Schweinen gewonnenen Nackenbänder (Ligamentum nuchae) werden nach der mechani· sehen Reinigung und Zerkleinerung zunächst bei erhöhter Temperatur oberhalb etwa 8O⁰C mit Säuren behandelt. Hierzu eignen sich anorganische Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. In diesem Falle muß der pH-Wert unter 2 liegen. Es ist jedoch ebenlalls möglich, das Material mit organischen Säuren wie z. B. Essigsäure oder Ameisensäure zu behandeln, wobei der pH-Wert unter 4 liegen soll. Die Temperatur liegt oberhalb etwa 8O⁰C, zweckmäßig im Bereich zwischen etwa 80 und 100⁰C Eine bevorzugte Ausführung liegt darin, das angesäuerte Material mehrere Stunden zu kochen, wobei im allgemeinen die Behandlungsdauer 3 Stunden nicht unterschreiten sollte. In den Hautabfällen bzw. Sehnen oder Nackenbändern vorhandenes begleitendes Kollagen wird hierbei in Gelatine überführt, welche durch Auswaschen beseitigt werden kann. Verunreinigungen und Nebenprodukte werden durch Schichtenfiltration entfernt

Nach der Säurebehandlung ist das Material für den enzymatischen Abbau zugänglich. Fleisch- und Fettreste werden gegebenenfalls entfernt und das zerkleinerte, säurevorbehandelte Material in dem Hydrolysemedium suspendiert Hierzu ist die Zugabe von genügend Wasser und soviel Alkalien, z. B. KOH, NaOH, Ca(OH)₂ oder dergleichen, erforderlich, daß der pH-Wert wenigstens etwa 8,5 beträgt Zweckmäßiger sind pH-Werte über 9,5. Das Hydrolysemedium enthält zuzüglich Harnstoff, zweckmäßig in einer Konzentration von 0,01 bis 1,0 mol/Liter. Der eigentliche Abbau wird bei erhöhten Tempersturen zwischen etwa 30 und 70°C durchgeführt zweckmäßig zwischen etwa 40 und 65°C Optimale Ergebnisse erhält man bei Temperaturen über 55° C.

Für den enzymatisch·^ Abbau werden alkalische Proteinasen aus Bacillusstämmen bevorzugt insbesondere Proteinasen aus Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus alcalofilus, Bacillus subtllis oder Bacillus mesentericus. Gut geeignet sind auch Streptomyces speciae, wie z. B. Streptomycin grisens.

Im sauren Bereich spaltende Enzyme, sowie tierische und pflanzliche Proteinasen sind für das erfindungsgemäße Verfahren nicht so geeignet weil sie selbst im alkalischen Bereich zu langsam aufspalten.

Der erfindungsgemäße Weg zum Abbau von Elastin mit Hilfe von alkalischen Proteinasen in Gegenwart von Harnstoff fahrte zu einem überraschenden, nicht naheliegenden Ergebnis. Aus der bekannten Tatsache, daß lediglich die schwer handhabbare Elastase in der Lage ist, Elastin abzubauen, konnte nicht geschlossen werden, daß in Gegenwart von Harnstoff die erfindungsgemäß vorgeschlagene 2stufige Methode unter Verwendung alkalischer Enzymsysteme zu dem insbesondere in der Kosmetikindustrie geschätzten Produkt führt

Das Ergebnis ist umso überraschender, wenn man berücksichtigt daß seit der eindeutigen Identifizierung der Elastasen vor mehr als 25 Jahren (J. Biochem. Band 46, Seite 384-387 [195Oj) das Problem der technischen Beseitigung von Elastinabfällen und die bekannten Elastasen eine Koexistenz führten, ohne daß das Problem und seine Lösung einander zugeordnet worden wären. Die Erklärung dieses anscheinend paradoxen Sachverhaltes liegt jedoch nahe, denn Elastase war schließlich nicht das geeignete Enzym zur technischen Beseitigung der Elastinabfälle. Bekannt war lediglich die Nichtangreifbarkeit von Elastin durch Proteasen und andererseits die Empfindlichkeit des einzig möglichen Enzyms Elastase gegenüber Salzen bzw. Säuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet dagegen zwingend in Gegenwart relativ hoher Salzkonzentration (Harnstoff), die nach dem bekannten Stand der Technik an sich zu einem Scheitern jeglicher enzymatischer Reaktion führen müßte. Es war somit äußerst überraschend, daß die gewöhnlichen alkalischen Proteinasen von denen an sich bekannt ist, daß sie nicht in der

Lage sind, Elastin abzubauen, nach dem erfindungsgemäßen Vorschlag zu einem derartigen Abbau aktiviert werden, wenn Harnstoff dem Inkubationsmedium zugesetzt wird.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäBen Verfahrens können an sich bekannte Zusätze für enzymatische Reaktionen wie z. B. Aktivatoren, Stabilisatoren oder dergleichen verwendet werden. Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird nach der Anson-Hämoglobin-Methode (M. L. Anson: »Journal of General Physiologie«, 22,79 [1939]) bzw. nach der Löhnlein-VoI-hard-Methode (»Die Löhnlein-Volhardsche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität: »Gerbereichemisches Taschenbuch«, Dresden Leipzig, 1955) als »LVE« (Löhnlein-Volhard-Einheit) bestimmt Unter der LVE-Einheit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, welche unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut

Die Art des Enzyms, die Konzentration, die Einwirkzeit und Temperatur beeinflussen den Abbau des Produktes. Es ist deshalb in vielen Fällen erforderlich, durch geeignete Vorve/suche unter Zugrundelegung der erfindungsgemäßen Lehre die optimalen Verfahrensbedingungen zu ermitteln. Bei der Durchführung des Verfahrens ist die saure Vorbehandlung sehr wesentlich, denn der enzymatische Abbau in alkalischem Milieu ist ohne diese saure Behandlung nicht möglich.

