DE2549768A1

DE2549768A1 - Verfahren zum stabilisieren von interferon gegen mechanische beanspruchung

Info

Publication number: DE2549768A1
Application number: DE19752549768
Authority: DE
Inventors: Terence Cartwright
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1974-11-07
Filing date: 1975-11-06
Publication date: 1976-05-20
Also published as: BE835355A; JPS5191320A; FR2290222B1; FR2290222A1; CA1059029A; GB1526205A

Description

Unsere Nr. 20 226 Wo/La

G.D. Searle & Co., Ltd. High Wycombe, Buckinghamshire,Großbritannien

Verfahren zum Stabilisieren von Interferon gegen mechanische Beanspruchung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von Interferon während der Reinigung mit reduziertem Glutathion, Thiodiglycol, Thioäthanolamin, Thioalkansäuren mit 1 bis 7 C-Atomen, Monothioglycerin, Dithiothreitol, l,2-Dithiolan-3-valeriansäure ("thiotic acid"), N-Acetylcystein oder N-Acetylhomocystein. Das sind s chv/e feihalt ige Reduziermittel, die das Interferonsulfhydryl in dem reduzierten Zustand erhalten, ohne dabei wesentliche Disulfidbindungen zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren bewahrt die Aktivität des Interferon, indem die SulfhydryIfunktionen (-SH) des Interferon im reduzierten Zustand gehalten werden, ohne dabei die Dxsulfidbxndungen (-S-S-) des Interferon zu reduzieren, die für dessen Aktivität wesentlich sind. Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Interferon sind weihin bekannt (Ciba Foundation Symposium-Interferon, G.E.W. Wolstanholme and Maeve O'Connor; Little, Brown and Co., Boston, 1967).

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Es ist bekannt j daß Interferon aus in Gewebekulturen gewachsenen Zellen gewonnen werden kann und daß Kulturen von nicht umgewandelten Zellen bevorzugt werden. Jedoch ist das aus solchen Zellen gewonnene Interferon in hohem Maße anfällig gegen eine Inaktivierung infolge mechanischer Beanspruchung und infolge der Behandlung zum Zwecke der Reinigung; die Ausbeuten an gereinigtem Material sind bei diesen Verfahren gering. Eine Inaktivierung des Interferon kann auch durch Lagerung eintreten.

Es ist bekannt, daß Interferon Disulfidbindungen enthält, die in^takt gehalten werden müssen, wenn man nicht die Aktivität des Interferon mindern oder beseitigen will; starke Reduzierungsmittel zerstören die Aktivität des Interferon. Es wurde jedoch festgestellt, daß das .Interferon auch Sulfhydrylgruppen enthält und daß diese für die Aktivität des Materials ebenfalls wesentlich sind. Die Inaktivierung, z.B. durch mechanische Beanspruchung, ergibt sich wahrscheinlich daraus, daß die Sulfhydrylgruppen miteinander Bindungen eingehen oder daß Disulfid-Austauschreaktionen stattfinden, wobei inter- oder intramolekulare Disulfidbrücken gebildet werden, was zu einer biologisch inaktiven Konfiguration des Interferon führt.

Bestimmte wasserlösliche, schwefelhaltige, milde Reduziermittel halten die Sulfhydrylgruppen des Interferon in einem reduzierten Zustand, ohne die Disulfidbindungen, die für die Aktivität des Interferon wesentlich sind, zu beeinflussen. Die bevorzugten Reagentien sind: Thioessigsäure, reduziertes Glutathion (γ-L-Glutamyl-L-cysteinglycin), Monothioglycerin (3-Mercapto-l,2-propandiol), Dithiothreitol (1,4-Dithiothreitol) l,2-Dithiolah-3-valeriansäure (J'thiotic acid¹), N-Acetylcystein, N-Acetylhomocystein, Thioäthanolamin (2-Aminoäthanthiol) und Thiodiglycol (2,2^f-Thiodiäthanol). Diese Verbindungen haben die folgenden Formeln:

