DE2628487A1 - Neuer antibiotikumkomplex und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung "betrifft einen neuen Anthracyclinantibiotikumkonplex, seine Herstellung und Gewinnung.

Die vorliegende Erfindung schafft somit einen neuen Anthracyclinantibiotilcumkoinplex» der hier als Figaro säurekomplex (figaroic acid complex) bezeichnet wird, wobei dieser Komplex hergestellt wird, indem man einen neuen Stamm von Streptοsporangium, als Streptosporangium sp. Stamm C-31 751» A.T.C.C. Ur. 31129 bezeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium,

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das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis eine wesentliche Menge an Figarosäurekomplex durch den Organismus im Kulturmedium gebildet ist und gewünsentenfalls den Figarosäurekomplex aus dem Kulturmedium gewinnt. Die Erfindung umfaßt die nicht aufgelöste Mischung von Anthracyclinantibiotika, die als Figarosäurekomplex bezeichnet werden, in verdünnter Lösung, als rohe Konzentrate oder in fester Form.

Fig. 1 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum des Figarosäurekomplexes (KBr-Pellet).

Fig. 2 zeigt die Ultraviolettabsorptionsspektren des Figarosäurekomplexes in O,1n HCl in Methanol (durchgehende Linie) und in 0,1n KaOH in Methanol (gestrichelte Linie).

Der neue Stamm von Streptosporangium, der als Streptosporangium sp. Stamm C-31 751 bezeichnet wird, wurde aus einer in Seelyville, Indiana, entnon^nenen Bodenprobe erislxci. üLirie äjuLtut c.es Grganlszr.is v^rce eel der Az.erlosx. Type Culture Collection, Washington, D.C. hinterlegt und zur permanenten Sammlung von Mikroorganismen als A.T.C.C. 31129 hinzugefügt.

Der Figarosäurekomplex inhibiert das Wachstum verschiedener gram-positiver Bakterien, beispielsweise Staphylococcus aureus und Mycobacterium tuberculosL s und verschiedener Protozoen und Hefen, beispielsweise Candida albicans» Histoplasma capsulatum, Trichomonas vaginalis und Trichomonas faetus. Die Substanz weist Phagen-induzierende Eigenschaften auf und inhibiert das Wachstum verschiedener lymphatischer und fester Tumorsysteme bei Rodenten (rodents) einschließlich Sarkom 180, L-1210 lymphatische Leukämie, Walker 256 Carcinosarkom, P-388 lymphatische Leukämie und

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B-16 Melanom. Der Figarosäurekomplex kann allein oder in Kombination mit anderen antibakteriellen Mitteln verwendet werden, um das Wachstum oder die Anzahl der oben erwähnten empfindlichen gram-positiven Bakterien» Hefen und Protozoen zu hemmen oder, vermindern.Er ist bei Waschlösungen für hygienische Zwecke brauchbar, beispielsweise zum Waschen von Händen und zur Desinfektion von diverser Laboratoriums-, Dental- und medizinischer Ausrüstung oder anderen kontaminierten Materialien und als bakteriοstatische Spülung für gewaschene Kleidung. Er ist auch brauchbar, um die oben erwähnten Tumorsysteme bei Mäusen und Ratten zu behandeln.

Der Stamm C-31 751 weist die folgenden morphologischen Eigenschaften auf: Es bildet sich ein spärliches Luft-Mycel. Während der frühen Wachstumsphase tritt auf der Spitze des Sporophors eine kurze, kompakte und irregulär gewundene Sporenkette auf. Die gewundene Sporenkette entwickelt sich zu einem echten Sporangium, das kugel- fcrmige Gestalt aufweist und dessen !Durchmesser 4 bis 12 μ beträgt. Die meisten der Sporangiophoren weisen eine Länge von 5 bis 10 μ auf. Bisweilen werden schlingenartige (looped) oder kurze gekrümmte (flexuous) Sporenketten gemeinsam mit der Sporangia gebildet. Das Substratmycel ist verzweigt, oft gekrümmt und vermutlich nicht-septiert (non-septated). Der Sporangiophor ist nicht-motil, weist eine kugelförmige bis ovale Gestalt auf und besitzt eine Größe von 0,7 bis 0,9 μ. Die Struktur der Sporenoberfläche wurde bislang nicht bestimmt.

Tabelle I berichtet von den auf verschiedenen Medien erzielten Kultureigenschaften, wobei die Beobachtungen nach 1 bis 2 Monaten Kultur bei 28⁰C erfolgten. Der Organismus bildet ein Luftmycel langsam auf Sucrose-Nitratagar» anorganischen Salsen-Stärkeagar, Kefeextrakt-Malζextraktagar und Hafermehlagar. Die Massenfarbe des Luft-

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mycels ist weißlich-rosa bis rosa. Ein Luftmycel wurde nicht gebildet auf Asparaginagars, Tyrosinagar, Nähragar und Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar.

