DE2602177A1

DE2602177A1 - Verfahren zur konservierung von impfstoffen, die dabei erhaltenen impfstoffe und die daraus bereiteten arzneimittel

Info

Publication number: DE2602177A1
Application number: DE19762602177
Authority: DE
Inventors: Louis Chambon; Geb Guran Marina Gheorghiu
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1975-01-23
Filing date: 1976-01-21
Publication date: 1976-07-29
Also published as: ZA76330B; BE837868A; NL7600441A; DK23476A; AU1050276A; JPS5198319A; DK143316B; GR59924B; DE2602177B2; OA05220A; FR2298337A1; DE2602177C3; AT344884B; PT64714B; SE7600669L; GB1514091A; ES444580A1; PT64714A; ATA41076A; FR2298337B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung τοη Arzneimitteln, insbesondere Impfstoffen (Vakzinen) oder :unmunostimulierenden Zubereitungen, die lebende Mycobak-cerien und vorzugsweise die unter der Bezeichnung "Bacillus von Calmette und Guerin" unter der abgekürzten Bezeichnung BCG bekannten enthalten. Sie betrifft ferner die nach diessm Verfahren erhaltenen konzentrierten Produkte und die daraus bereiteten Arzneimittel bzw. Impfstoffe.

Lebende Bakterien enthaltende Impfstoffe stellen erhebliche

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_ 2 —

Probleme hinsichtlich ihrer Konservierung bzw. Aufbewahrung. In der .Tat kann die Anzahl der in ihnen enthaltenen lebenden Bakterien nach ihrer Herstellung schnell abnehmen. Die immunisierende Wirkung dieser Impfstoffe, die von der Anwesenheit von lebenden Bakterien abhängt, kann daher in gleicher Weise schnell nachlassen und sogar vollständig verschwinden. Im Fall des BCG-Impfstoffs erleiden die aus den Kulturen gewonnenen Bakterien, nachdem man sie in einem Medium suspendiert hat, das zu einem Viertel aus einem Kulturmedium (Nährmedium) und zu drei Vierteln aus destilliertem Wasser besteht (die übliche Methode der Herstellung von frischem flüssigem Impfstoff), und bei 4°C aufbewahrt nach 15 Tagen eine Verminderung der Lebensfähigkeit um die Hälfte.

Diese Instabilität des frischen flüssigen Impfstoffs ist eine Ursache für den Verlust eines erheblichen Anteils der Produktion, wann r.;an den Impfstoff nicht innerhalb kurzer Zeit verbraucht, während der die Lebensfähigkeit der Bakterien dazu ausreicht, einen wirksamen Impfschutz zu ergeben. Eine Konsequenz dieser Instabilität besteht in der Notwendigkeit einer ununterbrochenen Produktion des Impfstoffs,- damit sichergestellt ist, daß stets eine Impfstoffreserve vorhanden ist.

Aus wirtschaftlichen Gründen, die mit dieser Herstellung zusammenhängen, neigt ntan dazu, die zur Züchtung der Bakterien angewandten Zeiträume bis zu dem Augenblick auszudehnen, bei dem sich eine maximale Produktion ergibt, was insbesondere nach Ablauf von 14 bis 21 Tagan der Fall ist, obwohl es bekannt ist, daß jüngere Kulturen, insbesondere die mit einem Alter von 5 bis 8 Tagen, normalerweise sin stärkeres Impfvermögen besitzen. In diesem Stadium sind die Bakterienmengen, die sich bis dahin entwickelt haben, jedoch relativ gering, so daß die Unterbrechung des 2üchtungsvorgangs zu hohe Herstellungskosten zur Folge hätte.

Zur Überwindung der Schwierigkeiten, die den flüssigen frischen Impfstoffen eigen sind, die lebende Mycobakterien enthalten, sind bereits die Anwendung von Konservierungsmethoden wie die

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Gefriertrocknung vorgeschlagen worden, wobei zu sagen ist, daß diese Methoden nicht ohne Nachteile sind.

Insbesondere ist es möglich geworden, den BCG-Impfstoff durch Gefriertrocknung während eines Jahres bei 4⁰C und sogar während mehrerer Jahre bei -25⁰C aufzubewahren. Die Gefriertrocknung hat jedoch zur Folge, daß ein erheblicher Anteil der Bakterien abstirbt oder in einen Zustand einer tiefen Anab.iose überführt wird. Dieser Verlust der "Lebensfähigkeit" beträgt grob gesprochen mehr als 50 %. Vom Standpunkt des Immunprozesses aus gesehen scheinen die StoffWechselbeziehungen am wichtigsten zu sein, die sich zwischen den lebenden Keimen und der Parasitenzelle abspielen. Diese Beziehungen manifestieren sich in einer erhöhten Stoffwechselaktivität, die sich in einer Steigerung der Menge der Lysosomen und der hydrolysierenden Enzyme in den Makrophagen wiederspiegelt, von denen die spezifische und die nichtspezifische Immunität abhängt.