Nach beendetem Aufschluß wird die Hydrolysatlösung durch kurzfristiges Erwärmen auf Temperaturen von etwa 90⁰C behandelt, wobei die noch wirksamen Enzyme inaktiviert werden. Die Mischung wird dann durch Filtration gereinigt und auf die gewünschte Konzentration eingeengt oder aber zu einem Pulver getrocknet Das Hydrolysat findet Anwendung nicht nur in der Kosmetik sondern auch auf weiteren an sich bekannten Einsatzgebieten für Eiweißstoffe.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt sein soll.

Beispiel 1

100 kg gefrorene Rindernackenbänder werden zusammen mit 200 kg Brunnenwasser in einen beheizbaren Behälter gefüllt Der pH-Wert der Mischung wird durch verdünnte Schwefelsäure auf 1,8 eingestellt und die Mischung eine Stunde gekocht Nach dem Kochen wird die Flüssigkeit abgegossen, 200 Liter Brunnenwasser zugegeben und der pH-Wert mit Schwefelsäure wieder auf 1,8 eingestellt Nach einer weiteren Stunde Kochen wird die Flüssigkeit abgegossen und der Kcchvorgang nochmals mit angesäuertem Wasser in genau der gleichen Weise durchgeführt. Der Kochvorgang ist somit insgesamt dreimal wiederholt worden.

Das Material wird nun mehrmals mit destilliertem

Wasser ausgewaschen, von Fett- und Fleischresten gereinigt und fein gemahlen. Das Trockengewicht des Materials beträgt etwa 30%,
Zu dem nun folgenden enzymatischen Abbau werden 100 kg der vorstehend beschriebenen Mischung zusammen mit 200 kg destilliertem Wasser in einen Heizkessel gefüllt Der pH-Wert wild mit Natronlauge auf 10,1 eingestellt Die Mischung wird bei 55°C mit 30 g alkalischer Bakterienproteinase aus Bacillus alcalofilus

ίο mit 9000 LVE, 100 g Harnstoff und 125 g (NHi)₂SO₄ versetzt Der Abbau erfolgt bei 55° C innerhalb von sechs Stunden, wobei die Mischung stark gerührt wird. Während dieser Zeit löst sich das Elastin vollständig auf. Nach dem Abbau wird das Material auf 95° C erhitzt um restliche Enzyme zu zerstören und anschließend abgekühlt

Das Hydrolysat wird nun durch Schichtenfiltration gereinigt Die Ausbeute nach dem Filtrieren besteht in 270 kg einer schwach trüben, opalisierenden Flüssigkeit mit einem Trockengewicht von 103% und einem pH-Wert von 8Z

Der pH-Wert der Flüssigkeit wird auf 7,0 eingestellt und die Flüssigkeit auf 30% eingeengt Sie ist für kosmetische Zwecke in diesem Zustand geeignet und wird gegebenenfalls mit p-Hydroxylbenzosäureester konserviert.

Beispiel 2

60 kg Schweinenackenbänder mit einem Trockengewicht von etwa 40% werden in einem Kochbehälter mit 120 kg destilliertem Wasser versetzt Die Mischung wird mit konzentrierter Essigsäure auf 3,4 angesäuert Anschließend folgt eine Bearbeitung des Materials wie im vorstehenden Beispiel beschrieben. Die Mischung

is wird insgesamt fünf Stunden gekocht, wobei nach jeder Stunde die Flüssigkeit ausgetauscht wird.

, Nach dem Kochen erfolgt die mechanische Reinigung wie im vorstehenden Beispiel beschrieben. Für den enzymatischen Abbau wird das Material zusammen mit 180 kg destilliertem Wasser in einem Heizkessel behandelt und mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt Die Mischung wird auf 55° C erwärmt und mit 240 g alkalischer Bakterienproteinase aus Bacillus firmus mit 9000 LVE, 1200 g Ammonhimsulfat und 960 g

4s Harnstoff versetzt Zum enzymatischen Abbau wird acht Stunden auf 55°C erwärmt und stark gerührt Das Elastin ist jetzt vollständig gelöst und die restlichen Enzyme werden durch Erhitzen der Mischung auf 95° C inaktiviert Anschließend wird auf etwa 60° C abgekühlt.

so Die Reinigung erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben durch Schichtenfiltration. Man erhält 220 kg schwach gelbliche trübe opalisierende Flüssigkeit mit einem Trockengewicht von 9,8% und einem pH-Wert von 7,9. Der pH-Wert wird nun auf 7,0 eingestellt und die

Flüssigkeit durch Sprühtrocknen pulverisiert.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von wasserlöslichen Hydrolysaten aus Elastin enthaltenden Rohstoffen, wie Hautabfällen, Sehnen, Nackenbändern und dergleichen, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigten Rohstoffe

a) bei Temperaturen oberhalb 80* C und pH-Werten unter 2 bzw. unter 4 für die Dauer von wenigstens 3 Stunden einer Hydrolyse mit anorganischen bzw. organischen Säuren und anschließend nach Reinigen mit Wasser

b) bei Temperaturen von 30 bis 70°C und pH-Werten von wenigstens 8,5 in Gegenwart von Alkalien und 0,01 bis 1,0 Mol/l Harnstoff mittels alkalischer Bakterien-Proteinasen eines pH-Optimums zwischen 9 und 13 einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen werden, die im jeweiligen pH-Optimum des eingesetzten Enzyms erfolgt, worauf

c) nach beendetem Abbau die Enzyme hitzeinaktiviert werden.