Das Sporangium wird auf anorganischen Salzen-Stärkeagar» Hefeextrakt-Malzextraktagar und Hafermehlagar gebildet. Auf den letzteren zwei Medien wurden nach 7-w.öchiger Inkubation bei 28⁰C zahlreiche Sporangien beobachtet. Die Masse des Substratmycels weist bei makro- und mikroskopischer Beobachtung eine granuläre Gestalt auf. Die Hauptfarbe des Substratmycels ist rötlich-orange und rötlichpurpur auf Glucose-Asparaginagar bzw. auf Hefeextrakt-Malzextraktagar. In Glucose-Asparaginagar und Hefeextrakt-Malzextraktagar wird ein hell gelbliches» diffusionsfähiges Pigment gebildet. In Tyrosinagar und Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar wird eine Spur oder kein melanoides Pigment gebildet.

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	I	Sucrose-Nitratagar	TABELLE I	Umkehr farbe**	lebhaft gelblich	Luftmycel	diffundierbares	00	I	XO cn
	VJI			(reverse color)	orange	(aerial mycelium)	Pigment			K) 00
	I		Kulturcharakteristiken von Stamm C-3175I*	rosa	hell gelblich	sehr spärlich,	keines
		Glucoseasparagin-	Wachstum		braun	rosalich-weiß
		agar
		Glycerinasparagin-	spärlich,	stark rötlich	stumpf rötlich	keines	keines oder hell
		agar	fein granu	orange	purpurn bis		rötlich-gelb
		Anorganische Salze	lär	stark orange	dunkel weinrot	keines	keines
		st ärkeagar	mäßig,	fein ,granulär	dunkel., rose bis
		Tyrosinagar	granulär	mäßig,	tief rötlich	spärlich, weißlich	keines
			spärlich,	granulär	purpurn
CD			spärlich,	purpurartig rosa	keines	keines
CD		Nähragar	fein granu	bis leuchtend
CO QQ			lär	purpurn
00			mäßig,	dunkelviolett	keines	keines
CO		Hefeextrakt-Malz-	granulär
		extraktagar
			gut, ge	1- "bis 2-monatiger Kultur bei	spärlich, purpur	hell rötlich-gelb
CJ		Hafermehlagar	kerbt	artig rosa
		mäßig,	spärlich weißlich	purpurartig rosa
	Pepton-Hefeextrakt-	granulär	bis blaßrosa
	Eisenagar
		mäßig	keines	golden
	■^Beobachtungen nach
	280C.

**Das Pigment ist in Methanol löslich und hat eine pH-indikatorartige Eigenschaft: gelblich orange bei saurem und violett bei alkalischem pH.

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Die physiologischen Charakteristiken und die Kohlehydratverwertung von Stamm C-31 751 sind in den Tabellen II bzw. III dargestellt. Der Organismus reduziert Nitrat zu Nitrit in einem natürlichen organischen Medium, nicht jedoch in einem anorganischen Medium. ¥ie die meisten Micromonospora Specien ist er gegenüber Natriumchlorid ziemlich empfindlich. Er ist ein mesophiler Organismus. Bestimmte Kohlehydrate, wie Sucrose, Raffinose, lösliche Stärke und D-Mannit werden nach einer langen Zeitverzögerung verwertet.

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TABELLE II

Physiologische Charakteristiken von C-31751

CD CD CO CO CO CO

Unt ersuchungen

Nitratreduktion in anorganischem Medium

Nitratreduktion in organischem Medium

Gelatineverflüssigung

Stärkehydrolyse Magermilchagar

10 folge Magermilchlösung

Melaninbildung

Wirkung von NaGl in organischem Medium

Wachstumstemperatur

Ansprechen

negativ
stark positiv
vollständig verflüssigt

schwach positiv

geringes Wachstum,
schwache Hydrolyse

starke Koagulation und
langsame Peptonisierung

nicht gebildet

mäßiges Wachstum-bei 0 und
0,5 7> NaCl, gehemmt bei 1
und 1,5 #. Kein Wachstum
bei 2,5 #

maximales Wachstum bei
37⁰C. Mittleres Wachstum
bei 28⁰C und 43⁰C Kein
Wachstum bei 15⁰C und 48⁰C

Materialien und Methoden Czapek·sehe Sucrose-Nitratbrühe

Das von Leudemann* empfohlene organische Medium

Basalmedium: Hefeextrakt 0,4 $>_t Malzextrakt 1,0 und Glucose 0,4

Hayward'scher Stärkeagar Leudemann'sehes Medium*

Tyrosinagar und Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar

Basalmedium: Leudemann'sehe Hefe: Extrakt-Stärkeagar*

Hefeextrakt-Malzextraktagar: ISP Nr.2 Medium

*H.G.Leudemann: Micromonospora purpureochromogenes (Waksman and Curtis 1916) comb.nov. (subjektives Synonym: Micromonospora fusca Jensen 1932). Intl. J. Syst. Bacteriol.21: 240-247, 1971

