DE2514537A1

DE2514537A1 - Verfahren zur stabilisierung von interferon

Info

Publication number: DE2514537A1
Application number: DE19752514537
Authority: DE
Inventors: Pierre Marie Hendrik Fra Somer; William Edgar Stewart
Original assignee: Stichting Rega VZW
Current assignee: Stichting Rega VZW
Priority date: 1974-04-03
Filing date: 1975-04-03
Publication date: 1975-10-09
Also published as: NL7404589A; AU7951275A; BE826889A; FR2266740A1; FR2266740B3; FI750951A; DK139775A; SE7503769L; US3981991A; NO751118L; JPS5132725A

Description

Verfahren zur stabilisierung von Interferon

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stabilisierung von Interferon.

Interferon ist der Name, der einem zellulären Antivirus-Material gegeben wurde, das aus lebenden Zellen und von extrazellulären Flüssigkeiten gewonnen werden kann. Die Bildung von Interferon in den Zellen kann durch verschiedene Mittel hervorgerufen werden, an erster Stelle durch Viren und weiterhin eine Vielzahl von anderen Stimulantien einschließlich von Bakterien bis zu hoohmolekularen Polymeren. Das Interferon kann von den Zellen oder extrazellulären Flüssigkeiten in verschiedenen Reinheitsgraden gewonnen werden und scheint in der Lage zu sein, menschliche Gewebe und Zellen gegen Angriffe von Viren zu schützen. Im allgemeinen ist die Antivirus-Aktivität von Interferon unspezifisch seiner Wirksamkeit für einen Schutz auch gegen andere Viren zusätzlich zu denen, die zur Anregung der Zellen verwendet wurden, obwohl Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen Interferon bei unterschiedlichen Viren beobachtet wurden. In den meisten Fällen wurde festgestellt, daß Interferon einen besseren Schutz für Gewebe und Zellen der Art ergibt, aus denen es erzeugt wurde, als für andere Gewebe und Zellen.

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Allgemeine Übersicht über die derzeitigen Kenntnisse über Interferon finden sieh in den Büchern: "Interferon" von J. Vilcek, Springer-Verlag« Wien-New-York, 1969, und "Selective Inhibitors of Viral Puntions" von W.A. Carter (ed), CRC-Presse, Cleveland, 197?· auf die hiermit Bezug genommen wird«

Obwohl viel Arbeit auf die physikalische und chemische Charakterisierung von Interferon verwendet wurde, war 03 bisher nicht möglich, mit Stherheit die chemische Struktur von Interferon zu bestimmen. Es scheint ersichtlich zu sein, daß Interferon

proteinartig 1st, doch sind die meisten Einzelheiten hiervon ungewiß. Die Bestimmung dieser chemischen Struktur wurde in großem Ausmaß durch die Tatsache behindert, daß es anscheinend verschiedene molekulare Spezies von Interferon gibt, die unterschiedliche Molekulargewichte und unterschiedliche Eigenschaften aufweisen und deren Bildung von verschiedenen Faktoren wie z.B. der Art der für die Herstellung von Interferon verwendeten Zellen (beispielsweise Zellen von unterschiedlichen Tierarten wie z.B. MSusen, Kaninchen, Küken oder von Menschen oder Zellen, die von unterschiedlichen Geweben einer einzigen Tierart gewonnen wurden) der Art des für die Anregung der Bildung von Interferon verwendeten Mittel (beispielsweise unterschiedliche Viren) dem verwendeten Herstellungsverfahren und dem verwende-, ten Verfahren zur Gewinnung von Interferon aus Zellen oder Flüssigkeiten abhangt.

Weiterhin wurde die Erzeugung, Reinigung und klinische Auswertung von Interferon bisher durch verschiedene Faktoren behindert, von denen der wichtigste die bekannte Instabilität von Interferon ist. Obwohl beriohtet wurde, daß manche Arten von Interferon, wie z.B. aus menschlichen Leukozyten gewonnenes Interferon sowie Kaninchen-Interferon mehr oder weniger gegen eine Inaktivierung stabil sind, werden andere Arten von Interferon sehr schnell durch verschiedenenUmstände inaktiviert, wie z.B. durch längere Aufbewahrung, unerwünschte pH-Werte, erhöhte Temperaturen

