DE2644149B2 - Neue Parasiten-Antigene - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antigene, Verfahren zu deren Herstellung sowie Mittel, die geeignet sind, einen Impfschutz gegen parasitäre Erkrankungen zu induzieren.

Im vorliegenden Fall wird als Parasit ein Tier bezeichnet, das sich auf Kosten eines anderen Lebewesens (Wirt) ernährt und bei diesem bestimmte Krankheitserscheinungen hervorruft Vor allem handelt es sich bei den im Zusammenhang mit dem Gegenstand der Erfindung im wesentlichen in Frage kommenden Parasiten um solche, bei denen Wirbeltiere den Endoder Zwischenwirt in der Entwicklung des Parasiten darstellen, insbesondere um diejenigen, die bei Menschen und zahlreichen Omi-, Herbi- und Karnivoren vorkommen. Systematisch werden die Parasiten im Sinne der Erfindung im wesentlichen den Helminthen, insbesondere den Plathelminthen und Nemathelminthen, zugeordnet

Die Zahl der yon derartigen Parasiten befallenen Menschen wird auf mehrere 100 Mio. geschätzt Der Befall von Tieren, insbesondere Nutztieren, kann mit einem mehrfachen davon angenommen werden.

Es besteht lange das Bedürfnis, Parasitosen durch Immunisierung des Wirts mit geeigneten Vaccinen zu vermeiden. Als immunisierendes Agens hat man hierfür bisweilen lebende oder abgetötete, gegebenenfalls auch beispielsweise durch Strahlung attenuierte Parasiten oder deren Entwicklungsstadien, verwendet Die dabei erzielten Erfolge sind als wenig befriedigend zu bezeichnen. Man hat auch schon versucht, nicht die ganzen Parasitenorganismen, sondern Teile davon, bzw. Antigenpräparationen, zur Immunisierung des gegen den Parasiten zu schützenden Wirtes zu verwenden. Auch hierbei konnte ein erfolgreicher Durchbruch nicht

festgestellt werden. Hinzu kommt, daß die Haltung und Vermehrung von Parasiten häufig schwierig ist und das Parasitenmaterial für die Herstellung von Antigenen oft nicht in unbegrenzter Menge zur Verfugung steht
s Demgegenüber treten die Zwischenwirte in der Regel in der Natur sehr häufig auf.

Die Erfindung geht von dem überraschenden Befund aus, daß der Zwischenwirt des Parasiten ein geeignetes Ausgangsmaterial für die Extraktion des Parasiten-Antigens darstellt, wobei hauptsächlich, insbesondere aus Sicherheitsgründen, der nicht mit dem Parasiten infizierte Zwischenwirt verwendet wird.

Bei vielen Helminthen ist der Zwischenwirt eine bestimmte Schneckenart so z. B. für:

Schistosoma mansoni dem Erreger der Darm-BiIdharziose (Schistosomiasis), Biophalaria-Schnecken; Schistosoma haematobium, dem Erreger der Blasen-Bilharziose, Bulinus-Schnecken;
Schistosoma japonicum, dem Erreger der ostasiatischen Bilharziose, Oncomelania-Schnecken.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der nach den Ansprüchen 1 und 2 erhaltenen immunisierenden Agentien gemäß Anspruch 3 und 4.

In der Weiterführung des Erfindungsgedankens hat es sich gezeigt daß auch einzelne Organe von Zwischenwirten als Ausgangsmaterial für die Isolierung von Parasiten-Antigenen immunologisch verwandten Stoffe geeignet sind. Beispielsweise wurde gefunden, daß Schistosomen-Antigenen immunologisch verwandte Stoffe aus dem Hepatopankreas nichtinfizierter Schnekken isoliert werden können. Der Heptopankreas stellt dasjenige Organ der Schnecke dar, in dem sich die in der Schnecke eindringenden Mirazidien (Entwicklungsformen von Schistosoma mansoni) zur infektiösen Larve, der Zerkarie, entwickeln.

Die mit Parasiten-Antigenen immunologisch verwandten Stoffe sind in Extrakten von bestimmten Zwischenwirten bzw. Zwischenorganismen, z. B. die mit Schistosoma-Antigenen immunologisch verwandten Stoffe in Extrakten von Hepatopankreas, immunologisch nachweisbar. Für diesen Nachweis werden nach an sich bekannten Verfahren Antiseren gegen die Parasiten hergestellt, wonach zu prüfen ist, ob derartige Antiseren mit den betreffenden Organextrakten der Zwischenwirte zu reagieren vermögen. Zweckmäßig wird hierfür die auf Outcherlony zurückgehende Immundiffusion als Nachweismethode verwendet

Erfindungsgemäß werden die zweckmäßig vorher

so abgetöteten Zwischenwirte in ein wäßriges Medium eingebracht und darin homogen in eine feine Verteilung gebracht Tunlichst werden die Zwischenwirte oder daraus gewonnene Organe in einem Homogenisator fein gemahlen und in dem mehrfachen, mindestens dem zweifachen, vorteilhaft dem 2 bis 200fachen, Volumen des wäßrigen Mediums, vorteilhaft einer mehr oder weniger stark verdünnten Salzlösung, suspendiert und einige Stunden in Bewegung gehalten.