CD K) OO

■P-CO

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TABELLE III

Kohlehydratverwertung bei Stamm C31751*

χ**

D(-)-Arabinose	4
L(4)-Arabinose	+ +
D-Xylose
D-Ribose	+ t
L-Rhamnose	+ +
D-Glucose	44
D(I)-Galactose
D-Fructose	+
D-Mannose
L(-)-Sorbose	4
Sucrose	4A
Lactose	4
Cellobiose	44

t +

D(-)-Melibiose Trehalose Raffinose D(-)-Melezitose lösliche Stärke Cellulose Glycerin Inosit D-Mannit D-Sorbit DuIcit . Salicin kein Zucker

■^Beobachtungen nach 1- bis 2-monatiger Kultur bei 28⁰C.

**Basalmedium I: Pridham-Gottlieb-Medium plus 0,1 #

Difco-Hefeextrakt.

II: Leudemann'sches organisches Medium,

zusammengesetzt aus 0,5 % Hefeextrakt»

0,1 % CaCO, und 1,5 % Agar in destilliertem

Wasser.

A: Luftmycel mäßig gebildet. Kein Luftmycel auf den anderen Zuckermedien.

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Der Stamm C-31751 enthält Meso-Diaminopimelinsäure (meso-DAP) als charakteristische Aminosäurekomponente in der Zellwand. Diagnostizierbares Kohlehydrat war nicht anwesend.

Um die obigen Charakteristiken zusammenzufassen, bildet der Stamm C-31751 ein weißlich-rosa (muschelrosa) luftmycel (aerial mycelium) und ein kugelförmiges Sporangium. Der Sporangiospor ist nicht motil. Der Sporangiophor ist kurz und weist üblicherweise eine länge von weniger als 10 μ auf. Die Massenfarbe des Substratmycels ist orange bis violett. Ein deutliches diffundierbares Pigment (einschließlich Melanin) wird nicht gebildet. I¹Ur das Wachstum werden beinahe alle üblichen Kohlehydrate verwertet. Die Zellwand des Stamms enthält Meso-DAP, jedoch keine diagnostizierbare Zuckerkomponente.

Diese Hauptcharakteristika deuten an» daß der Stamm C-31751 eine Species des Genus Streptοsporangium darstellt. Nach der taxonomisehen Klassifizierung von Streptοsporangiumspecies von H. Nonomura und Y. Ohara (J. Ferment. Technol. 47 (11): 701-709. 1969 und 52 (2): 71-77 (1974) sind 16 Species beschrieben. Unter diesen weisen acht Species ein rosaliches luftmycel und einen kurzen Sporangiophor auf; es handelt sich hierbei um Streptοsporangium rubrum Potekhina 1965» S. longisporum Schaffer 1969» S. roseum Couch 1955» S.amethystogenes Nonomura et Ohara 1960, S. amethystogenes var. nonreducens Prauser et Eckerdt 1967» S. vulgäre Nonomura et Ohara 1960, S. pseudovulgare Nonomura et Ohara 1969 und S. nondiastaticum Nonomura et Ohara 1969. Danach wurde S. violaceochromogenes MK-49 zu derselben Speciesgruppe zugefügt (japanische Patentschrift 49-42896 vom 4. April 1974).

Der Stamm C-31751 unterscheidet sich von Streptοsporangium amethystogenes, S. roseum und S. vulgäre hinsichtlich seines

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positiven Wachstums bei 42⁰C, von S. longisporum hinsichtlich seiner Glubosesporen, von S. nondiastaticum hinsichtlich seiner positiven Verwertung von Ehamnose, Inosit und Stärke und von S. pseudovulgare hinsichtlich seiner positiven Verwertung von Ehamnose und Inosit und seinem orangefarbenen oder rötlich purpurfarbenen Substratmycel. S. violaceochromogenes wird vom Stamm C-31751 hinsichtlich ihres farblosen oder goldfarbenen Substratmycels und ihrer negativen oder fraglichen Verwertung von Inosit und Ehamnose unterschieden. Der Stamm C-31751 hat mit Streptosporangium rubrum, von L.L. Potekhina in Mikrobiologiya ^4, 292 (1965) beschrieben, mehrere Charakteristika gemeinsam, beispielsweise die Luftmassenfarbe (aerial mass color), die Farbe des Substratmycels, das lösliche Pigment und die Sporengestalt. Jedoch sind die über das S. rubrum derzeit erhältlichen Beschreibungen nicht ausreichend, um einen endgültigen Schluß über die Identität der beiden Organismen zu ziehen und daher wird der Stamm C-31751 als nicht bestimmtes Species von Streptosporangium angesehen, bis weitere Daten erhältlich sind.

Herstellung des Komplexes.