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und chemische und mechanische Manipulationen wie z.B. Schütteln* wiederholte Gefrier- und Tauzyklen, Schaumbildung beim Filtern usw. Weitere Arten von Interferon, wie z.B. aus menschlichem Fibroblast gewonnenes Interferon weist eine derartige Instabilität auf, daß Aktivitätspiegel dieses Interferons nicht zuverlässig/Sind. Weiterhin scheinen selbst die relativ stabilsten Arten von Interferon labil zu werden, sobald ein hoher Reinheitsgrad erreicht wurde. Zur Beseitigung dieser Machteile wurde vorgeschlagen, andere Proteine hinzuzufügen, um das Interferon während der Reinigung zu schützen» doch weist diese Hinzufügung von Protein viele Nachteile auf, weil die meisten Arten von Interferon nicht geschützt werden, wodurch dem Zweck der Reinigung entgegengewirkt wird.

Entsprechend wird dauernd ein Verfahren für die Stabilisierung von Interferon in wirkungsvoller Weise und insbesondere ein Verfahren zur Stabilisierung aller Arten von Interferon benötigt, die gegen eine Inaktivierung weniger stabil sind, entweder auf Grund ihrer Art oder als Ergebnis einer fortgesetzten Reinigung.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Stabilisierung von Interferon zu schaffen, das die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist. Insbesondere soll ein stabilisiertes Interferon geschaffen werden, das für eine weitere Reinigung und klinische Auswertung ohne beträchtlichen Aktivitätsverlust geeignet ist.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Interferon durch eine Behandlung mit einer Kombination von drei Reagenzien nämlioh (a) einem Agens zur Unterbrechung nicht-kovalenter Bindungen wie z.B.Harnstoff oder Guanidin-Hydroohlorid, (b) einem Agens zur Reduzierung von Disulfid-Blndungen, wie z.B. Mercaptoäthanol, und (c) einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens, wie z.B. Natrlumlaurylsulfat oder Laurylamin. Wenn das Interferon mit diesen Reagenzien behandelt wird, behält es im wesentlichen seine anfängliche Aktivität bei und ist gegen eine

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Inaktivierung unter dem Einfluß der oben erwähnten Umstände und Handhabungen stabil·

Dank dieser unerwarteten Entdeckung ist es nunmehr möglich« ein stabiles Interferonprodukt herausteilen, das für eine weitere Reinigung und klinische Auswertung geeignet ist. Weiterhin 1st es möglich, nunmehr die Herstellung von Interferon in größer Mafistab zu beginnen.

Der erfindungsgemäß erzielte Stablllsierungsmeohanisnus ist bisher noch nicht vollständig geklärt. Vorausgesetzt Jedoch» dafi das InterferonmolekUl eine Folypeptldkette mit kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen umfaßt und weiterhin eine oder mehrere Dlsulfid-Brttoken aufweist» so wird die ursprüngliche Art oder Gestaltung des Moleküls wahrscheinlich durch das Agens zur Unterbrechung nloht-kovalenter Bindungen und das Agens für die Reduktion der Dlsulfid-BrUcken in eine andere Gestalt umgewandelt» die ein sog· "linear zufälliges Knäuel¹¹ zeigt und freie Sulfhydryl-Gruppen aufweist. Danach kann das oberflächenaktive Agens sich an den geladenen Gruppen an dem Polypeptid-Molekttl binden und die freigesetzten Sulfhydryl-Oruppen Sfe und auf diese Weise diese Gruppen gegen eine Reoxydation schützet was zu einer intramolekular«!oder intermolekular«Rückbildung der DlsulfidbrUcken führen würde. Obwohl diese Reaktionen eine Denaturierung des InterferonmolelcUls hervorrufen» haben sie dennoch eine Sohutzwirkung und es ist daher möglich» von einer Schütz-Denaturierung zu sprechen« Wenn dies erwünscht ist« kann das resultierende Produkt von den unterbrechenden und reduzierenden Agenzien und von dem überschüssigen oberflächenaktiven Agens duroh eine Dialyse befreit werden. Wenn das Produkt später mit einem Protein enthaltendem Medium» wie z.B. einem Medium» das lebende Zellen enthält» In einem Brutschrank inkubiert wird» so entwickelt das Produkt spontan eine aktive Form» die im wesentlichen die ursprüngliche Aktivität des nativan Interferons aufweist. Der gesamte Vorgang kann als Stabilisierung von Interferon durch Schutzdenaturierung beschrieben werden*