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l,2-Dithiolan-3-valeriansäure

CH₂-SH CHOH CH₂-OH	CH₀-SH 1 C-	Monothioglycerin (3-Mercapto-l,2-propand:
CH₂-SH CH₂-NH₂	Thioäthanolamin (2-Aminoäthanthiol)
(CH₂)₂-0H S (CH₂)₂-OH	Thiodiglycol (2,2'-Thiodiäthanol)
H H-C-SH H-C-OH HO-C-H H-C-SH t H	Dithiothreitol (1,M-Dithiothreitol)
HS-CH₂-CH-CO₂H NH-CO-CH	N-Acetylcystein
HS-CH₂-CH₂-CH-CO₂H NH-CO-CH,	N-Acetylhomocystein (2-Acetamido-4-mercapto buttersäure)

HO₀C-CH-CH₀-CH₀-CO-Nh-CH-CO-NH-CH₀-CO₀H

C. f <- C- C. C.

NH₂

• reduziertes Glutathion

(V-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin)

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Die für die Stabilisierung effektive molare Konzentration des Reduziermittels in der das Interferon enthaltenden

—R
Lösung beträgt 0,1 bis 10 .

Bevorzugt wird Fibroblast-Interferon gegen mechanische Beanspruchung stabilisiert, indem man das Interferonpräparat

-U
mit wenigstens 1 χ 10 Mol/l l,2-Dithiolan-3-valeriansäure, mindestens 1 χ 10" ^>5 Mol/l N-Acetylcystein oder mindestens 1 χ 10~² Mol/l Dithiothreitol behandelt.

besonders

Aus Fibroblast-Zellen gewonnenes Interferon wird/vorzugsweise stabilisiert, indem man das rohe Interferon-Präparat mit wenigstens Ix 10~ Mol/l l,2-Dithiolan-3-valeriansäure behandelt, bevor man es einer mechanischen Beanspruchung (wie z.B. Ultrafiltration, Schütteln oder Niederschlagsbildung) unterwirft.

Es ist darauf hinzuweisen, daß Verbindungen ohne die erforderlichen Schwefelanteile nicht wirksam sind. Zum Beispiel sind die l,2-Dithiolan-3~valeriansäure und Thioalkansäuren mit 1 bis 7 C-Atomen, wie z.B. Thioessigsäure, wirksame Interferon-Stabilisierer, während Octansäure nicht wirksam ist» Ebenso verhält es sich mit N-Acetylcystein einerseits und N-Acety!valin andererseits.

Das Reagens kann dem rohen Interferon-Präparat den für die Stabilisierung wirksamen Mengen zugegeben werden; das Interferon wird anschließend mit üblichen Methoden gereinigt und konzentriert, wie z.B. Chromatographie, Ultrafiltration oder Zentrifugieren. Nach Beendigung der Reinigung kann das Stabilisierungsmittel mittels Dialyse gegen eine das Reagens nicht enthaltende Pufferlösung entfernt werden.

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Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Die Fähigkeit einiger Verbindungen, die Inaktivierung von Interferon durch mechanische Beanspruchung zu verhindern, wird durch die folgende Tabelle I wiedergegeben. - Das Interferon wur.de aus menschlichen Fibroblasten erhalten .

Tabelle I

Verbindung Konzentration Schütteldauer (Stdn.) (mH) 2 4 6 24

% der ursprünglichen Interferon-Aktivität

1	100	100	100	95
1	30	20	10	3
100	90	85	85	80
100	30	15	10	4
10	90	90	85	85
14	10	10	5	10