Zur Einschränkung der sich daraus ergebenden Verminderung der Lebensfähigkeit und des Verlustes der Wirksamkeit sind verschiedene Lösungen vorgeschlagen worden, wie jene, die darin besteht, die Gefriertrocknung in Gegenwart von Dimethylsulfoxid zu bewirken. Diese Lösungen sind nicht vollständig zufriedenstellend, wobei insbesondere die Gefriertrocknungsbehandlungen relativ aufwendig sind.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, die BCG-Keime durch Einfrieren und Lagern bei tiefer Temperatur, beispielsweise bei -70⁰C oder -196°C zu konservieren. Die Keime werden dann durch Auftauen wieder zum Leben erweckt.

Die zum Einfrieren und Auftauen der Mycobakterien angewandten Maßnahmen sind jedoch schwierig durchzuführen. Es ist dabei notwendig eine bestimmte Geschwindigkeit des Einfrierens und Auftauens rigoros einzuhalten.

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Eine der Schwierigkeiten, die beim Einfrieren auftritt, beruht auf der Tatsache, daß man nicht sofort ein vollständiges Einfrieren des Inhalts der Mycobakterien erreicht. Insbesondere stellt man fesh, daß bei Temperaturen zwischen -10⁰C und -40⁰C die Gefahr einer starken Schädigung der Mycobakterien besteht, was wahrscheinlich eine Folge davon ist, daß nur ein Teil des Inhalts dieser Mycobakterien einfriert oder daß sich lokale Elektrolytkonzentrationen ergeben, die in den noch nicht eingefrorenen Bereichen zu groß v/erden könnten. Es ist bereits vorgeschlagen worden, dieses Einfrieren in Gegenwart von schützenden Mitteln? wie Glycerin oder Polyvinylpyrrolidon,durchzuführen. Man hat angenommen, daß diese Schutzmittel, und insbesondere Glycerin, in der Lage sind, das in diesen Mycobakterien enthaltene Wasser zu fixieren, das in dieser Weise am Einfrieren gehindert wird, so daß die Bildung von Eiskristallen in der Zelle vermindert wird.

In allen Fällen ist festzustellen, daß man nach dem Auftauen nur sehr instabile Mycobakterienkulturen erhält, die schnell und sogar noch schneller als die frischen Kulturen absterben, gleichgültig, ob das Einfrieren und das Auftauen in Gegenwart von Glycerin, Polyvinyl pyrrolidon,Dxmethylsulfoxxd oder anderen schützenden Mitteln durchgeführt wurden.

Die Konservierung durch Einfrieren ist daher kaum für die Konservierung von Impfstoffen auf der Grundlage von Mycobakterien geeignet. Sie hätten auch zur Folge, daß sowohl die Hersteller als auch die Benutzer über geeignete "Gefrierketten" verfügen, was in der Praxis undenkbar ist.

Die sich bei der Anwendung der herkömmlichen Konservierungstechniken stellenden Schwierigkeiten sind schließlich so groß, daß der flüssige frische Impfstoff trotz seiner Nachteile in starkem Umfang verwendet wird.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, die obigen Nachteile zu überwinden und insbesondere ein wesentlich einfacheres und billigeres Verfahren zur Konservierung bzw. Aufbewahrung von

