DE2602177C3

DE2602177C3 - Verfahren zur Herstellung eines Hüssigen lagerfähigen Lebend-BCG-Impfstoffs

Info

Publication number: DE2602177C3
Application number: DE2602177A
Authority: DE
Inventors: Louis Chambon; Marina Gheorghiu Geb. Guran
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1975-01-23
Filing date: 1976-01-21
Publication date: 1980-03-13
Also published as: ZA76330B; BE837868A; NL7600441A; DK23476A; AU1050276A; JPS5198319A; DK143316B; GR59924B; DE2602177B2; OA05220A; FR2298337A1; AT344884B; PT64714B; SE7600669L; GB1514091A; ES444580A1; PT64714A; ATA41076A; FR2298337B1; DE2602177A1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen definierte Verfahren.

Lebende Bakterien enthaltende Impfstoffe stellen erhebliche Probleme hinsichtlich ihrer Konservierung bzw. Aufbewahrung. In der Tat kann die Anzahl der in ihnen enthaltenen lebenden Bakterien nach ihrer Herstellung schnell abnehmen. Die immunisierende Wirkung dieser Impfstoffe, die von der Anwesenheit von lebenden Bakterien abhängt, kann daher in gleicher Weise schnell nachlassen und sogar vollständig 4> verschwinden. Im Fall des BCG-Impfstoffs erleiden die aus den Kulturen gewonnenen Bakterien, nachdem man sie in einem Medium suspendiert hat, das zu einem Viertel aus einem Kulturmedium (Nährmedium) und zu drei Vierteln aus destilliertem Wasser besteht (die übliche Methode der Herstellung von frischem flüssigem Impfstoff) und bei 4°C aufbewahrt, nach 15 Tagen eine Verminderung df>r Lebensfähigkeit um die Hälfte.

Diese Instabilität des frischen flüssigen Impfstoffs ist eine Ursache für den Verlust eines erheblichen Anteils der Produktion, wenn man den Impfstoff nicht innerhalb kurzer Zeit verbraucht, während der die Lebensfähigkeit der Bakterien dazu ausreicht, einen wirksamen Impfschutz zu ergeben. Eine Konsequenz dieser Instabilität besteht in der Notwendigkeit einer ununter- wi brochenen Produktion des Impfstoffs, damit sichergestellt ist, daß stets eine Impfstoffreserve vorhanden ist.

Aus wirtschaftlichen Gründen, die mit dieser Herstellung zusammenhängen, neigt man dazu, die zur Züchtung der Bakterien angewandten Zeiträume bis zu b^r> dem Augenblick auszudehnen, bei dem sich eine maximale Produktion ergibt, was insbesondere nach Ablauf von 14 bis 21 Tagen der Fall ist, obwohl es bekannt ist daß jüngere Kulturen, insbesondere die mit einem Alter von 5 bis 8 Tagen, normalerweise ein stärkeres Impfvermögen besitzen. In diesem Stadium sind die Bakterienmengen, die sich bis dahin entwickelt haben, jedoch relativ gering, so daß die Unterbrechung des Züchtungsvorgangs zu hohe Herstellungskosten zur Folge hätte.

Zur Oberwindung der Schwierigkeiten, die den flüssigen frischen Impfstoffen eigen sind, die lebende Mycobakterien enthalten, sind bereits die Anwendung von Konservierungsmethoden wie die Gefriertrocknung vorgeschlagen worden, wobei zu sagen ist daß diese Methoden nicht ohne Nachteile sind.

Insbesondere ist es möglich geworden, den BCG-Impfstoff durch Gefriertrocknung während eines Jahres bei 4⁰C und sogar während mehrerer Jahre bei —25° C aufzubewahren. Die Gefriertrocknung hat jedoch zur Folge, daß ein erheblicher Anteil der Bakterien abstirbt oder in einen Zustand einer tiefen Anabiose überführt wird. Dieser Verlust der »Lebensfähigkeit« beträgt grob gesprochen mehr als 50%. Vom Standpunkt des Immunprozesses aus gesehen scheinen die Stoff Wechselbeziehungen am wichtigsten zu sein, die sich zwischen den lebenden Keimen und der Parasitenzelle abspielen. Diese Beziehungen manifestieren sich in einer erhöhten Stoffwechselaktivität, die sich in einer Steigerung der Menge der Lysosomen und der hydrolysierenden Enzyme in den Makrophagen wiederspiegelt von denen die spezifische und die nichtspezifische Immunität abhängt.