Der Figarosäurekomplex wird hergestellt, indem man einen Figarosäure-produzierenden Stamm von Streptosporangium mit den Charakteristiken des Stamms A.T.C.C. 31129 oder einem Mutanten davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert. Der Organismus wird in einem Nährmedium zum Wachsen gebracht, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlehydrat, enthält. Zu Beispielen für bevorzugte Kohlenstoffquellen gehören Lactose, Glycerin, Sucrose, Maisstärke, Glucose, Mannose und Fructose. Wenn man im Nährmedium Stärke als Kohlenstoffquelle verwendet, kann man vor der Ernte Amylase zu der Brühe zusetzen, um irgendwelche Emulsionsprobleme, die auftreten könnten, zu vermindern. Das Nährmediuni sollte auch eine assimilierbare

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Stickstoffquelle» "beispielsweise Fischmehl, Pepton, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl» Baumwollsamenmehl und Maiseinweichflüssigkeit, enthalten. Man kann auch anorganische Nährsalze in das Medium einbringen und zu derartigen Salzen können irgendwelche der üblichen Salze gehören, die zur Lieferung von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Nitrat, Carbonat oder ähnlichen Ionen, in der Lage sind.

Die Herstellung des Figarosäurekomplexes kann bei irgendeiner Temperatur durchgeführt werden, die zu einem befriedigenden Wachstum des Organismus führt, d.h. Raumtemperatur bis zu ungefähr 43⁰C und wird günstigerweise bei einer Temperatur von ungefähr 27⁰C durchgeführt. Üblicherweise erhält man eine optimale Herstellung nach Inkubationszeiten von ungefähr 170 bis 210 Stunden. Das Medium ist normalerweise leicht alkalisch, jedoch kann der exakte pH gemäß den besonderen verwendeten Medien variieren. Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben und in Laboratoriums- oder industriellen Fermentern verschiedenen Fassungsvermögens durchgeführt werden. Wenn eine Tankfermentation durchgeführt werden soll, ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe zu bilden, indem man die Brühenkultur mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Organismus inoculiert. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inoculum erhalten hat, wird dieses aseptisch in den Fermentationstank überführt, um eine Produktion des antibiotischen Komplexes in großem Maßstab durchzuführen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum gebildet wird, kann dasselbe wie das in dem Tank zur Produktion des neuen.Komplexes verwendete Medium sein, solange es der Gestalt ist, daß man ein gutes Wachstum*der Mikroorganismen erhält, oder es kann von diesem verschieden sein.

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Wenn die Fermentation vollständig istι wird der antitiotische Komplex aus der ganzen Brühe mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, der organische Extrakt wird konzentriert und der feste Komplex wird durch Verdünnen des konzentrierten Extrakts mit einem geeigneten Anti-Lösungsmittel ausgefällt. Die Extraktion kann unter Zuhilfenahme von mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden, die hinsichtlich ihrer Polarität von Methylenchlorid zu n-Butanol variieren, und zwar in einem pH-Bereich von ungefähr 3»5 bis 8,5. Lösungsmittel im mittleren Polaritätsbereich, wie Ketone und Ester, sind bevorzugt, da man feststellt, daß sie selektiver als Alkohole sind, jedoch ausreichend polar sind, um gute Verteilungscharakteristiken zu ergeben. Zu Beispielen für besonders bevorzugte ExtraktionslösTJmgsmittel gehören Methylisobutylketon und Äthylacetat. Das am meisten bevorzugte Lösungsmittel ist Methylisobutylketon. Die Extraktion wird günstigerweise entweder unter schwach sauren Bedingungen, d.h. bei einem pH von 4,0 bis 5»0 durchgeführt, der durch Zugabe einer Mineralsäure, wie HCl oder ^SO, erzielt ist, oder unter schwach-sauren pH-Bedingungen der Brühe, d.h. bei pH 8 bis 8,5. Man erhält maximale Ausbeuten bei pH 4»5 "bis 5*0 mit Methylisobutylketon. Vorzugsweise gibt man zur Extraktionsmischung Filterhilfe zu und filtriert dann die Mischung. Die organische Phase wird konzentriert und mit einem geeigneten. Anti-Lösungsmittel, beispielsweise Äther, verdünnt, um den Figarosäurekomplex auszufällen. Bei der Gewinnung unter alkalischen Bedingungen kann der purpurfarbene Figarosäurekomplex in die rotorangefarbene freie Säureform überführt werden, indem man den Komplex in Wasser auflöst und die Lösung ansäuert, um den Säurekomplex auszufällen, der dann durch Filtrieren gewonnen oder in organische Lösungsmittel extrahiert werden kann. ',

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Eigenschaften des Figarosäurekomplexes

Der hier als Pigarosäurekomplex bezeichnete antibiotische Komplex ist in freier Säureform ein orange-roter amorpher Peststoff. Er ist in relativ nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Äther, Benzol und aliphatischen Kohlenwasserstoffen, beispielsweise η-Hexan, unlöslich, in niedrigen Alkoholen (Methanol, Äthanol, n-Butanol, 2-Propanol),Aceton, Tetrahydrofuran und Dioxan, größtenteils löslich und nur in sehr polaren Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid, vollständig löslich. Bei der Gewinnung unter alkalischen Bedingungen ist der Komplex tief purpurfarben, was die Umwandlung der Säureform in die anionische Porm anzeigt.