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Mycobakterien enthaltenden Impfstoffen (Vakzinen) anzugeben, das die Wirksamkeit dieser Impfstoffe wenn nicht vollständig, so doch in ausreichend großem umfang aufrechterhält, so daß diese Impfstoffe selbst nach langen Lagerzeiten mit Erfolg angewandt werden können. Die Impfstoffe oder Vakzine, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden kann, sind insbesondere jene, die man ausgehend von den Stämmen erhält, die unter der Bezeichnung BCG bekannt sind, insbesondere jenen, die unter den Hinterlegungsnummern 1010, 1011 und 1019 an der Trudeau Mycobacterial Culture Collection USA, oder im Fall des zweiten Stammes unter der Nummer 11 173 P 2 in der Sammlung des Institut Pasteur hinterlegt sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Konservierung von Impfstoffen, die lebende Mycobakterien und insbesondere die unter der abgekürzten Bezeichnung BCG bekannten enthalten, ist nun dadurc; gekennzeichnet, daß man die für die Hersteilung von Impfstoffen geeigneten Mycobakterien in einem Medium suspendiert, das eins ausreichende Menge der für das Überleben dieser Mycobakterier notwendigen Nährstoffe und ein aus Glycerin oder Dimethylsul:oxid gebildetes Konservierungsmittel enthält, und daß man die in uieser Weise gebildete Suspension bei einer Temperatur aufbewahrt, die unterhalb der Umgebungstemperatur (Raumtemperatur) jedoch oberhalb O⁰C und insbesondere zwischen +2⁰C und +6⁰C und noch bevorzugter bei etwa 4⁰C liegt, wobei das Konservierungsmittel in einer Menge vorhanden sein muß, die dazu ausreicht, den Impfstoff bei der genannten Temperatur zu konservieren. Vorteilhafterweise wird die Menge des Konservierungsmittels derart ausgewählt, daß die Lebensfähigkeit der Bakterien nach einer Lagerung von 3 Monaten mindestens noch etwa 50 % beträgt# Die * Dauer der Behandlung reicht dazu aus, daß das in dieser Weise definierte Medium seine Schutzwirkung gegenüber den lebenden Bakterien ausübt.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das die Konservierung bzw. Aufbewahrung von Mycobakterien ermöglicht, die insbesondere für die Herstellung von Impfstoffen bestimmt sind, ist dadurch be-

Jf bezogen auf den Zustand vor der Konservierung.

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merkenswert, daß man zwischen der Züchtung der Mycobakterien und der Anwendung des Impfstoffs keine Stufe des Gefrierens durchläuft.

Vortwilhafterweise beträgt die Menge des Glycerins (das das bevorzugte Konservierungsmittel darstellt) oder des Dimethylsulfoxids etwa 4 Vol-% bis etwa 10 Vol.-%, vorzugsweise etwa 5 Vo.:..-% der gesamten Lösung.

Die Erfindung beruht somit auf der Erkenntnis, daß Glycerin und Dimethylsulfoxid eine Wirkung entfalten, die die Konservierung der Mycobakterien ohne jegliches Einfrieren begünstigt, so daß es nicht erforderlich ist, die Mycobakterien gegen irgendeinen osmotischen Schock oder die Bildung von Eiskristallen in den Seilen zu schützen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man somit einen nicht-geschädigten Impfstoff während längerer Zeit aufbewahren, der den essentiellen Stoffwechsel und die Reizfähigkeit des retikuloendothelialen Systems eines frischen Impfstoffs beibe-

Soxiiit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine erhebliche Einsparung ii; bezug auf die Zeiträume, nach denen die Impfstoffe frisch hergestellt werden müssen, da diese Zeiträume weiter auseinanderliegen können. Es wird in dieser Weise sogar möglich, die Züchtungs2eiten zu begrenzen, so daß man Impfstoffe mit maximaler /iktivität erhält, ohne daß sich Ausbeuteverluste ergeben, die mit den Produktionskosten unverträglich wären.

Die für das überleben der Mycobakterien notwendigen Nährstoffe bestehen vorzugsweise aus den für die Züchtung dieser Bakterien angewandten Kulturmedien. Diese Kulturmedien können in ihrer üblichen Form oder verdünnt eingesetzt werden, wdzu man beispielsweise destilliertes Lasser verwendet. Wenn man eine solche Verdünnung bewirkt, dient sie dazu, das Medium an die isotonischen Bedingungen anzunähern. In allen Fällen darf die Verdünnung nicht so

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weit geführt werden, daß das Risiko einer Lyse der Bakterien besteht. Durch das Verdünnen wird die spätere Verwendung und insbesondere die Verabreichung dieser Zubereitungen in Foria
des Impfstoffs erleichtert. Vorteilhafterweise enthalten diese Medien keine Dispergiermittel, d. h. Mittel, die aian üblicherweise lediglich zu dem Zweck zusetzt, eine homogene Entwicklung der Kulturen zu erleichtern. Hinsichtlich der üblichen Formulierung dieser Kulturmedien kann es von Vorteil sein, sie mit Humanalbumin in Mengen zwischen etwa 1 g und etwa 10g pro
100 ml des Medium und vorzugsweise in einer Menge von 1,75 g pro 100 ml des Mediums zu versetzen.

Schließlich verwendet man in vorteilhafter Weise Bakterien, die aus jungen Kulturen, d. h. Kulturen hervorgegangen sind, die unter den besonderen angewandten Bedingungen ihr Maximum der Entwicklung noch nicht erreicht haben.