Die Salze und Extraktionsbedingungen werden unter dem Gesichtspunkt ausgewählt daß denaturierende Einflüsse auf Proteine vermieden werden. Die Extraktion wird dazu vorteilhaft bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur, zweckmäßig zwischen 2 und 10° C, durchgeführt Ais Salze kommen die in der präparativen Biochemie üblicherweise verwendeten Salze, wie z. B. Alkalihalogenide, wasserlösliche Phosphate oder Borate aber auch Citrate oder Acetate in Frage. Bewährt sind auch hieraus herstellbare Pufferlö-

sungen, ferner die von Sörensen bekannten und die von G ο ο d et al. Biochemistry 5,472 (1966) eingeführten Puffer, insbesondere Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan.

Die Abtrennung des Feststoffanteils erfolgt vorteilhaft durch Zentrifugation oder Filtration. Der lösliche Anteil wird gewonnen. Mit Hilfe des Antiserums, das gegen den Parasiten gerichtet ist, wird festgestellt, ob der Extrakt die gesuchten Antigene enthält Danach kann die Lösung, welche das dem Parasiten-Antigen _t0 entsprechende Antigen enthält, in Form einer physiologisch verträglichen Zubereitung, enthaltend eine wirksame Menge des Antigens als immunisierendes Agens, gegebenenfalls unter Zusatz von immunologischen Adjuvanzien, wie AI(OH)₃, und Mitteln zur Erhöhung der Stabilität der Antigene, ζ. Β. Proteine, Kohlenhydrate, verwendet werden.

Beispielsweise liefert ein Extrakt aus dem Hepatopankreas von Pianorbis-Schnecken, wie Biomphalaria, ein wirksames immunisierendes Agens gegen die Schistosomiasis-Erkrankung.

Die mit Parasiten-Antigenen immunologisch verwandten Antigene lassen sich aus dem Extrakt jedoch auch durch bekannte, in der Proteinchemie übliche Verfahren der Fällung mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Äthanol oder Salzen, beispielsweise Ammoniumsulfat, anreichern und reinigen. Maßstab für diese Maßnahmen ist jeweils die immunologische Reaktion mit gegen Parasiten-Antigene gerichteten Antiseren.

Derartige Antigene sind geeignet, eine Infektion von Wirtsorganismen mit Parasiten zu unterdrücken, bzw. zu verhindern. Hierzu werden die erfindungsgemäß hergestellten Antigene in einer für Impfstoffe üblichen pharmazeutischen Zubereitung in einer wirksamen Menge an einen Wirt verabreicht Dabei ist die parenterale Applikation des Impfstoffes angezeigt. Bis zu seiner Verwendung kann er auch in trockener Form, z. B. gefriergetrocknet aufbewahrt werden. In gleicher und an sich bekannter Weise lassen sich Antiseren gegen Parasiten-Antigene durch Immunisierung von geeigneten Wirbeltieren herstellen.

Die den Parasiten-Antigenen entsprechenden Antigene können auch in der Diagnostik zum Nachweis von Antikörpern gegen Parasiten-Antigene eingesetzt werden. Von Bedeutung ist beispielsweise der Nachweis von Antikörpern gegen Schistosomen. Es kommen dabei in der Immunologie gängige Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen zur Anwendung.

Die Erfindung soll an den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden:

Beispiel 1

Von 120 Biomphalaria-glabrata-Schnecken, drei Monate alt, wird durch Sektion 3,75 g Hepatopankreas gewonnen. Das Organ wird in einem Homogenisator fein gemahlen, in 15 ml isotonischer Kochsalzlösung suspendiert und danach 1 Stunde bei 4° C etwas gerührt. Durch Zentrifugation bei 20 000 χ g während 30 Minuten und 4° C wird ein klarer Überstand erhalten, der immunologisch mit einem Antiserum gegen Adult-Schistosoma-mansoni-Würmer oder Zerkarien reagiert

Aus diesem klaren Überstand kann das immunisierende Agens gewünschtenfalls mittels Äthanol oder Ammoniumsulfat spezifisch weiter angereichert werden.

Der das Parasiten-Antigen enthaltende Überstand kann jedoch auch direkt zur Immunisierung von Tieren gegen Schistosoma mansoni eingesetzt werden. Bei einem Tierversuch mit Mäusen wurde der Extrakt so weit verdünnt, daß eine immunisatorische Dosis pro Maus 250 Mikrogramrn frischem Hepatopankreas entsprach. Jeweils 100 Mäuse erhielten das betreffende Äquivalent subkutan in einem Volumen von 0,5 ml. Die Injektion wurde nach 14 Tagen wiederholt 21 Tage nach der 2. Injektion wurde jede Maus mit 130 Zerkarien von Schistosoma mansoni subkutan infiziert Nach 49 Tagen wurden die infizierten Mäuse getötet und die Schistosoma-mansoni-Würmer durch Leberperlfusion gesammelt und gezählt Die statistische Berechnung zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen immunisierten und nichtnnmunisierten Tieren.