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Es ist selbstverständlich, daß die Erfindung nicht durch diese theoretische Erläuterung beschrankt wird. Die Erfindung umfaßt alle Merkmale und Materialien, die in den Rahmen der Ansprüche fallen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Ausgangsmaterial irgendeine Art von nativ»m . oder gereinigtem Interferon in einem Zustand sein, der sich aus der Herstellung und/oder Reinigung ergibt, vorausgesetzt, daß dieses Interferon im wesentlichen nichts von seiner anfänglichen Aktivität eingebüßt hat. Die Quelle für das Interferon ist nicht besondere kritisch, obwohl die Typen von Interferon bevorzugt werden, die von ihrer Natur her relativ instabil sind oder die als Ergebnis der Reinigung instabil sind, wie z.B. Maus-Interferon oder menschliches Pibroblast-Interferon. In den meisten Fällen steht dieses Interferon in der Form einer wässrigen Lösung mit einer Aktivität von zwischen 1(K und 10 Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein (oder von ungefähr 10 bis ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter der Lösung) zur Verfügung und diese Lösung kann als solche für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Erfindungsgemäß wird dieses Interferon nun mit einer Kombination von drei Reagenzien behandelt, nämlich einem Agens zur Unterbrechung der nicht-kovalenten Bindungen, einem Agens zur Reduzierung von Disulfid-Brücken und einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens.

Das Agens zur Unterbrechung nioht-kovalenter Bindungen kann irgendein geeignetes Agens dieser Art sein. Typische Beispiele sind Harnstoff und Guanidin-HydroChlorid, wobei Harnstoff bevorzugt wird. Die Menge dieses bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Agens sollte ausreichend sein, um ein Umfalten der Polypeptid-Kette des Interferon»MolekÜl» hervorzurufen, damit

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sich eine "linear zufälliges Knäuel"ergibt. Allgemein ist die verwendete Menge von Harnstoff derart, daß die resultierende Lösung 0,1 bis 10 M Harnstoff enthält und vorzugsweise ist die Konzentration 5 M Harnstoff. Niedrigere Konzentrationen als 0,1 M sind ohne Wirkung und höhere Konzentrationen als 10 M sind nutzlos weil der Sättigungspunkt dann erreicht ist.

Das Agens zur Reduzierung der Disulfid-Brücken kann irgendein übliches Agens oder Mittel dieser Art sein. Ein typisches Beispiel 1st Athanthiol oder Meroaptoäthanol. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Menge sollte ausreichend sein, um alle Disulfid-Brücken in dem Interferon-Molekül zu reduzieren soweit sie hierin vorhanden sind. In den meisten Fällen ist die Menge von Meroaptoäthanol derart, daß die resultierende Lösung zumindest 10 M Meroaptoäthanol enthält. Niedrigere Mengen als 10 M haben wenig oder keine Wirkung. Eine obere Grenze kann kaum angegeben werden, weil höhere Mengen nicht störend sind.

ο Es wird bevorzugt, Konzentrationen von ungefähr 1,4 χ 10 M bis 1,4 χ 10" M von Mercaptoäthanol in der Lösung zu verwenden.

Das anionische oder kationische oberflächenaktive Agens oder Mittel kann irgendein Übliches Agens dieser Art sein. Ein Alkylsulfat mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen in seiner Alkylgruppe wie z.B. Natriumlauryl-sulfat oder Natriumdecylsulfat ist in den meisten Fällen als anionisches oberflächenaktives Agens ausreiohend doch kann auch ein entsprechendes Alkylsulfonat, wie z.B. Natriumlauryl-sulfonat ebenfalls den gewünschten Effekt haben. Das kationische Agens 1st im allgemeinen ein Alkylamin mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen in seiner Alkylgruppe, wie z.B.