Vorteilhafterweise kann im Fall des BCG-Impfstoffs das Nährmedium aus den Kulturmedien bestehen, die unter den Bezeichnungen "Sauton" und ^l!Dubos" bekannt sind, wobei man vorzugsweise das letztere einsetzt. Die Zusammensetzung dieser Medien ist weiter unten angegeben, wobei zu sagen ist, daß diese Medien gewünschtenfalls verdünnt werden können.

Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Konservierungsmedium

besitzt die folgende Zusammensetzung: Monokaliumphosphat 1 g

Dinatriumphosphat 6,3 g

Asparagin 2 g

Kaseinautolysat 2 g

Ammoniumeisencitrat, 5 %ige Lösung, 1 ml Magnesiumsulfat, 1 %ige Lösung, 1 ml

Calciumchlorid, 0,05 %ige Lösung, 1 ml

Zinksulfat, 0,01 %ige Lösung, 1 ml

Kupfersulfat, 0,01 %ige Lösung, 1 ml

Humanalbuminfraktion V Kohn, 17,5 %ige Lösung, 100 ml

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Glukose/ 5Ö %ige Lösung _t 10 ml

Glycerin, 50 %ige Lösung, 100 ml

destilliertes Wasser 790 ml

1000 ml

In dieser Zubereitung kann das Glycerin durch DimethylsuIfoxid ersetzt werden.

Es hat sich gezeigt, daß die Lebensfähigkeit der Bakterien bei der Lagerung aufgrund des erfindungsgemäßen Konservierungsverfahrens wesentlich größer ist als diejenige der frischen Impfstoffe. Demzufolge führen diese stabileren Impfstoffe zu gleichmäßigeren Ergebnissen. Da diese Impfstoffe haltbarer sind, sind die Verluste nur begrenzt, falls überhaupt vorhanden.

Andererseits ist festzuhalten, daß diese Verbesserung in sehr einfacher und leicht durchführbarer Weise erreicht werden kann und die Produktionskosten kaum ändert«

Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneimittel, die die mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens konservierten Mycobakterien enthalten und insbesondere ImpfstoffZubereitungen, die die impfenden Mycobakterien in Suspension in einer physiologisch verträglichen Lösung enthalten, die Glycerin oder Dimethylsulfoxid in einer Menge von etwa 4 % bis etwa 10 % enthält, und die insbesondere mit Hilfe der Impflanzette oder durch Injektion verabreicht werden können.

Vorzugsweise werden die Bedingungen der Konservierung bzw. der Lagerung und insbesondere die Lagerzeit darart ausgewählt, daß die Lebensfähigkeit der in die genannten Arzneimittel und insbesondere die Impfstoffe eingearbeiteten Mycobakterien nicht geringer ist als etwa 50 % bezogen auf den Zustand vor der Konservierung.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des auf den BCG-Impfstoff angewandten Konservierungsverfahrens nach der Erfindung.

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Vor der Konservierung werden die Bakterien unv.er Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen bereitet. Diese Herstellung besteht darin, daß man den Bakterienstamm in einem geeigneten Medium züchtet. Für den BCG-Impfstoff verwendet man als Medien vorteilhafterweise die Medien des Typs "SautGa" oder des Typs "Dubos", deren Zusammensetzung die folgende i,.-'t:

Sauton

Asparagin

Zitronensäure

Dikaliumphosphat

Magnesiumsulfat

Ammoniumeisencitrat Glycerin

destilliertes Wasser

4	g
2	g
0	,5 g
0	,5 g
0	,05 g
60	ml
940	ml
1	Liter

Dubos

Monokaliumphosphat	1 g	1 ml
Dinatriumphosphat	6,3 g	1 ml
Asparagin	2 g	1 ml
Kaseinautolysat	2 g	1 ml
Ammoniumeisencitrat,	5 %ige Lösung,	1 ml
Magnesiumsulfat,	1 %ige Lösung,
Calciumchlorid,	0,05 %ige Lesung,
Zinksuifat	0,01 %ige Lösung,
Kupfersulfat,	0,01 %ige Lösung,

Tween 80 (Polyoxyäthylensorbitanmonooleat),

5 %ige Lösung der Fraktion V von Rinderplasma

Glukose,

destilliertes Wasser ad

10 %ige Lösung,

50 %ige Lösung,

5.ml

10 ml

1 ml

1000 ml

Unter Anwendung der für die Herstellung des frischen flüssigen Impfstoffs üblichen Techniken züchtet man die Bakterien zweimal auf dem oder den ausgewählten Kulturmedien. Nach Ablauf des zwei-

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- 10 ten Durchgangs gewinnt man den Bakterienschleier und wäscht-ihn.