Zur Einschränkung der sich daraus ergebenden Verminderung der Lebensfähigkeit und des Verlustes der Wirksamkeit sind verschiedene Lösungen vorgeschlagen worden, wie jene, die darin besteht, die Gefriertrocknung in Gegenwart von Dimethylsulfoxid zu bewirken. Diese Lösungen sind nicht vollständig zufriedenstellend, wobei insbesondere die Gefriertrocknungsbehandlungen relativ aufwendig sind.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, die BCG-Keime durch Einfrieren und Lagern bei tiefer Temperatur, beispielsweise bei —70° C oder —196° C zu konservieren. Die Keime werden dann durch Auftauen wieder zum Leben erweckt.

Die zum Einfrieren und Auftauen der Mycobakterien angewandten Maßnahmen sind jedoch schwierig durchzuführen. Es ist dabei notwendig, eine bestimmte Geschwindigkeit des Einfrierens und Auftauens rigoros einzuhalten.

Eine der Schwierigkeiten, die beim Einfrieren auftritt, beruht auf der Tatsache, daß man nicht sofort ein vollständiges Einfrieren des Inhalts der Mycobakterien erreicht. Insbesondere stellt man fest, daß bei Temperaturen zwischen — 10°C und -4O⁰C die Gefahr einer starken Schädigung der Mycobakterien besteht, was wahrscheinlich eine Folge davon ist, daß nur ein Teil des Inhalts dieser Mycobakterien einfriert oder daß sich lokale Elektrolytkonzentrationen ergeben, die in den noch nicht eingefrorenen Bereichen zu groß werden könnten. Es ist bereits vorgeschlagen worden, dieses Einfrieren in Gegenwart von schützenden Mitteln, wie Glycerin oder Polyvinylpyrrolidon, durchzuführen. Man hat angenommen, daß diese Schutzmittel, und insbesondere Glycerin, in der Lage sind, das in diesen Mycobakterien enthaltene Wasser zu fixieren, das in dieser Weise am Einfrieren gehindert wird, so daß die Bildung von Eiskristallen in der Zelle vermindert wird.

In allen Fällen ist festzustellen, daß man nach dem Auftauen nur sehr instabile Mycobakterienkulturen

erhält, die schnell und sogar noch schneller als die frischen Kulturen absterben, gleichgültig, ob das Einfrieren und das Auftauen in Gegenwart von Glycerin, Polyvinylpyrrolidon, Dimethylsulfoxid oder anderen schützenden Mitteln durchgeführt wurden.

Die Konservierung durch Einfrieren ist daher kaum für die Konservierung von Impfstoffen auf der Grundlage von Mycobakterien geeignet Sie hätte auch zur Folge, daß sowohl die Hersteller als auch die Benutzer über geeignete »Gefrierketten« verfügen, was in der Praxis undenkbar ist

Die sich bei der Anwendung der herkömmlichen Konservierungstechniken stellenden Schwierigkeiten sind schließlich so groß, daß der flüssige frische Impfstoff trotz seiner Nachteile in starkem Umfang verwendet wird.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, die obigen Nachteile zu überwinden und insbesondere ein wesentlich einfacheres und billigeres Verfahren zur Konservierung bzw. Aufbewahrung von Mycobakterien enthaltenden Impfstoffen (Vakzinen) anzugeben, das die Wirksamkeit dieser Impfstoffe wenn nicht vollständig, so doch in ausreichend großem Umfang aufrechterhält, so daß diese Impfstoffe selbst nach langen Lagerzeiten mit Erfolg angewandt werden können. Die Impfstoffe oder Vakzine, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden kann, sind jene, die man ausgehend von den Stämmen erhält, die unter der Bezeichnung BCG bekannt sind, insbesondere jene, die unter den Hinterlegungsnummern 1010, 1011 und 1019 an der Trudeau Mycobacterial Culture Collection USA, oder im Fall des zweiten Stammes unter der Nummer 11 173 P 2 in der Sammlung des Institut Pasteur hinterlegt sind.