Laurylamin oder Decylamin. Die verwendete Menge dieses Agens

/ um an
sollte ausreichend sein/das Protein zu binden und um die Sulfhydrylgruppen des Interferon-Moleküls, die durch das oben erwähnte Reduktionsagens freigesetzt wurden, abzuschirmen. Um die gewünschte Wirkung sicherzustellen, wird in den meisten

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Fällen ein einfacher bis fünffacher Überschuß des oberflächenaktiven Agens berechnet auf der Gesamtmenge von Protein In der Lösung verwendet. Wenn das Ausgangsmaterial eine Interferon-

Jl

Lösung ist, die ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter enthält, so bedeutet dies, daß die Lösung zumindest 1 χ 10"^ M und höohsten l χ 10" M des oberflächenaktiven Agens enthalten sollte. Eine Menge von 2,5 χ 10 ' M bis 3#5 x 10 M Natrium la urylsulf at wird in diesem Pail bevorzugt*

Die Folge der Hinzufügung der drei Reagenzien ist nicht kritisch, obwohl es bevorzugt wird, das oberflächenaktive Agens gleichzeitig mit oder vor den anderen beiden Agenzien hinzuzufügen, um sicher zu sein, daß dieses oberflächenaktive Agens mit den geladenen Gruppen an den Peptid-Ketten reagieren kann, und die Sulfhydryl-Oruppen abzusehirmt sobald sie durch das Reduktionsagens freigesetzt wurden. Es wird bevorzugt, alle drei Agenzien praktisch zur gleichen Zeit oder eines kurz nach dem anderen hinzuzufügen.

Die Reaktionen der drei Agenzien mit dem Interferon können zügig bei Raumtemperatur oder allgemein bei einer Temperatur von 15°C bis 50°C verlaufen. Daher sind keine speziellen Maßnahmen für die Beschleunigung dieser Reaktionen nötig. Nach der Reaktion wird das überschüssige oberflächenaktive Agens und die gesamte Menge der beiden anderen Reagenzien durch eine Dialyse entfernt, obwohl dies nicht unbedingt notwendig ist.

Diese Behandlung mit den drei Reagenzien ergibt eine vollständige Stabilisierung des Interferone gegen eine Inaktivierung hervorrufende Umstände und Handhabungen wie z.B. eine längere Aufbewahrung, eine übermäßige Erhitzung und ähnliches. Nach einer Behandlung mit Harnstoff, Meroaptoäthanol und NatrlunLauryl sulfat scheinen sowohl menschliches Interferon als auch Mäuse-Interferon vollständig gegen eine Erhitzung bei 56⁰C und 100°c

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stabil zu sein. Eine länger dauernde Kochbehandlung bei Anwesenheit der drei Reagenzien ergibt einen geringen Aktivitätsverlus wenn jedoch der Harnstoff durch Dialyse vor dem Koohen entfernt wird, so bleibt das Interferon selbst bei länger dauerndem Kochen stabil.

Ss sei bemerkt, da6 die gleiche Wirkung nicht mit nur einem ode2 zwei der oben erwähnten drei Reagenzien erreicht werden kann. So haben Harnstoff und Mercaptoäthanoy alleiniger oder gleichzeltiger Verwendung keine Stabilisierungswirkung sondern vielmehr eine die Instabilität verstärkende Wirkung auf das Interferon. Wahrscheinlich wird das Interferon auch In diesem Fall in eine "linear zufälliges Knäuel "(linear random coil) umgewandelt, die freie Sulfiydrylgruppen aufweist, doch wird das Molekül auf diese Weise nicht gegen eine Oxydation geschützt, so daß es während einer Kochbehandlung nahezu vollständig inaktiviert wird.

Wenn das oberflächenaktive Agens allein dem Interferon hinzuge-Jtlgt wird, so verringert sich die Aktivität des Interferon um 60 bis 90 % während einer Kochbehandlung des Produktes. Die verbleibende Aktivität wird auf dem gleichen Wert gehalten, solange das oberflächenaktive Agens vorhanden ist, eine vollständige Stabilisation des Interferons erfordert Jedoch immer eine Kombination der oben erwähnten drei Reagenzien.