Kontrollsubstanz

(keine Zusätze) 30 20 10

l,2-Dithiolan-3-valeriansäure

Octansäure
N-AcetyIcystein
N-Acetylvalin
Dithiothreitol
2-Mercaptoäthanol

Proben von Interferon in einem Gewebekulturmedium wurden in einem Röhrchen 50 Mal pro Minute bei einer Temperatur von 4 C geschüttelt. Der Prozentsatz der ursprünglichen Interferon-Aktivität, die nach sich jewaJs vergrößernden Zeitintervallen verbleibt, ist in Tabelle I wiedergegeben. Ein Hinweis darauf, daß die Wirksamkeit auf die Sulfhydrylgruppe zurückzuführen ist, ergibt sich daraus, daß Octansäure und N-Acetylvalin, die chemisch nahe verwandt sind mit der l,2-Dithiolan-3~ valeriansäure bzw. dem N-Acetylcystein, jedoch den

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Sulfhydrylrest nicht aufweisen, beide gänzlich unwirksam sind.

Das starke Reduktionsmittel 2-Mercaptoäthanol gibt keinen Schutz gegen die Inaktivierung und bewirkte sogar selbst Inaktivierung von Proben, die nicht geschüttelt wurden. 2-Mercaptoäthanol zerstört die Disulfidbindungen, die für die Reaktivität des Interferon wichtig sind.

Es zeigt sich also, daß nur diejenigen Reagentien das Interferon gegen mechanische Inaktivierung stabilisieren können, die mit den Sulfhydrylgruppen des Interferon reagieren, ohne die Disulfidbindungen zu zerstören. Reagentien, die die Disulfidbindungen des Interferon zerstören, bewirken einen Aktivitätsverlust des Interferon selbst dann, wenn eine physische Beanspruchung nicht stattfindet.

Beispiel 2

Interferon aus 2 Arten von Pibroblast-Zellen, MRC5 und PSA, wurden einer sich steigernden physischen Beanspruchung unterworfen, indem man sie in einem Rotationsviskometer Scherkräften unterwarf; der Rotationsviskometer hatte 2 konzentrische Zylinder, die gegeneinander rotieren.

Das Interferon hatte eine Anfangsaktivität von 1.000 μ/ml.

Ergebnisse Aktivität nach einer Stunde

Kontrollprobe ohne physikalische

Beanspruchung 1.000 μ/ml

FSA/10"*\iolare 1,2-Dithiolan-

3-valeriansäure etwa 850 μ/ml

MRC5/ΙΟ"^molare 1,2-Dithiolan-

3-valeriansäure etwa 700 μ/ml

PSA Kontrollprobe mit physikalischer

Beanspruchung etwa 500 μ/ml

MRC5 Kontrollprobe mit physikalischer Beanspruchung etwa 50 U/ml

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Beispiel 3

Proben von Interferon mit einem 0,1 molaren Anteil N-Acetylcystein wurden während 24 Stunden bei 4°C 50 Mal pro Minute geschüttelt. Nach 24 Stunden hatte die Probe mit N-Acetylcystein eine im wesentlichen unveränderte Aktivität, während die nicht behandelten Kontrollproben nach 24stündigem Schütteln lediglich 1/10 ihrer ursprünglichen Aktivität aufwiesen.

Beispiel 4

Die erfindungsgemäßen Reagentien entfalten ihre Wirkung, indem sie um die kritischen Sulfhydrylgruppen eine reduzierende

gehen
Umgebung aufrecht erhalten. Sie/keine Bindungen mit diesen Gruppen ein und daher ist ihre Wirkung reversibel, wenn sie z.B. aus dem Interferon-Präparat durch Dialyse entfernt werden. Ebenso kann durch Entfernung des Reduziermittels instabil gewordenes Interferon durch Zugabe von frischem Reduziermittel wieder restabilisiert werden.

Diese Eigenschaften der erfindungsgemäßen Reagentien werden durch Tabelle II veranschaulicht. Eine wässrige Zubereitung von Interferon wurde einer Behandlung mit verschiedenen Reagentien unterworfen und dann 24 Stunden bei U⁰C geschüttelt. Der Verlust an Aktivität des Interferon wurde dann gemessen.