Die Lösung dieser Aufgabe geben die Patentansprüche an.

Aus der DE-OS 14 92 179 ist es zwar bereits bekannt, bei inaktivierten Mikroorganismen zur Herstellung von Impfstoffen Dimethylsulfoxid zuzusetzen, um die darin enthaltenen Wirkstoffe zu lösen. Hieraus konnte jedoch nicht entnommen werden, daß DMSO sich gerade für die Konservierung von Lebend-BCG-Impfstoffen eignen würde.

Außerdem war es aus der DE-OS 21 20 929 schon bekannt. Viren mit DMSO zu konservieren. Auch hieraus wird die Erfindung nicht nahegelegt, da Viren keinen Stoffwechsel wie die Bakterien aufweisen und aus so einfachen Strukturen wie Viren nicht auf die hinsichtlich ihrer Zellstruktur, ihres Stoffwechsels und ihrer inneren Organisation höchst komplizierten Bakterien geschlossen werden kann.

Der erfindungsgemäß erhaltene Impfstoff wird vorzugsweise bei einer Temperatur aufbewahrt, die zwischen +2°C und +6°C und noch bevorzugter bei etwa 4°C liegt. Vorteilhafterweise wird die Menge des Konservierungsmittels derart ausgewählt, daß die Lebensfähigkeit der Bakterien nach einer Lagerung von 3 Monaten mindestens noch etwa 50% betagt, bezogen auf den Zustand vor der Konservierung. Die Dauer der Behandlung reicht dazu aus, daß das in dieser Weise definierte Medium seine Schutzwirkung gegenüber den lebenden Bakterien ausübt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch bemerkenswert, daß man zwischen der Züchtung der Mycobakterien und der Anwendung des Impfstoffs keine Stufe des Gefrierens durchläuft.

Vorzugsweise beträgt die Menge des Glycerins, (das das bevorzugte Konservierungsmittel darstellt) oder des Dimethylsulfoxids etwa 5 Vol.-°/o der gesamten Lösung.

Die Erfindung beruht somit auf eier Erkenntnis, daß Glycerin und Dimethylsulfoxid eine Wirkung entfalten, die die Konservierung der Mycobakterien ohne jegliches Einfrieren begünstigt, so daß es nicht erforderlich ist die Mycobakterien gegen irgendeinen osmotischen Schock oder die Bildung von Eiskristallen in den Zellen zu schützen.

ίο Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man somit einen nicht-geschädigten Impfstoff während längerer Zeit aufbewahren, der den essentiellen Stoffwechsel und die Reizfähigkeit des retikuloendothelialen Systems eines frischen Impfstoffs beibehält

Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine erhebliche Einsparung in bezug auf die Zeiträume, nach denen die Impfstoffe frisch hergestellt werden müssen, da diese Zeiträume weiter auseinanderliegen können. Es wird in dieser Weise sogar möglich, die Züchtungszeiten zu begrenzen, so daß man Impfstoffe mit maximaler Aktivität erhält, ohne daß sich Ausbeuteverluste ergeben, die mit den Produktionskosten unverträglich wären.

Die für das Überleben der Mycobakterien notwendigen Nährstoffe bestehen vorzugsweise aus den für die Züchtung dieser Bakterien angewandten Kulturmedien. Diese Kulturmedien können in ihrer üblichen Form oder verdünnt eingesetzt werden, wozu man beispielsweise destilliertes Wasser verwendet. Wenn man eine solche Verdünnung bewirkt, dient sie dazu, das Medium an die isotonischen Bedingungen anzunähern. In allen Fällen darf die Verdünnung nicht so weit geführt werden, daß das Risiko einer Lyse der Bakterien besteht. Durch das Verdünnen wird die spätere Verwendung und insbesondere die Verabreichung dieser Zubereitungen in Form des Impfstoffs erleichtert. Vorteilhafterweise enthalten diese Medien keine Dispergiermittel, d. h. Mittel, die man üblicherweise lediglich zu dem Zweck zusetzt, eine homogene Entwicklung der Kulturen zu erleichtern.