Das hier beschriebene Verfahren der Interferon-Stabilisierung bietet eine Möglichkeit zur Stabilisierung von Interferon in verschiedenen Stadien der Gewinnung und Reinigung und bietet weiterhin eine Möglichkeit für die längere Aufbewahrung von Interferon. Ein relativ reines stabilisiertes Interferon mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 10 Einheiten pro Milligramm von Protein kann somit klinisch In stabilisierter Form verabreidit werden. Im Hinblick auf die Tatsache, daß Proteine allgemein nur 1,44 g Natrlumiaurylsulfat pro Gramm

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Protein binden» enthält eine Dosierung,die Millionen von Einheiten von Interferon enthält, nur einige wenige Milligramm von Natriumlaurylsulfat, so daß keine Gefahr von Komplikationen bei der klinischen Verabreichung zu erwarten 1st.

Die folgenden Beispiele sollen einige Einzelheiten der Erfindung erläutern und sind nicht als Beschränkung gedaoht.

Beispiel 1;

Das Ausgangsmaterial war eine Lösung von Maue-Interferon, das von Zellen des Lggg-Typs abgeleitet wurde, die durch den Newcastle-Disease-Virus stimuliert wurden. Diese Lösung wurde bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert, worauf fremde Proteine durch die HinzufUgung von Ammoniumsulfat ausgefällt wurden, bis einemSättigungsgrad von 20 % bei 20⁰C erreicht wurde. Die geklärte Lösung wurde durch Dialyse gegen ein 0,01 M TRIS-HCl-Puffer auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Die resultierende gereinigte Lösung hatte eine Aktivität von 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter (bestimmt durch einen biologischen Test).

Einem Teil dieser gereinigten Interferon-Lösung wurde eine wässrige Lösung von Natriumlaurylsulfat hinzugefügt und unmittelbar darauf wurde feater Harnstoff und flüssiges Meroaptoäthanol hinzugefügt. Die hinzugefügten Mengen waren derart, daß d ie resultierende Lösung 5 M Harnstoff, 1,4 χ 10"² M Meroaptoäthanol und 3,5 χ 10"' M Natriumlaurylsulfat enthielt. Die resultierende Lösung wurde bei 56⁰C während 60 Minuten erhitzt, . es konnte Jedoch keine Änderung in Auesehen beobachtet werden. Eine biologische Nachprüfung ergab, daß die Interferon-Aktivität auf dem gleichen Wert gehalten wurde. Oleiohe Ergebnisse wurden nach einem Kochen bei 100⁰C für 2 I/2 Minuten und nach 30 aefriei»( in einer Misohung von trockenem Eis und Aoeton) und Tauzyklen (bei JJ⁰C) erzielt. Damit war die behan-

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delte Interferon-Lösung anscheinend vollständig gegen eine Inahtlvltät hervorrufende Umstände und Manipulationen stabilisiert FVr eine Kontrolle wurde ein anderer Teil der gereinigten Ausgangs lösung den gleichen Versuchen ohne die HlnzufUgung der oben erwähnten Reagenzien ausgesetzt. Die Aktivität der Lösung verringerte sich auf ungefähr 10 % Ihres anfänglichen Wertes nach einer Erhitzung auf 56⁰C Über 60 Minuten und verringerte sich ebenfalls auf ungefähr 10 % Ihres Anfangswertes nach 30 PrIe und Tauzyklen. Beim Kochversuch ergab sioh_f daß die Interferon-Aktivität eich bereits auf einen Wert von unter 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter nach einem Kochen von 1 Minute bei 100⁰C verringert hatte. Eine Ausfällung trat naoh einer Koohzeit von 2 Minuten auf. Diese unbehandelte Interferon-Lösung war daher gegenüber eine Inaktlvität hervorrufenden Umständen und Manipulationen sehr labil»

Beispiel 2t

Einen Teil der gleiohen gereinigten Mäuse-Interferon-Lösung wie im Beispiel 1 wurde eine Lösung von Natriumlaurylsulfat hinzugegeben, worauf fester Harnstoff und flüssiges Mercaptoäthanol folgte. Diese Agenzien wurden In solchen Mengen hinzugefügt» daß die resultierende Lösung 5 M Harnstoff, 1,4 χ ΙΟ"¹ Μ

«•2

Meroaptottthanol und 3,5 χ 10 M Natrlumlaurylsulfat enthielt. Die resultierende Lösung wurde den gleiohen Untersuchungen wie im Beispiel 1 ausgesetzt und die Ergebnisse dieser Untersuchungen waren ähnlich. Entsprechend war die behandelte Interferon-Lösung vollständig gegen Inaktivierung hervorrufende Umstände und Manipulationen stabilisiert.