Tabelle II Nr. Behandlung % Aktivitätsverlust

(nach 24stündigera Schütteln bei 4°C)

1 keine 90

2 0,1m N-Acetylcystein 0

3 wie 2 plus Dialyse 93

4 wie 3, anschließend Zugabe

von 0,1 M N-Acety!cystein 0

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Beispiel 5

üblicherweise wird die Reinigung de3 Interferon durch Ultrafiltration mittels einer Membrane vorgenommen. Unter diesen konventionellen Bedingungen geht jedoch viel an Aktivität des Interferon verloren, wenn das Interferon von Pibroblasten gewonnen ist. Tabelle III zeigt, daß Interferon gegen eine solche Inaktivierung stabilisert werden kann durch Behandlung mit 0,1 molarem N-Acetylcystein.

Tabelle III

Stabilisermittel Ultrafiltration Konzentra- % Aktivität

Membrane tionsfaktor

5	20
5	11
5	100
5	100

keine UM 10

keine UM 20

0,1 M N-Acetylcystein UM 10
0,1 M N-Acetylcystein UM 20

Beispiel 6

Ein weiteres konventionelles Reinigungsverfahren für Interferon ist die Salzfällung, wobei man z.B. steigende Konzentrationen von Ammoniumsulfat oder Kaliumthiocyanat bei 4°C und bei schwach saurem oder neutralem pH-Wert verwendet. Hierbei geht ein erheblicher Anteil an Aktivität des Interferon verloren, wenn das Interferon aus Pibroblasten gewonnen wurde. Tabelle IV zeigt, daß das Interferon in Ammoniumsulfat-Pällungsmedium durch Zugabe von 1 mM l,2-Dithiolan-3-valeriansäure wirksam stabilisiert wird.

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Tabelle IV

Behandlung % Aktivität

ungeschütztes Interferon 30

Interferon plus 1 mM Stabilisermittel 100

Eine reversible Behandlung mit einem Reduziermittel, das lediglich die für die Inaktivierung des Interferon eine Rolle spielenden Sulfhydrylgruppen und nicht die wesentlichen Disulfidbindungen reduziert, stabilisert Pibroblast-Interferon gegen die bei konventionellen Reinigungsverfahren üblicherweise zu beobachtende Inaktivierung.

Beispiel 7

Menschliches Pibroblast-Interferon wird mit 10 Mol/l 1,2-Dithiolan-3-valeriansäure behandelt und bei 4°C Ik Wochen lang gelagert, Die Stabilität des erfindungsgemäß behandelten Interferon wird verglichen mit der nichtbehandelten Kontrollprobe. Bei dem behandelten Interferon ändert sich der l°g_lo~ Wert des Interferontiters praktisch nicht, während er bei der Kontrollprobe von 10^*-^ auf 10 zurückgeht. Daraus ergibt sich, daß die Anwesenheit der l,2-Dithiolan-3-valeriansäure in einer molaren Konzentration von ΙΟ"-⁵ bis 10 , vorzugsweise wenigstens 10 , die Lagerfähigkeit des Interferon verbessert.

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Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Stabiliserung von Interferon gegen mechanische Beanspruchung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Interferonzubereitung mit reduzierten Glutathion. Thiodiglycol, Thioäthanolamin, Thioalkansäure mit 1 bis 7 C-Atomen, Monothioglycerin, Dithiothreitol, l,2-Dithiolan-3-valeriansäure, N-Acety!cystein oder N-Acetylhomocystein behandelt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

— 4 die Interferonzubereitung mit mindestens 1 χ 10 Mol/l 1,2-Dithiolan-3-valeriansäure behandelt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferonzubereitung mit w

N-Acetylcystein behandelt wird.

_ Λ

die Interferonzubereitung mit wenigstens 1 χ 10 *³ Mol/l

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferonzubereitung mit wenigstens 1 χ 10 Mol/l Dithiothreitol behandelt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von Fibroblast-Zeilen gewonnenes Interferon verwendet wird.

Für: G. D. Searle & Co., Ltd.

High Wycombe, Buckinghamshire, Großbritannien

Dr.Hl Chr.Beil Rechtsanwalt

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