Hinsichtlich der üblichen Formulierung dieser Kulturmedien kann es von Vorteil sein, sie mit Humanalbumin in Mengen zwischen etwa 1 g und etwa 10 g pro 100 ml des Mediums und vorzugsweise in einer Menge von 1,75 g pro 100 ml des Mediums zu versetzen.

Schließlich verwendet man in vorteilhafter Weise Bakterien, die aus jungen Kulturen, d. h. Kulturen hervorgegangen sind, die unter den besonderen angewandten Bedingungen ihr Maximum der Entwicklung noch nicht erreicht haben.

Vorteilhafterweise kann das Nährmedium aus den Kulturmedien bestehen, die unter den Bezeichnungen »Sauton« und »Dubos« bekannt sind, wobei man vorzugsweise das letztere einsetzt. Die Zusammensetzung dieser Medien ist weiter unten angegeben, wobei zu sagen ist, daß diese Medien gewünschtenfalls verdünnt werden können.

Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Konservierungsmedium besitzt die folgende Zusammensetzung:

Monokaliumphosphat
Dinatriumphosphat
Asparagin
Kaseinautolysat
b5 Λ imoniumeisencitrat,
5^ü/oige Lösung,

Magnesiumsulfat, 1%ige Lösung,
Calciumchlorid,0,05%ige Lösung,

Ig
6,3 g

2g
2g

Zinksulfat, 0,01 %ige Lösung,
Kupfersulfat 0,01 %ige Lösung,
Humanalbuminfraktion V Cohn,
17,5°/oige Lösung,
Glukose, 50°/oige Lösung,
Glycerin, 50%ige Lösung,
Destilliertes Wasser

26 02	177 a	5 ml
1 ml	VJ Tween 80(Polyoxyäthylensorbitan-
1 ml	monooleat), 10%ige Lösung,	10 ml
	5%ige Lösung der Fraktion V von	1 ml
100 ml	Rinderplasma	1000 ml
10 ml 5	Glukose, 50%ige Lösung,
100 ml	Destilliertes Wasser ad
790 ml

in dieser Zubereitung kann das Glycerin durch Dimethylsulfoxid ersetzt werden.

Es hat sich gezeigt, daß die Lebensfähigkeit der Bakterien bei der Lagerung aufgrund des erfindungsgemäßen Konservierungsverfahrens wesentlich größer ist als diejenige der frischen Impfstoffe. Demzufolge führen diese stabileren Impfstoffe zu gleichmäßigeren Ergebnissen. Da diese Impfstoffe haltbarer sind, sind die Verluste nur begrenzt, falls überhaupt vorhanden.

Andererseits ist festzuhalten, daß diese Verbesserung in sehr einfacher und leicht durchführbarer Weise erreicht werden kann und die Produktionskosten kaum ändert.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Impfstoffe können insbesondere mit Hilfe der Impflanzette oder durch Injektion verabreicht werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des auf den BCG-Impfstoff angewandten Konservierungsverfahrens nach der Erfindung.

Vor der Konservierung werden die Bakterien unter Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen bereitet. Diese Herstellung besteht darin, daß man den Bakterienstamm in einem geeigneten Medium züchtet. Für den BCG-Impfstoff verwendet man als Medien vorteilhafterweise die Medien des Typs »Sauton« oder des Typs »Dubos«, deren Zusammensetzung die folgende ist:

Sauton

ml Unter Anwendung der für die Herstellung des

frischen flüssigen Impfstoffs üblichen Techniken züchtet

ίο man die Bakterien zweimal auf dem oder den ausgewählten Kulturmedien. Nach Ablauf des zweiten Durchgangs gewinnt man den Bakterienschleier und wäscht ihn.
In den folgenden Beispielen werden junge Kulturen