Der Pigarosäurekomplex bildet mit Basen leicht Salze, und pharmazeutisch verträgliche Salze des Komplexes, beispielsweise die pharmazeutisch verträglichen Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Der Komplex enthält nach Analyse angenähert 2,5 9^ Stickstoff. Er ist in wäßriger NaHCO, und Ba(OH)₂ löslich, wobei man rot-violette bzw. blaue Lösungen erhält. Mit alkoholischem Magnesiumacetat ergibt er eine dunkelrote Lösung mit roter Fluoreszenz und mit alkoholischem Eisen-III-chlorid eine schwarze Lösung (die bei Verdünnung orangebraun wird und eine violette Fluoreszenz aufweist). Der Komplex ergibt einen positiven Tollens-Test» ;jedoch sind die Garbazol- und Ninhydrin-Tests durch die Farbe des Pigments maskiert. Er ergibt mit saurem Zinkstaub, Natriumbisulf it und Wasserstoffperoxid keine Farbänderung. Mit alkalischem Zinkstaub tritt ein leichtes Verblassen der Farbe von violett nach rot auf und mit alkalischem Natriumbisulf it eine schnelle Änderung nach rot. Alkalisches Wasserstoffperoxid ergibt keine Wirkung, außer man gibt einen

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großen Überschuß zu» worauf die Farbe von violett zu rosa verblaßt.

Die Infrarot- und Ultraviolett-Absorptionsspektren des Figarosäurekomplexes zeigen an, daß es sich beim Komplex um eine Mischung von Anthracyclinkomponenten handelt. Das Infrarotspektrum (KBr Pellet) gemäß Fig. 1 zeigt Hauptbanden bei 2,94 (breit), 3,4, 6,04 bis 6,13, 6,18, 6,3, 6,95 (breit), 7,1 (breit), 8,1, 9,3, 9,5 und 9,7 μ. Die Ultraviolett-Absorptionsspektren des Komplexes unter sauren und "basischen Bedingungen sind in Fig. 2 dargestellt. Die Adsorptivität in Fig. 2 ist durch die Gleichung:

cf= —

bc

definiert, worin A die Adsorbierung darstellt, b die Zeilenbreite in cm angibt und c die Konzentration der Probe in g/l bedeutet. Bei einer Konzentration von 50 μg/ml zeigt der Figarosäurekomplex in 0,1η HCl in Methanol Absorptionspeaks (durchgehende Linie) bei 233» 253» 287 bis 288 (Schulter), 467 (Schulter), 480 (Schulter), 490, 511 (Schulter) und 524 (Schulter) ΐημ. In 0,1n ITaOH in Methanol zeigt der Komplex Absorptionspeaks (gestrichelte Linie) bei 238, 266 bis 268 (Schulter) und 553 πιμ.

Biologische Aktivitätsdaten

Die in vitro minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) des Figarosäurekomplexes wurden bei einer Anzahl Mikroorganismen bestimmt, wobei die übliche Röhrenverdünnungsmethode angewendet wurde. Die in Tabelle VI angegebenen Ergebnisse zeigen, daß verschiedene gram-positive Organismen, Hefe und drei Protozoen gegenüber dem Antibiotikum empfindlich sind. Gram-negative Organismen sind nicht empfindlich.

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TABELLE IV

AntimikrolDielles Spektrum des Pigarosäurekomplexe s

Te s torganismus
Bakterien:

Staphylococcus aureus Mycobacterium tuberculosis BCG Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis
Salmonella enteritidis

	MIC,ms/ml
A9537	1,6
A9579	25
A15119	50
A9843	>50
A9900	>50
A9531	>50

Hefen:

Candida albicans	A9540	50
Trychophyton mentagrophytes	A9870	>50
Microsporum canis	A9872	>50

Protozoen:

Histoplasma capsulatum	A15056	6,3
Trichomonas vaginalis	A20074	1,25
Trichomonas faetus	A20075	0,31

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Der Figarosäurekomplex wurde hinsichtlich, seiner Fähigkeit zur Induzierung von Bakteriophagenproduktion "beim lysogenen Stamm von Escherichia coli ¥ 1709 untersucht. Eine signifikante Induktion wurde "bis zu 0,8 μg/ml herab "beobachtet. Röhrenverdünnungsproteintests zur Bestimmung cytoxischer Effekte bei He La-Zellen in Gewebekultur ergibt einen 50 i» Endpunkt (ED₅₀) von 0,004 μg/ml (die Methode ist in "Antimicrobial Agents and Chemotheia py" 1966: 613-618, 1967 beschrieben).