In den■ folgenden. Beispielen, werden junge Kulturen (ä.-h. rait einem Alter von G bis 11 Tagen;- und insbesondere Kulturen mit einem Alter voa 8■Tagen angewandt. :

Beispiel 1

!■Lan. bringt die Bakterien des Stammes, der unter der hummer 1011 an de?: Trudeau Mycobacterial Culture Collection hinterlegt ist, und die in der obigen Weise hergestellt sind, in einer Menge von 50 mg pro ml in die Lösungen A, B und T ein, deren Zusammensetzung

im folgenden angegeben ist.

I-, - Bouillon Dubos ohne Netzmittel (beispielsweise ohne PoIyo^yäthylensorbitanmonooleat (Tween 80) , die man statt mit Rinderalbumin mit injizierbarem Humanalbumin und Glycerin in einer Menge von 5 % versetzt hat.

B - Die gleiche Bouillon Dubos wie die Lösung A, dia jedoch an-ε relle vor; Glycerin Diraethylsulfoxid in einer Konzentration von 5 t -snthäit.

•T - Auf ein Viertel verdünnte Sauton-Lösung für den als Vergleich dienenden Impfstoff (übliche Laboratoriumstechnik).

Die Lösung T entspricht derjenigen, die man üblicherweise zur Herstellung von flüssigem frischen Impfstoff verwendet. Diese Lösung dient als Vergleich für die erfindungsgemäßen Lösungen A und B.

Die in dieser Weise bereiteten Suspensionen werden in einer Menge von jeweils 0,6 bis 1 ml pro Ampulle in Ampullen aufgeteilt. Diese Maßnahme erfolgt unter sterilen Bedingungen.

Die Aufbewahrung erfolgt bei 4⁰C während 7 Monaten, wobei die Lebensfähigkeit der Impfstoffe· in regelmäßigen Intervallen ge-

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prüft wird. Hierzu wendet man die Methode der lebensfähigen Einheiten an.(auf dem Loewenstein-Jensen-Medium nach der Technik, die in dem Guide Technique 67-6 publication O.M.S. beschrieben ist)

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt, die für jede Lösung in Abhängigkeit von der Lagerungszeit die Anzahl der lebensfähigen bzw. züchtbaren Einheiten (MUC) pro mg des halbfeuchten BCG-ImpfStoffs angibt.

Tabelle I

Anzahl der lebensfähigen Einheiten in 1 mg des mit Hilfe der Impflanzette zu verabreichenden BCG-ImpfStoffs, der (nach der Verdünnung mit den Lösungen A, B und T) bei +4°C gelagert wurde.

ABT

vor der Lagerung 7,5*10

nach 15 Tagen 9_f4-10⁶

nach 1 Monat - 1,34-1O⁶

,6

nach 2 Monaten 9,94-10

nach 3 Monaten 3,3-10⁶

nach 4 Monaten 8,08-10

,6

nach 5 Monaten 5,9 -10

to⁶ ,6

nach 6 Monaten 3,4· 10

8,9 ·	10⁶	16,9	• 10⁶
9,2 *	10⁶	0,6	• ίο⁶
7,1 *	IO⁶	13,44	• io⁶
8,04*	IO⁶	10,38	- 10⁶, 61 %
4,75·	10⁶	2,6	• 10⁶
5,4 ·	10⁶	1,68	• 10⁶
7,6 ·	10⁶	1,2	• io⁶
2,7 ·	10⁶	0,3	• 10⁶

nach 7 Monaten 1,5*10

Aus den obigen Ergebnissen ist zu erkennen, daß die Probe T während etwa 2 Monaten eine gute Lebensfähigkeit (61 %) bewahrt, jedoch anschließend sehr schnell abstirbt. Im Vergleich zu den herkömmlichen flüssigen Impfstoffen, deren Lebensfähigkeit nach 15 Tagen bereits auf die Hälfte vermindert ist, besitzt die Probe T somit eine größere Stabilität, die man der Verwendung der jungen Kulturen zuschreiben kann.

Die Proben A und B, die nach dem erfxndungsgemäßen Verfahren bereitet sind, besitzen eine Stabilität, die derjenigen der Proben T wesentlich überlegen ist. Im Fall der Probe A beträgt die Lebens-

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fähigkeit nach 4 Monaten 100 %, nach 5 Monaten 80 % und nach 6 Monaten Lagerung noch 50 %. Bei den gleichen Lagerungsdauern beträgt die Lebensfähigkeit der Probe B 80 %, 65 % bzw. 30 %.