ι '< (d. h. mit einem Alter von 6 bis 11 Tagen) und insbesondere Kulturen mit einem Alter von S Tagen angewandt

Beispiel 1

Man bringt die Bakterien des Stammes, der unter der Nummer 1011 an der Trudeau Mycobacterial Culture Collection hinterlegt ist, und die in 3er obigen Weise hergestellt sind, in einer Menge von 50 mg pro m! in die Lösungen A, B und T ein, deren Zusammensetzung im folgenden angegeben ist

30

35

A — Bouillon Dubos ohne Netzmittel (beispielsweise ohne Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, die man statt mit Rinderalbumin mit injizierbarem Humanalbumin und Glycerin in einer Menge von 5% versetzt hat

B - Die gleiche Bouillon Dubos wie die Lösung A, die jedoch anstelle von Glycerin Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 5% enthält

T — Auf ein Viertel verdünnte Sauton-Lösung für den als Vergleich dienenden Impfstoff (übliche Laboratoriumstechnik).

Die Lösung T entspricht derjenigen, die man üblicherweise zur Herstellung von flüssigem frischen Impfstoff verwendet Diese Lösung dient als Vergleich für die erfindungsgemäßen Lösungen A und B.

Die in dieser Weise bereiteten Suspensionen werden in einer Menge von jeweils 0,6 bis 1 ml pro Ampulle in Ampullen aufgeteilt. Diese Maßnahme erfolgt unter sterilen Bedingungen.

Die Aufbewahrung erfolgt bei 4° C während 7 Monaten, wobei die Lebensfähigkeit der Impfstoffe in regelmäßigen Intervallen geprüft wird. Hierzu wendet man die Methode der lebensfähigen Einheiten an (auf dem Loewenstein-Jensen-Medium nach der Technik, die in dem Guide Technique 67-6 publication O. M. S. beschrieben ist).

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt, die für jede Lösung in Abhängigkeit von der Lagerungszeit die Anzahl der lebensfähigen bzw. züchtbaren Einheiten (MUC) pro mg des halbfeuchten BCG-Impfstoffs angibt.

Tabelle I

Anzahl der lebensfähigen Einheiten in 1 mg des mit Hilfe der Impflarizette zu verabreichenden BCG-Impfstoffs, der (nach der Verdünnung mit den Lösungen A, B bnd T) bei +4 C gelagert wurde

Asparagin	4g	60 ml
Zitronensäure	2g	94OmI
Dikaliumphosphat	0,5 g	1 Liter
Magnesiumsulfat	0,5 g
Ammoniumeisencitrat	0,05 g
Glycerin
Destilliertes Wasser
Dubos
Monok^liumphosphat	ig	1 ml
Dinatri'lmphosphat	6,3 g	1 ml
Asparagin	2g	1 ml
Kaseini'utolysat	2g	1 ml
Ammo^iumeisencitrat,		1 ml
5%ige Lösung,
Magnesiumsulfat, l°/oige Lösung,
C^alciunldllorid, 0,05%ige Lösung,
Z'inksulfa'.O.Olo/oige Lösung,
K-upfen>ulr,^-lt. 0,01 %ige Lösung,

Vor der Lagerung
Nach 15 Tagen

7,5 9,4

10⁶
10⁶

8,'J 9,2

10⁶
10⁶

16,9
0,6

10⁶
10⁶

	Fortsetzung	Λ	26 02	177	10"	8	T	• 10⁶
7		1,34 ·			10"		13,44	■ 10⁶, 61%
Nach 1 Monat	9,94 ■			10⁶	10,38	• 10⁶
Nach 2 Monaten	3,3 ·		B	10⁶	2,6	• 10⁶
Nach 3 Monaten	8,08 ■	ίο⁶	7,1 ■	10⁶	1,68	• 10⁶
Nach 4 Monaten	5,9 ·	10"	8,04 ·	10⁶	1,2	• 10⁶
Nach 5 Monaten	3,4 ·	10⁶	4,75 ·		0,3
Nach 6 Monaten	1,5 ·	10⁶	5,4 ·		-
Nach 7 Monaten	10⁶	7,6 ·
	10⁶	2,7 ·
	10"	-

Aus den obigen Ergebnissen ist zu erkennen, daß die Probe T während etwa 2 Monaten eine gute Lebensfähigkeit (61%) bewahrt, jedoch anschließend sehr schnell abstirbt, im Vergleich zu den herkömmlichen flüssigen Impfstoffen, deren Lebensfähigkeit nach 15 Tagen bereitsauf die Hälfte vermindert ist, besitzt die Probe T somit eine größere Stabilität, die man der Verwendung der jungen Kulturen zuschreiben kann.