Zur Kontrolle wurde ein anderer Teil der gereinigten Ausgangslösung den gleiohen Untersuchungen ohne die Hinzufügung der oben erwähnten drei Reagenzien ausgesetzt. In gleicher Weise wie die Kontrolluntersuohungen in dem Beispiel 1 verlor diese Lösung den größten Teil ihrer Aktivität bei einer Erhitzung auf 56⁰C und bei einem Koohen bei 100⁰C für eine Minute. Die unbe-

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handelte Interferon-Lösung war daher sehr labil gegenüber Inaktivierunghervorrufenden Umständen und Handhabungen.

Beispiel 3t

Das Ausgangsmaterial war eine Lösung von menschlichem Interferon, das von menschlichen diploiden Fibroblast-Zellen gewonnen wurde, die mit synthetischer zwelsträngiger Polyribonukleinsäure, Polyriboinoslnsäure und Polyribocytidyl säure stimuliert wurden. Der pH-Wert dieses Materials wurde auf einen Wert von 7,2 durch Dialyse gegen einen 0,01 M TRIS-HCl-Puffer eingestellt. Die resultierende Lösung hatte eine Aktivität von ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter (bestimmt durch eine biologischen Test).

Einem Teil dieser Interferon-Lösung wurden die folgenden Substanzen hinzugefügt: Zuerst eine wässrige Lösung von Natriumlaurylsulfat, dann fester Harnstoff und flüssiges Mercaptoäthanol. Die hinzugefügten Mengen waren derart, daß die resultierende Lösung 5 M Harstoff, 1,4 χ 10~² M Mercaptoäthanol und 5,5 χ 10"^ M Natriumlaurylsulfat enthielt. Die resultierende Lösung wurde den gleichen Versuchen wie in Beispiel 1 ausgesetzt und es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Damit war die behandelte Interferon-Lösung vollständig gegen eine Inaktivität hervorrufende Umstände und Manipulationen stabilisiert. Zur Kontrolle wurde ein weiterer Teil der gereinigten Interferon-Lösung in gleichen Versuchen ohne die Hinzufügung der Reagenzien ausgesetzt* Die Ergebnisse waren ähnlich den Kontrolluntersuchungen im Beispiel 1, d.h. es blieb lediglich eine Aktivität von 10 % nach einer Erwärmung auf 56⁰C und nach JO Gefrier-Tau-Zyklen und weiterhin verblieben weniger als 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter nach einem Kochen von 1 Minute bei 100⁰C. Diese unbehandelte Lösung war daher sehr labil gegenüber eine Inaktivität hervorrufenden Umständen und Manipulationen.

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Beispiel 4t

Einem Teil der gleichen gereinigten menschlichen Interferon-Lösung, wie sie im Beispiel ? verwendet wurde, wurde eine Lösung von Natriumlaurylsulfat augefügt, worauf fester Harnstoff und flüssiges Mercaptoäthanol in derartigen Mengen nachgegeben wurde daß die resultierende Lösung 5 M Harnstoff, 1,4 χ ΙΟ"¹ M Mercapt äthanol und 3,5 χ 10"² M Natriumlaurylsulfat enthielt. Die resul tierende Lösung wurde den gleichen Untersuchungen wie im Beispie unterworfen und die Ergebnisse hiervon waren ähnlich. Damit war die behandelte Interferon-Lösung wiederum vollständig gegen eine Inaktivität hervorrufende Umstände und Manipulationen stabilisiert.

Zur Kontrolle wurde ein weiterer Teil der gereinigten Ausgangslösung den gleichen Untersuchungen ohne die Hinzufügung der oben erwähnten drei Reagenzien unterworfen. In ähnlicher Welse wie bei den Kontrolluntersuchungen im Beispiel 3 verlor diese Lösung den größten Teil ihrer Aktivität bei einem Erwärmen auf 56⁰C und bei einem Kochen für 1 Minute bei 100⁰C. Die unbehandelte Interferon-Lösung war daher sehr labil gegenüber eine Inaktivität hervorrufende Umstände und Manipulationen.