Beispiel 2

Es werden zwei Gruppen von Proben A und T, die nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt werden, mit Hilfe der gleichen Lagerungsmethode untersucht.

Die erhaltenen Ergebnisse sind identisch mit den nach Beispiel 1 erreichten. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen II und III zusammengestellt. Die Tabelle III gibt die Mittelwerte an, die man mit den sieben Proben der Reihe A bzw. T erhält.

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Tabelle II

Anzahl der züchtbaren oder lebensfähigen Einheiten in 1 mg frischen, mit Hilfe der Impflanzette zu verabreichenden BCG-Impfstoffs, der bei +4⁰C gelagert wurde.

A1 T1 A2 T2 A3 T3 A4 T4 A5 T5 A6 T6 A7 T7

Vor der Lagerung

nach 1 Monat
nach 2 Monaten nach 3 Monaten nach 4 Monaten nach 5 Monaten nach 6 Monaten ο

ex) nach 8 Monaten

_α nach 1 Jahr

ο

to- * Die Zahlen sind mit einem Faktor von 10 zu multiplizieren.

9,4	9,85	7,2	7,7	7,7	157 %	11,1	8,2	6,3	8,9	10	6,5	8,7	15	11,7	λ U), I
6,9	4,5	7,6	5,9	4,9	2,2	5,1	7,9	6,6	6,1	6,6	8,5	8,8	12,1	7,4
10,4	8,7-	9,2	4,3	9,4	0,7	8,9	6,15	3,1	10,7	4,6	11,2	9,5	15,4	8,4
5,7	4,1	6	2,65	6,93	7	4,5	4,9	8,9	6,1	6,5	6,5	12,9	11,7
5,9	3,5	2,3	0,98	6,8	2,5	5,6	2	2,9	1,2	-	-	8,4	4,7
9,9	3;4	4,3	0,0344,4	1,25	5,6	1,3	1,5	1,1	2,6	1,8	3,3	1,7
100 \	S 34%	59 %	0,4 \	11 %	70 %	20 %	17 %	11 %	40 %	20 %	22 %	14 %
1/5	0,1	2,6	-	-	0,8	-	0,3	-	0,5	-	0,75	-
0,7		1,2	—	—	—	—	0	-	0,02	-	0,12	-

- 14 Tabelle III

Anzahl der züchtbaren oder lebensfähigen Einheiten in 1 mg des bei +4⁰C gelagerten BCG-

Impfstoffs.

Konservierungslösung Sauton-Lösung 1/4 (A) (T)

Vor der	Lagerung	8,9	100 %	9,3	73 %
1 Monat	bei +4⁰C	7,7	81 %	6,4	65 %
2 Monate	bei +4⁰C	10,4	59 %	6,8	26 %
3 Monate	bei +4⁰C	7,4	50 %	6,1	16 %
4 Monate	bei +4⁰C	5,3	2,5
6 Monate	bei +4⁰C	4,5	1,5

Die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte sind mit einem Faktor von 10 zu multiplizieren.

Diese Ergebnisse bestätigen jene des Beispiels 1, d. h. die Lebensfähigkeit des BCG-Impfstoffs beträgt im Fall der Proben A nach einer Lagerungszeit von 6 Monaten 50 %, während die Kontrollproben dieser Lagerungszeit nur eine Lebensfähigkeit von 16 % besitzen.

Beispiel 3

Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1A beschrieben untersucht man die Lebensfähigkeit der Bakterien der Stämme BCG Nr. 1019 und 1010, die unter diesen Nummern der Trudeau Mycobacterial Culture Collection hinterlegt sind und den als "Stamm C" bezeichneten Stamm des Exp. Intern. Laboratories (des Intern. Ass. Biol. Stand.).

Wie in Beispiel 1 beschrieben wird die Lebensfähigkeit der Stämme von Monat zu Monat bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der

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folgenden Tabelle IV zusammengestellt. Im Fall dieser drei Stämme beobachtet man eine auf hohem Niveau befindliche Lagerungsfähigkeit, die nach 3 Monaten nicht weniger als etwa 50 % beträgt.

Tabelle IV

rungs- _Q zeit in Monaten

1019 21,6Ί0⁶ 18,48-10⁶ - 16,52Ί0⁶ 15,12MO⁶ 12,96'10⁶ 10,95-10⁶

1010 6,12·10⁶ 4,20-10⁶ - 2,87"10⁶ 2,10Ί0⁶ 1,3 Ί0⁶

Stamme 60Ί0⁶ 55 · 10⁶ 49,9'10⁶ 48,V10⁶ 32,3 Ί0⁶ 28,3 Ί0⁶ 8,56'1O⁶

Beispiel 4

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise untersucht man nacheinander den Einfluß von verschiedenen Faktoren auf die Konservierung des Impfstoffs des Stamms Nr. 1011.