Beispiel 2

Es werden zwei Gruppen von Proben A und T, die 25 Beispiel 1 erreichten. Die Ergebnisse sind in den

nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise folgenden Tabellen Il und III zusammengestellt. Die

hergestellt werden, mit Hilfe der gleichen Lagerungs- Tabelle III gibt die Mittelwerte an, die man mit den

methode untersucht. sieben Proben der Reihe A bzw. T erhält.

Die erhaltenen Ergebnisse sind identisch mit den nach

Die Proben A und B, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitet sind, besitzen eine Stabilität, die derjenigen der Proben T wesentlich überlegen ist. Im Fall der Probe A beträgt die Lebensfähigkeit nach 4 Monaten 100%, nach 5 Monaten 80% und nach 6 Monaten Lagerung noch 50%. Bei den gleichen Lagerungsdauern beträgt die Lebensfähigkeit der Probe B 80%, 65% bzw. 30%.

Tabelle II	Al	Tl	A2	T2	A3	T3	A4	T4	mit Hilfe der	T5	Impflanzette	T6	zu	A7	T7
	9.4	9,85	7,2	7,7	7,7	11,1	8,2	6,3	A5	10	A6	8,7	15	11,7
	6,9	4,5	7,6	5,9	4,9	5,1	7,9	6,6	8,9	6,6	6,5	8,8	12,1	7,4
	10,4	8,7	9.2	4,3	9,4	8,9	6,15	3,1	6,1	4,6	8.5	9,5	15,4	8,4
	5,7	4,1	6	2,65	6,93	7	4,5	4,9	10.7	6,1	11,2	6,5	12.9	11.7
	5,9	3,5	2,3	0,98	6,8	2,5	5,6	2	8,9	1,2	6,5	-	8,4	4,7
	-	-	-	-	-	-	-	-	2,9	-	-	-	-	-
	9,9 100%	3,4 34%	4,3 59%	0,034 0,4%	4,4 57%	1,25 11%	5,6 70%	1,3 20%	-	1,1 11%	-	1,8 20%	3,3 22%	1,7 14%
	1,5	0,1	2,6	-	2,2	-	0,8	-	1,5 17%	-	2,6 40%	-	0,75	-
Anzahl der züchtbaren oder lebensfähigen Einheiten in 1 mg frischen, verabreichenden BCG-Impfstoffs, der bei +4 C gelagert wurde	0,7	-	1,2	-	0,7	-	-	-	0,3	-	0.5	-	0.12	-
	*) Die Zahlen sind mit einem Faktor von	1 10" zu	multiplizieren.			0		0.02
Vor der Lagerung	Tabelle 111			Die i	η der						ebenen Zahlenwerte
Nach 1 Monat				obiaen"		Fabelle aneee
Nach 2 Monaten
Nach 3 Monaten
Nach 4 Monaten
Nach 5 Monaten
Nach 6 Monaten
Nach 8 Monaten
Nach Uahr

Anzahl der züchtbaren oder lebensfähigen Einheiten
in 1 mg des bei +4 C gelagerten BCG-Impfstoffs

	Konservierungs	Γ	100%	Sauton-	73%
	lösung		81%	Lösung 1/4	65%
	(A)		59%	(T)	26%
Vor der Lagerung	8,9		50%	9,3	16%
1 Monat bei -4 C	7,7	6,4
2 Monate bei +4 C	10,4	6,8
3 Monate bei +4 C	7,4	6,1
4 Monate bei +4 C	5,3	2,5
6 Monate bei +4 (	4.5	1.5

bO

sind mit einem Faktor von 10⁶ zu multiplizieren.