Beispiel 5:

Einem Teil der gleiohen gereinigten Mäuse-Interferon-Lösung, wie sie in den Beispielen 1 und 2 verwendet wurde, wurde eine Lösung von Laurylamln zugefügt, worauf Harnstoff und flüssiges Mercaptoäthanol folgte. Diese Agenden wurden in solchen Mengen hinzugefügt, daß die resultierende Lösung 5 M Harnstoff, 1,4 χ 10* M Meroaptoäthanol und 2 χ 10"² M Laurylamln enthielt.

Die resultierende Lösung wurde den gleichen Untersuchungen wie im Beispiel 1 unterworfen und die Ergebnisse waren ähnlich. Damit war die behandelte Interferon-Lösung vollständig gegen

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eine Inaktivität hervorrufende Umstände und Manipulationen stabilisiert.

Zur Kontrolle wurde ein weiterer Teil der gereinigten Interferon-Lösung den gleichen Untersuchungen ohne die Hinzuftlgung der oben erwähnten drei Reagenzien unterworfen. Genauso wie bei den Kontrolluntersuchungen im Beispiel 1 verlor diese Lösung den größten Teil ihrer Aktivität bei einem Erwärmen auf 56⁰C und bei einem Kochen Über 1 Minute bei 100°C. Die unbehandelte Interferon-Lösung war daher geg&lber eine Inaktivität hervorrufende Umstände und Manipulationen sehr labil.

Patentansprüche t

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Claims

.14- 25U537 Patentansprüche :

1. Verfahren zur Stabilisierung von Interferon, gekennzeichnet durch die Behandlung einer wässrigen Interferon-Lösung mit einer Kombination von (a) einem Agens zur Aufhebung der nioht-kovalenten Bindungen, (b) einem Agens zur Reduzierung der Disulfid-Brüoken, und (c) einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens·

2. Verfahren nach Anspouch 1, dadurch gekennze lehnet« daß das Ausgangsmaterial eine Lösung eines ursprünglichen oder gereinigten Interferons ist, das im wesentlichen nichts von seiner anfänglichen Aktivität verloren hat·

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, daduroh gekennzeichnet, daß die Interferon-Lösung ungefähr ICK bis ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein oder ungefähr 10 bis ungefähr 10° Interferon-Einheiten pro Milliliter enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3* dadurch g e kennzeichnet, daß das Agens zur Aufhebung der nicht-kovalenten Bindungen Harnstoff ist.

5· Verfahren nach Anspruch 4, daduroh gekennzeichnet, daß Harnstoff in derartigen Mengen verwendet wird, daß die resultierende Lösung von 0,1 bis 10 M Harnstoff und voraugeweise 5 M Harnstoff enthält.

6. Verfahren xa oh einem der AnsprUohe 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens zur Reduzierung der Dlsulfld-Brüoken Mercaptoäthanol 1st.

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7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Mercaptoäthanol in derartigen Mengen verwendet wird, daß die resultierende Lösung zumindest 10 M

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oder vorzugsweise 1,4 χ 10 M bis 1,4 χ 10 M Mercaptoäthanol enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das anionIsehe oder cationlsche oberflächenaktive Agens Natriumlaurylsulfat bzw. Laurylamin

iSt. ' :

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Natriumlaurylsulfat oder Laurylamin In einem einfachen bis fünffachen Überschuß verwendet wird, bezogen auf die Gesamtmenge der Proteine in der Lösung.

10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß wenn der Interferon-Gehalt In der Lösung ungefähr ΙΟ²* Interferon-Einheiten pro Milliliter beträgt, die hinzugefügte Menge des oberflächenaktiven Agens derart ist, daß die Lösung von 1 χ
aktiven Agens enthält.

daß die Lösung von 1 χ 10"^ bis 1 χ 10 M des oberflächen11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10» dadurch gekennzeichnet, daß naoh einer Behandlung mit den oben erwähnten drei Reagenzien der Überschuß an oberflächenaktivem Agens und die gesamten Anteile der beiden anderen zwei Agenzien durch Dialyse entfernt werden.

(ti) Stabilisiertes Interferon-Produkt, das eine wässrige Interferon-Lösung umfaßt, die mit einer Kombination von (a) einem Agens zur Aufhebung der nicht-kovalenten Bindungen, (b) einem Agens zur Reduzierung der Disulfid-Brüoken und (o) einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens behandelt 1st.

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