Bei der Untersuchung D verwendet man alte Kulturen mit einem Alter von 14 Tagen anstelle der in Beispiel 1A eingesetzten Kulturen mit einem Alter von 7 Tagen. Die Ergebnisse lassen erkennen, daß die Konservierung im Vergleich zu den normalerweise verwendeten frischen Impfstoffen zwar stark verbessert ist jedoch derjenigen unterlegen ist, die man mit jungen Kulturen erzielt.

Bei der Untersuchung E verwendet man ein Medium, das aus der Sauton-Lösung besteht, die mit Albumin und Glycerin versetzt worden ist, um einen Stamm zu konservieren, der aus einer Kultur mit einem Alter von 7 Tagen gewonnen wurde. Die Lebensfähigkeit ist in diesem Fall ebenfalls geringer als diejenige, die man auf dem Dubos-Medien erreicht. Dieses Ergebnis ist jedoch nicht vollständig signifikant, da nur eine einzige Untersuchung durchgeführt wurde und sich nicht bemerkte Änderungen eingestellt haben können.

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- Ib

Bei den Untersuchungen F und G verwendet man Kulturen mit einem Alter von 7 Tagen, die man in Medien lagert, die aus der Dubos-Lösung bestehen, die mit 10 % Albumin bzw. 5 % Glycerin versetzt ist.

Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

Lagerungszeit in Monaten

D 5,76·10⁶ 4,9 -10⁶ 2_Λ37Ί0⁶ 1,08"1O⁶ 1,45Ί0⁶ Ο,βΊΟ⁶

E 24,6 ΊΟ⁶ 13,22·10⁶ 14,36'ΤΟ⁶ 5,45"1O⁶ 3,74Ί0⁶ 2,24·10⁶ 0,9 ΊΟ⁶

F 18,4·10⁶ 17,4·10⁶ 9,8 ΊΟ⁶ 9,4 ΊΟ⁶ 9,5 ΊΟ⁶ 7,9 ΊΟ⁶ 3,5 ΊΟ⁶

G 12,7-10

11,5 -10

5,95·10⁶ 4,59·10⁶ 2,4Τ10⁶

Beispiel 5

Man unterwirft die Proben A des Beispiels 2 einer biologischen Untersuchung nach Ablauf einer Lagerungszeit von 7 Monaten. Hierzu inokuliert man Meerschweinchen auf intradermalem Wege, indem man sie auf einer Seite mit 0,1 und 0,01 mg des BCG-Impfstoffs der Proben A und auf der anderen Seite mit den gleichen Mengen des BCG-Impfstoffs der Proben T behandelt.

Die beobachtete Reaktion ermöglicht die Bestimmung der Restvirulenz der Impfstoffe, von der letztendlich die immunisierende Wirkung abhängt.

5 Tage nach der Behandlung treten Knötchen auf, die während etwa 30 Tagen bestehen bleiben.

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Der Durchmesser der Knötchen ist ein Maß für die Virulenz des Impfstoffs. Im Fall der Proben A und der Dosierungen 0,1 und 0,01 mg beträgt der Durchmesser der Knötchen 8 bzw. 4 mm, während sich bei den Proben T ein Knötchendurchmesser von 4 bzw. 2 mm ergibt.

Diese Untersuchung zeigt deutlich die Überlegenheit der ,nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konservierten Impfstoffe.

Beispiel 6

Bei dieser Untersuchung bestimmt man die Vermehrung der Keime in Mäusen, die man mit Proben der Produkte des Beispiels 2, die während 7 Monaten bei 4⁰C gelagert wurden, behandelt hat.

Gleichzeitig führt man eine identische Untersuchung mit einem frisch bereiteten flüssigen Impfstoff durch.

Jede Maus wird mit 0,02 mg des BCG-Impfstoffs (Gewicht des halbfeuchten Materials) behandelt. Nach 3 0 Tagen bestimmt man die Anzahl der in der Milz der Mäuse vorhandenen züchtbaren oder lebensfähigen Einheiten nach der von GHEORGHIU und Mitarbeitern in "Controle de la qualite du vaccin BCG lyophilise par inoculation ä la souris" (International Symposium on B C G vaccine Frankfurt/ Main - Series Immunobiol. Standard 1971, t. 1_7, Seiten 221-226) beschriebenen Methode.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt.