Diese Ergebnisse bestätigen jene des Beispiels 1, d. h. die Lebensfähigkeit des BCG-Impfstoffs beträgt im Fall der Proben A nach einer Lagerungszeit von 6 Monaten 50%, während die Kontrollproben dieser Lagerungszeit nur eine Lebensfähigkeit von 16% besitzen.

Beispiel 3

Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1A beschrieben untersucht man die Lebensfähigkeit der Bakterien der Stämme BCG Nr. 1019 und 1010, die unter diesen Nummern der Trudeau Mycobacterial Culture Collection hinterlegt sind und den als »Stamm C« bezeichneten Stamm des Exp. Intern. Laboratones (des Intern. Ass. Biol. Stand.).

ίο

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wird die Lebensfähigkeit der Stämme von Monat zu Monat bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt. Im Fall dieser drei Stämme beobachtet man eine auf hohem Niveau befindliche Lagerungsfähigkeit, die nach 3 Monaten nicht weniger als etwa 50% beträgt.

Tabelle

IV

Lageriingszeil

• 10*

in Monaten

• 10'

2

• 10*

3

10'

4

10*

5

10'

6

10'

1

0

• 10*

1

• 10*

_

Beis

16,52 ·

10*

15,12 ·

10*

12,96 ·

10'

10,95 ·

1

21,6

• 10'

18,48

■ 10*

-

2,87 ■

10*

2,1 ·

10*

1,3 ·

10'

10*

I
I

1019

6,12

4,2

49,9

48,1 ·

32,3 ■

28,3 ·

8,56 ·

I

1010

60

55

piel 4

Stamm

C

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise untersucht man nacheinander den Einfluß von verschiedenen Faktoren auf die Konservierung des Impfstoffs des Stamms Nr. 1011.

Bei der Untersuchung D verwendet man alte Kulturen mit einem Alter von 14 Tagen anstelle der in Beispiel IA eingesetzten Kulturen mit einem Alter von 7 Tagen. Die Ergebnisse lassen erkennen, daß die Konservierung im Vergleich zu den normalerweise verwendeten frischen Impfstoffen zwar stark verbessert ist, jedoch derjenigen unterlegen ist, die man mit jungen Kulturen erzielt.

Bei der Untersuchung E verwendet man ein Medium, das aus der Sauton-Lösung besteht, die mit Albumin und Glycerin versetzt worden ist, um einen Stamm zu konservieren, der aus einer Kultur mit einem Alter von 7 Tagen gewonnen wurde. Die Lebensfähigkeit ist in diesem Fall ebenfalls geringer als diejenige, die man erfindungsgemäß auf dem Dubos-taedien erreicht.

Dieses Ergebnis ist jedoch nicht vollständig signifikant, da nur eine einzige Untersuchung durchgeführt wurde

und sich nicht bemerkte Änderungen eingestellt haben können.

Bei den Untersuchungen F und G verwendet man Kulturen mit einem Alter von 7 Tagen, die man in Medien lagert, die aus der Dubos-Lösung bestehen, die jo mit 10% Albumin bzw. 5% Glycerin versetzt ist.

Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle

V

Lagerungszeit

5,76

■ 10*

in Monaten

4,9

10'

2

2,37·

10'

3

• 10*

4

10'

5

10'

6

10'

0

24,6

■ 10'

1

13,22 ■

10*

14,36 ·

10*

1,08

• 10'

1,45 ■

10'

0,6

10'

_

10*

18,4

• 10'

17,4 ■

10*

9,8 ·

10*

5,45

• 10'

3,74 ·

10'

2,24 ■

10'

0,9 ■

10*

D

12,7

• 10'

-

11,5 ■

10'

9,4

9,5 ■

10'

7,9 ·

10'