Die Wirkung des Figarosäurekomplexes auf verschiedene rodente TumorsystemeS/untersucnt. Einzelheiten der angewendeten Methoden sind in Cancer Research 22: 167-173 1962 und Cancer Chemoth. Reports 3: 1-87 (Teil 3)» 1972, beschrieben. Die Behandlung von Mäusen mit Sarfcom 180, das subkutan als fester Tumor implantiert wurde, mit Figarosäurekomplex-Fermentationsbrühe bewirkte eine 37%-Inhibierung der Tumordurchmesserzunähme (geschätzt 75 $> Inhibierung der Tumorgewichtszunahme). Die Behandlung mit derselben Brühe verlängerte auch die Lebensspanne von Mäusen mit L-1210 Leukämie um 29 $> im Vergleich zu den Kontrolltieren. Man stellte fest, daß die Brühe mit Figarosäurekomplex gegen Walker 256-Carcinosa2k om (intramuskulär),?.388 lymphatische Leukämie und B-16 Melanom bei Sodenten aktiv war. Es wurde auch fester Figarosäurekomplex untersucht und bei verschiedenen Tumorsystemen als wirksam'festgestellt. Die Ergebnisse bei L-1210 Leukämie und B-16 Melanom bei Mäusen sind in Tabelle Y dargestellt.

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TABELLE V

Wirkung des Eigarosäurekomplexes bei transplantierten Mäusetumoren

L-1210 Leukämie

Dosis mittlere T/C % überle-

μg/kg/Tag Gewichts- 14ST bende differenz 5 Tage (T -C, g)

128

64

32

16

5_V2

-2,8

-2,6

-0,7

T ox

150

129

114

1/6

6/6

6/6

6/6

B 16 Melanom	T/C ia MST	Überle bende 5 Tage
mittlere Gewichts differenz (τ -σ, g)	T ox	6/6
-3,4	Tox*	6/6
0	254<«	6/6
-3,4		6/6
-3,7 -	206	6/6
-0.9	160	6/6
+ 3,6	126	6/6
+0,9	129	6/6
-1,7

Behandlung: Einmal täglich 9 Tage lang intraperitoneal.

Beurteilung: T/C % MST = mittlere Überlebenszeit in Tagen: behandelt MST/Xontrolle MST χ 100.

Kriterien:

T/C 125 als signifikante Tumorinhibierung betrachtet (Verlängerung des Überlebens der Wirtstiere) .

(1) 2/6 Überlebende bei 60 Tagen.

(2) 4/6 Überlebende bei 60 Tagen.

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» ηχ ·

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindungi ohne sie zu beschränken. Skellysolve B ist eine Petrolätherfraktion mit Siedepunkt 60 "bis 68⁰C, die im wesentlichen aus η-Hexan besteht. MIBK ist Methylisobutylketon.

Beispiel Schüttelkolbenfermentation

Man läßt den Organismus Streptοsporangium sp. Stamm C-31751 auf einem Agar-Schrägmedium wachsen, das aus 2 g D-Glucose, 20 g Hafermehl, 2 g Sojapepton und 20 g Agar besteht und mit destilliertem Wasser auf einen Liter gebracht ist. Nach mindestens 6 Tagen Wachstum bei 27⁰C werden Sporen in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 100 ml steriles Medium enthält, das aus 50 g Maisstärke, 10 g Sojamehl, 10 g Erdnußmehl und 3 g CaCO, besteht und mit destilliertem Wasser auf 1 Ltr. aufgefüllt ist. Diese vegetative Kultur wird auf einer Schüttelvorrichtung (Gyrotory tier shaker, Modell G-53» New Brunswick Scientific Co., Inc.), der bei 210 Umdrehungen/ Min. eingestellt ist und einen Kreis mit einem Durchmesser von 5,1 cm beschreibt, bei 27⁰C inkubiert. Nach 48 Std. überführt man 4 ml der Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben, der 100 ml steriles Produktionsmedium enthält, das aus 50 g Sucrose, 20 g Sojamehl, 20 g Erdnußmehl und 3 g CaCO^ besteht, das mit destilliertem Wasser auf 1 ltr. aufgefüllt ist. Man inkubiert die Kultur 170 Std. lang bei 27⁰C auf einer Schüttelvorrichtung, die bei 230 Drehungen/Min, eingestellt ist. Zu diesem Zeitpunkt findet man antibiotische Aktivität, bestehend aus dem Eigarosäurekomplex, im KuIturfiltrat und im Mycel.