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- 18 Tabelle VI

Anzahl der aus der Milz der Maus isolierten lebensfähigen oder kultivierbaren Einheiten

Maus während 7 Monaten bei +4⁰C gelagerte Impfstoffe nichtgelagerter fri-A T scher Impfstoff

1	11730	0	28000
2	11700	0	102000
3	9706	0	13900
4	26830	0	2830
5	9460	0	30060
6	-	-	15400
Mittel	15085		32165
wert

Es ist festzustellen, daß die Milz der Mäuse, die mit den Proben A und T und dem frischen Impfstoff geimpft worden sind, 15000, 0 bzw. 32000 lebensfähige Einheiten enthalten. Somit beträgt bei dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konservierten Impfstoff die Fähigkeit in den Organismus einzudringen, sich dort zu vermehren und am Leben zu bleiben mindestens etwa 50 % der entsprechenden Fähigkeit des frischen Impfstoffs.

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Claims

- 19 Patentansprüche

(T) Verfahren zur Konservierung bzw. Lagerung von Impfstoffen (Vakzinen),die lebende Mycobakterien und insbesondere die unter der abgekürzten Bezeichnung BCG bekannten enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien in einem für sie geeigneten,' gegebenenfalls verdünnten Nährmedium, das zusätzlich entweder Glycerin oder Dimethylsulfoxid enthält, suspendiert und diese Suspension auf einer Temperatur hält, die unterhalb der Umgebungstemperatur, jedoch oberhalb 0⁰C liegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lagertemperatur zwischen +2⁰C und +6°C und vorteilhafterweise von etwa 4⁰C anwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Glycerin oder Dimethylsulfoxid in solchen Mengen zusetzt, daß die Lebensfähigkeit der Bakterien nach einer Lagerungszeit von 3 Monaten noch mindestens etwa 50 % beträgt bezogen auf den Zustand vor der Konservierung.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Glycerin oder das Dimethylsulfoxid 4 bis 10% der Suspension ausmacht.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Nährmedium das Kulturmedium der fraglichen Bakterien eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 1 bis 10 g und vorteilhafterweise 1,75 g Humanalbumin pro 100 ml des Mediums enthält.

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7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein Medium des Typs "Dubos" einsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein Medium des Typs "Sauton" einsetzt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobakterien verwendet, die aus jungen Kulturen stammen.
10. Verfahren zur Konservierung oder Lagerung der BCG-Impfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus Kulturen mit einem Alter von 7 bis 11 Tagen stammenden Bakterien in einem Kulturmedium des Typs "Dubos" suspendiert, das man mit Glycerin in einer solchen Menge versetzt, daß das Medium einen Glyceringehalt von 5 % aufweist, und in dem man das Rinderalbumin durch Humanalbumin ersetzt, und daß man die Suspension bei einer Temperatur von 4⁰C hält.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium, in das man die Bakterien einbringt, kein Dispergiermittel enthält.
12. Lebende Mycobakterien, insbesondere des Typs BCG enthaltendes Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 10 erhältlich ist.
13. Arzneimittel nach Anspruch 12, enthaltend lebende Mycobakterien, insbesondere des Typs BCG,

dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien in einem Konservierungsmedium suspendiert sind, das einen Gehalt an Glycerin oder Dimethylsulfoxid von zwischen 4 und 10 % aufweist.
14. Arzneimittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Konservierungsmedium zusätzlich 1 bis 10g und vorteilhafterweise 1,75 g Humanalbumin pro 100 ml des Mediums enthält.

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15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die enthaltenen Mycobakterien nach einer Lagerungszeit von 3 Monaten eine Lebensfähigkeit von mindestens etwa 50 % besitzen.
16. Mit Hilfe der Impflanzette zu verabreichender BCG-Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Bakterien von Kulturen mit einem Alter von 7 bis 11 Tagen besteht, die in einem gegebenenfalls verdünnten Kulturmedium des Typs "Dubos" Suspendiert sind, das etwa 5 % Glycerin und anstelle des Rinderalbumins Humanalbumin enthält.
17. Impfstoff nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die enthaltenen Mycobakterien aus den Stämmen stammen, die unter den Hinterlegungsnummern 1010, 1011 und 1019 an der "Trudeau Mycobacterial Culture Collection" hinterlegt sind.
18. Impfstoff nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Suspension in einem physiologisch verträglichen Medium umfaßt, das für die Verabreichung durch Injektion oder mit Hilfe der Impflanzette geeignet ist.

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