3,5 ·

konser-

E

Be

ispiel

5

-

der nach

5,95 ■

4,59 ■

srfindungsgemäßen

2,41 ·

F

dem ι

Verfahren

G

Man unterwirft die Proben A des Beispiels 2 einer biologischen Untersuchung nach Ablauf einer LageiüNgs^eii von 7 Monaten. Hierzu inokuliert man Meerschweinchen auf intradermaiem Wege, indem man sie auf einer Seite mit 0,1 und 0,01 mg des BCG-Impfstoffs der Proben A und auf der anderen Seite mit den gleichen Mengen des BCG-Impfstoffs der Proben T behandelt

Die beobachtete Reaktion ermöglicht die Bestimmung der Restvirulenz der Impfstoffe, von der letztendlich die immunisierende Wirkung abhängt

5 Tage nach der Behandlung treten Knötchen auf, die während etwa 30 Tagen bestehenbleiben.

Der Durchmesser der Knötchen ist ein Maß für die Virulenz des Impfstoffs. Im Fall der Proben A und der Dosierungen 0,1 und 0,01 mg beträgt der Durchmesser der Knötchen 8 bzw. 4 mm, während sich bei den Proben T ein Knötchendurchmesser von 4 bzw. 2 mm ergibt

Diese Untersuchung zeigt deutlich die Überlegenheit

Beispiel 6

Bei dieser Uiiiersuchung bestimmt man die Vermehrung der Keime in Mäusen, die man mit Proben der Produkte des Beispiels 2, die während 7 Monaten bei 4° C gelagert wurden, behandelt hat

Gleichzeitig führt man eine identische Untersuchung mit einem frisch bereiteten flüssigen Impfstoff durch.

Jede Maus wird mit 0,02 mg des BCG-Impfstoffs (Gewicht des halbfeuchten Materials) behandelt Nach 30 Tagen bestimmt man die Anzahl der in der Milz der Mäuse vorhandenen züchtbaren oder lebensfähigen Einheiten nach der von GHEORGHIU und Mitarbeitern in »Contröle de la qualite du vaccin BCG Iyophilise par inoculation ä la souris« (International Symposium on BCG vaccine Frankfurt/Main-Series Immunobiol. Standard 1971, t 17, Seiten 221-226) beschriebenen Methode.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt

11

12

Tabelle VI

Anzahl der aus der Milz der Maus isolierten lebensfähigen oder kultivierbaren Einheiten

Maus Während 7 Monaten bei Nichtgelagerter

+4 C gelagerte frischer

Impfstoffe Impfstoff

A T

1 11730 0

2 11 700 0

3 9 706 0

4 26 830 0

5 9 460 0

6 - Mittelwert 15 085

28 000

102 000

13 900

2 830

30 060

15 400

32 165

Es ist festzustellen, daß die Milz der Mäuse, die mit den Proben A und T und dem frischen Impfstoff geimpft worden sind, 15 000, 0 bzw. 32 000 lebensfähige Einheiten enthalten. Somit beträgt bei dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konservierten Impfstoff

die Fähigkeit in den Organismus einzudringen, sich dort zu vermehren und am Leben zu bleiben mindestens etwa 50% der entsprechenden Fähigkeit des frischen Impfstoffs.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines flüssigen, unterhalb der Umgebungstemperatur, jedoch oberhalb O⁰C lagerfähigen Lebend-BCG-lmpfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien in einem für sie geeigneten, gegebenenfalls verdünnten Nährmedium suspendiert das zusätzlich 4 bis 10 Vol.-% entweder Glycerin oder Dimethylsulfoxid enthält, und in üblicher Weise konfektioniert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man ein Nährmedium verwendet das 1 bis 10 g Humanalbumin pro 100 ml des Mediums enthält

3. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet daß Mycobakterien verwendet werden, die unter der Hinterlegungsnummer 1010 an der »Trudeau Mycobacterial Culture Cellection« hinterlegt sind.

4. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß Mycobakterien verwendet werden, die unter der Hinterlegungsnummer 1011 an der »Trudeau Mycobacterial Culture Collection« hinterlegt sind.

5. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet daß Mycobakterien verwendet werden, die unter der Hinterlegungsnummer 1019 an der »Trudeau Mycobacterial Culture Collection« hinterlegt sind.