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Beispiel

Tankfermentation

■Man inoculiert einen Tankfermentor mit 37»8 Ltr. sterilem Produktionsmedium (wie in Beispiel 1) mit 1,89 Ltr. vegetativer Kultur» die gemäß Beispiel 1 hergestellt wird» wobei man "bei einer Rührergeschwindigkeit von 375 Drehungen/ Min. rührt, in einer Geschwindigkeit von 76,5 Ltr./Min. belüftet und bei 27⁰C inkubiert. Nach 190 Std. wird der antibiotische Komplex isoliert.

Beispiel Tankfermentation

Man inoculiert einen Taik ferment or mit 3030 Ltr. Produktionsmedium (wie in Beispiel 1) mit 152 Ltr. vegetativer Kultur (wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt), wobei man mit einer Rihregeschwindigkeit von 155 Drehungen/Min, rührt, in einer Geschwindigkeit von 1420 Ltr./Min. belüftet und bei 27⁰C inkubiert. Nach 210 Std. wird der Figarosäurekomplex isoliert.

Beispiel

Extraktion von Brühe und Myeel bei (etwas alkalischen) Brühen-pH mit n-Butanol

Die Filtration einer Brühe aus einer Schüttelkolbenfer— mentation unter Verwendung von insgesamt 5 Ltr. Äiisgangsmedium ergibt 2,5 Ltr. Filtrat mit pH 8,5. Hiervon extrahiert man 1,5 Ltr. mit zweimal 1 Ltr. Chargen n-Butanol, trennt die Phasen und konzentriert die vereinigten organischen Phasen. Verdünnen des Konzentrats mit Äther.ergibt 1,4 g eines amorphen purpurfarbenen Feststoffs* der bei Mäusen gegen 1—1210 Leukämie bei 2 rag/kg/Tag aktiv ist. Man rührt den Mycelkuchen aus der Brühenfiltration 30 Min.

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mit einer ausreichenden Menge Methanol, um eine fluide Aufschlämmung zu erhalten und filtriert dann. Das Piltrat wird konzentriert, Ms die Hauptmenge des Alkohols entfernt ist und der wäßrige Rückstand wird wie oben extrahiert, wobei man 6,35 g Figarosäurekomplex erhält. Man stellt fest, daß das Produkt, ein amorpher, purpurfarbener Feststoff, gegen L-1210 Leukämie bei Mäusen bei einer Konzentration von 8 mg/kg/Tag aktiv ist.

Beispiel

Extraktion der Gesamtbrühe bei Brühen-pH mit n-Butanol

1,5 Ltr. 6-esamtbrühe mit pH 8,6 wird mit ungefähr einem gleichen Volumen n-Butanol gerührt. Die dicke Masse wird durch einen Celite-Euchen (Handelsbezeichnung der von Johns-Manville Products Co. hergestellten Diatomeenerde) filtriert, die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird auf ein kleines Volumen konzentriert. Dieses wird mit überschüssigem Ä'ther verdünnt, wobei man 621 mg Figarosäurekomplex ausfällt. Man stellt fest, daß der amorphe, purpurfarbene Feststoff gegen L-1210 Leukämie bei Mäusen bei einer Dosis von 0,2 mg/kg/Tag aktiv ist. Der Feststoff schmilzt nicht, zersetzt sich jedoch oberhalb 200⁰C.

Beispiel' Extraktion der Gesamtbrühe bei saurem pH mit n-Butanol

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels mit der Ausnahme, daß der pH der Gesamtbrühe mit HCl auf pH 4,0 eingestellt wird und während der Extraktion bei diesem Wert gehalten wird. 4 Liter Gesamtbrühe liefern 1,7 g Figarosäurekomplex in freier Säureform als orange-roten

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Feststoff. Der Feststoff ist bei Mäusen in einer Konzentration von 0,25 mg/kg/Tag toxisch und zeigt Phagen-induzierende Eigenschaften bis herab zu einer Verdünnung
von 1,5 μg/ml.

Beispiel

Extraktion von Gesamtbrühe (leicht alkalisch) mit n-Butanol in großem Maßstab

Man rührt die Gesamtbrühe (2788 Ltr. bei pH 8,6) mit
1357 Ltr. n-Butanol. Die organische Phase wird abgetrennt wobei man 783 Ltr. reichen Extrakt erhält, der auf 13 Ltr. konzentriert wird. Zugabe von 80 Ltr. "Skellysolve B" ergibt 728 g des rohen, purpurfarbenen Figarosäurekomplexes.

Beispiel 8

Saure Extraktion der Gesamtbrühe mit Methylisobutylketon (MIBK)

Gesamtbrühe (10 Ltr.), die in gefrorenem Zustand gelagert wurde, wird aufgetaut und nach Einstellung des pH auf 4»5 20 Min. lang mit 10 Ltr. MIBK gerührt. In die Mischung
wird Filterhilfe eingerührt und erstere wird dann auf
einem Bett mit Filterhilfe filtriert. Man trennt die Phasen im Filtrat und konzentriert die organische Phase auf ein kleines Volumen. Verdünnen mit überschüssigem "Skellysolve B" ergibt 4 g des orange-roten Figarosäurekomplexes in Form der freien Säure mit Phagen-induzierender Aktivität bei einer Verdünnung von 6,2 μg/ml.