Ein ähnliches Ergebnis wird erhalten, wenn syrische Goldhamsler mit Extrakt von frischen nichtinfiziertem Hypatoparikreas von Bulinus truncatus immuniziert werden und anschließend mit Zerkarien von Schistosoma heamalobium subeutan infiziert werden.

Beispiel 2

Aus 1500 Biomphalaria-alexandria-Schnecken, vier Monate alt wird durch Sektion der nichtinfizierte Hepatopankreas entnommen. Nach Zusatz von 50 ml phosphatgepufferter Isotonischer Kochsalzlösung pH 7,2 werden die Organe in einem Glashomogenisator fein zerkleinert 2 Stunden bei 4° C gerührt und bei 20 000 χ g während 30 Minuten bei 4° C zentrifugiert. Durch Strickstoffbestimmung nach Kjeldahl und Multiplikation des erhaltenen Werts mit 6,25 wird festgestellt, daß die gesamte Proteinmenj;e in dem Extrakt 3,0 g beträgt

Der klare Extrakt-Überstand wird anschließend auf eine Säure, die mit SEPHiADEX* G 150 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 gefüllt ist, aufgebracht und durch Eluieren mit dem gleichen Lösungsmittel in Fraktionen mit verschiedenen Molekulargewichtsbereichen aufgetrennt Durch Kontrolle mit spezifischen Antiparasiten-Serum in der Doppeldiffusion in Agar-Gel stellt man fest, daß das gewünchte antigene Material sich in derjenigen Fraktionen befindet die kurz nach dem Ausschlußvolumen der Säule im Eluat erscheint Die dieses serologisch positive Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 so weit verdünnt, daß ein Volumen von 0,25 ml 50 μg des zu Beginn eingesetzten Hepatopankreas-Proteins entspricht

Jeweils 100 Mäuse erhielten das Äquivalent des Hepatopankreas-Proteins subkutan in einem Volumen von 0,5 ml, das zur Hälfte des Volumens komplettes Freudsches Adjuvans oder 0,2%iges Aluminiumhydroxid enthielt Je eine Kontrollgruppe wurde mit den Adjuvantien ohne Beimengung von Hepatopankreas-Protein geimpft Nach 20 Tagen wurde jede Maus mit 130 Zerkarien von Sdtiistosoma mansoni subkutan infiziert. Nach 50 Tagen wurden die infizierten Mäuse getötet und die adulten Würmer durch Perfusion der Leber gesammelt und gezählt

In derjenigen Gruppe von Versuchstieren, die mit Hepatopankreas-Protein und komplettem Freudschen Adjuvans immuniziert worden waren, betrug die Reduktion der Wurmbürde gegenüber der Kontrollgruppe, die nur das Adjuvans erhalten hatte, 39,4%; bei derjenigen Versuchstiergruppe, die mit Hepatopankreas-Protein und Aluminiumhydroxide immunisiert worden war, betrug die Reduzierung der Wurmbürde

er der entsprechenden Kontrollgruppe 57,6%. ch Auszählen der erwachsenen Würmer erReduktion der Wurmbürde erwies sich nach her Auswertung (Student-Verteilung) der Einais signifikant (Irrtumswahrscheinlich- s b) das heißt, die durch Fraktionierung von lankreas-Extrakt erhaltene Antigenpräparation ist als immunisierendes Agent gegen Schistosoma mansoni wirksam.

In gleicher Weise wie die Biomphalarie-Schnecken können auch Schnecken der Gattungen Oncomelania und Bulinus zur Herstellung der Antigene in der beschriebenen Weise verwendet werden.

Claims (4)

1. Patentansprüche:

   ί. Verfahren zum Herstellen von immunologisch wirksamen Parasiten-Ant-genen, die mit den durch Schistosoma-Antigenen erhältlichen Antikörpern eine immunologische Bindungsfähigkeit zeigen, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Parasiten-Antigene aus Schnecken der Gattungen Biomphalaria, Oncomelania oder Bulinus mit wäßriger Salz- oder Pufferlösung unter Vermeidung der Denaturierung von Proteinen extrahiert und den dabei erhaltenen löslichen Extrakt, der gegebenenfalls nach bekannten biochemischen Reinigungsmethoden angereichert werden kann, zu einem physiologisch verträglichen immunisierenden Agens aufarbeitet
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Extraktion ein das Antigen enthaltendes Organ der genannten Schnecken verwendet
3. 3. Verwendung der nach Anspruch 1 und 2 erhaltenen immunisierenden Agentien als Injektionslösungen zur Bekämpfung der Schistosomiasis.
4. 4. Verwendung eines aus den Haptopankreas von Schnecken der Gattungen Biomphalaria, Oncomelania oder Bulinus nach dem Verfahren von Anspruch 1 gewonnenen immunisierenden Agens in Form von Injektionslösungen zur Bekämpfung von Schistosomiasis.