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Beispiel

Saure Extraktion der Gesamtbrühe mit Methylisobutylketon in großem Maßstab (MIBK)

G-esamtbrülie (3095 ltr.) wird durch Zugabe von 49 Ltr. 3C$iger H₂SO. unter Rühren und Kühlen bei 10⁰C von pH 8,35 auf pH 3,35 eingestellt. Zwei Volumina (6412 Ltr.) MIBK werden mit der Brühe gerührt, worauf überschüssige Filterhilfe (Diatomeenerde) zugesetzt wird. Man filtriert die Mischung durch ein vorüberzogenes Vakuumfilter unter Verwendung von zusätzlichen 2554 ltr. MIBK als Spülflüssigkeit. 33er reiche MIBK-Extrakt (7555 Ltr.) wird abgetrennt und auf 10 Ltr. konzentriert. Während der Konzentration fallen 1,285 kg feuchte Feststoffe aus und werden gesammelt. Zugabe von 100 Ltr. "Skellysolve B" zum Konzentrat liefert weitere 365 g rohes, Öliges Material. Die erste Fraktion von Feststoffen wird auf 85,8 g getrocknet und in drei Chargen aufgeteilt. Jede von diesen wird in 4 Ltr. Aceton gerührt und unlösliches Material wird abfiltriert. Das letztere erweist sich als Filterhilfe und wiegt nach Vereinigung und Trocknung 367 g. Man konzentriert die Acetonlösung und verdünnt mit überschüssigem Äther, wobei man 294,5 g rohen Figarosäurekomplex erhält. Eindampfen des Äthers ergibt 19,2 g inaktives Material. Der ölige "Skellysolve B"-Niederschlag wird ebenfalls mit Äther behandelt, erweist sich jedoch als inaktiv.

Beispiel 10

Umwandlung des FigaroSäurekomplexsalzes in seine freie Säureform

Der rohe, purpurfarbene Feststoff (25 g), der durch alkalische n-Butanolextraktion, wie in Beispiel 7 beschrieben, erhalten wurde, wird bei 25⁰C in 1 Ltr. H₂O gerührt, bis er sich aufgelöst hat. Durch tropfenweise Zugabe von

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konzentrierter HCl unter Rühren stellt man den pH der purpurfarbenen Lösung von 8,3 nach unten auf 1,1 ein. Es bildet sich Figarosäurekomplex in Form der freien Säure als feiner, schlammartiger, ziegelroter Niederschlag, der durch Zentrifugieren gesammelt wird. Nach dem Trocknen wiegt er 13*6 g und erweist sich gegenüber dem L-1210 Tumorsystem bei Mäusen bis herab zu 0,2 mg/kg/Tagesdosis als aktiv. Man lyophilisiert die überstehende Flüssigkeit, wobei man insgesamt 10,0 g völlig inaktive amorphe Feststoffe erhält, die nach Verbrennung 7,8 # Asche enthalten. Die Ergebnisse der Verbrennungsanalyse zeigen an, daß es sich bei dem an den purpurfarbenen anionischen Pigarosäurekomplex gebundenen Material in großem Maße um organisches Material handelt.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   Verfahren zur Herstellung des als Figarosäurekomplexes "bezeichneten an tibi ο tischen Komplexes, dadurch gekennzeichnet» daß man einen Figarosäure-produzierenden

   31129 in^ Stamm Streptosporangium mit den Charakteristiken von ATCC einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis durch den Organismus im Kulturmedium eine wesentliche Menge an Figarosäurekomplex gebildet istl

   Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm A.T.C.C. 31129 oder einen Mutanten davon verwendet.

   Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer weiteren Stufe den Figarosäurekomplex aus dem Kulturmedium gewinnt.

   Verfahren gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die gesamte Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, die organische Phase konzentriert und durch Verdünnen des konzentrierten organischen Extrakts mit einem Anti-Lösungsmittel den festen Figarosäurekomplex ausfällt .

   Verfahren gemäß Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß man die Gesamtbrühe mit n-Butanol extrahiert und den festen Komplex aus dem konzentrierten organischen Extrakt mit einem Äther ausfällt.

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   6. Verfahren gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet! daß man die Gesamfbrühe mit Säure auf einen pH von ungefähr 4»5 bis 5»O einstellt» die Brühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, die organische Phase konzentriert und den festen Figarosäurekomplex durch Verdünnen des konzentrierten organischen Extrakts mit einem Anti-Lösungsmittel ausfällt.

   7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet» daß man die angesäuerte Brühe mit Methylisobutylketon extrahiert und den festen Komplex aus dem konzentrierten organischen Extrakt mit einem Äther ausfällt.

   8. Figarosäurekomplex oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, erhältlich nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 "bis 7.

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