NO751118L

NO751118L -

Info

Publication number: NO751118L
Application number: NO751118A
Authority: NO
Inventors: W E Stewart; P M H F De Somer
Original assignee: Stichting Rega V Z W
Priority date: 1974-04-03
Filing date: 1975-04-02
Publication date: 1975-10-06
Also published as: DE2514537A1; JPS5132725A; BE826889A; NL7404589A; FI750951A; AU7951275A; DK139775A; FR2266740A1; SE7503769L; US3981991A; FR2266740B3

Description

Stabilisering av interferon.

Foreliggende oppfinnelse vedrdrer stabilisering av interferon.

Interferon er det navn som er gitt til et celleformet antivirus materiale som kan gjenvinnes fra levende celler og fra ekstracelleformede væsker. Dets produksjon i cellene kan stimuleres ved hjelp av forskjellige midler, inkludert for det forste virus og ytterligere en mangfoldighet av andre midler i området fra bakterier til hoymolekulare polymerer. Interferon kan gjenvinnes fra cellene eller ekstracelleformede væsker i forskjellig grad av renhet og synes å være istand til å beskytte vev og celler hos dyr mot virusangrep. Generelt er interferons antivirus-aktivitet ikke-spesifikk i dens evne til å gi beskyttelse mot andre virus i tillegg til de som har blitt brukt til å stimulere cellene, selv om forskjeller i folsomhet overfor interferon har blitt lagt merke til mellom forskjellige virus. I de fleste tilfeller har det vist seg at interferon gir bedre beskyttelse til vev og celler av samme slag som det det har blitt produsert fra, enn til andre vev og celler.

Generell oversikt over nåværende kjennskap til interferon kan finnes i folgende boker: "interferon" av J. Vilcek, (Springer-Verlag, Vienna-New York, 1969) og "Selective In-hibitors ofViral Functions" av W.A. Carter (ed, CRC-Press, Cleveland, 1973), som er tatt med heri som referanse.

Selv om mye arbeide har blitt gjort vedrorende fysisk og kjemisk karakterisering av interferon, har det enda ikke vært

mulig å bestemme dets kjemiske struktur med sikkerhet. Det synes opplagt at interferon er av protein-type, men de fleste]

av detaljene derom er usikre. Bestemmelsen av denne kjemiske struktur har i stor utstrekning blitt hemmet av det faktum at det synes å være flere molekulararter av interferon, og slike arter har forskjellig molekularvekt og forskjellige karakteristikker og deres dannelse er avhengig av forskjellige faktorer, slik som typen av celler brukt til interferon-fremstilling (f.eks. celler fra forskjellige dyrearter slik som mus, kanin, kylling eller menneske, eller celler oppnådd fra forskjellige vev fra en enkelt dyreart), beskaffenheten av midlet som brukes for å stimulere produksjonen (f.eks. forskjellige virus), den virkelige produksjonsmetode og den virkelige metode for å gjenvinne interferon fra celler eller væsker.

Dessuten har produksjon, rensing og klinisk evaluering av interferon blitt hemmet opp til nå av forskjellige faktorer, av hvilke den viktigste er interferons ry for å være ustabilt. Selv om det har vist seg at noen typer av interferon, slik som leukocytt interferon fra mennesker og kanin interferon, er mer eller mindre stabile overfor inaktivering, blir andre typer av interferon lett inaktivert av forskjellige omstendigheter, slik som langvarig lagring, uonskede pH verdier, hoye temperaturer og kjemiske og mekaniske manipuleringer, slik som risting, gjentatte fryse- og tineperioder, skumming ved filtrering og lignende. Enda flere typer av interferon, slik som "fibrolast" interferon fra mennesker, er så ustabile at deres aktivitetsnivåer ikke er pålitelige. Ytterligere synes selv de forholdsvis mest stabile typer av interferon å bli .. labile så snart en hoy grad av renhet har blitt nådd. For å overkomme disse vanskeligheter har det blitt foreslått å tilfore fremmede proteiner for å beskytte interferonet under dets rensing, men denne proteintilforsel har mange ulemper fordi de fleste typer av interferon vil motstå beskyttelse og hensikten med rensingen motarbeides derved. Det er derfor stadig behov for en metode for å stabilisere interferon på

en effektiv måte og spesielt behov for en metode for å stabilisere alle typer av interferon som er mindre stabile overfor inaktivering, enten av natur eller som et resultat

av fortsatt rensing.

Formålet med oppfinnelsen er.å tilfredsstille dette behov

og å tilveiebringe en fremgangsmåte for å stabilisere interferon, som ikke har de forannevnte ulemper. Dessuten er det oppfinnelsens formål å tilveiebringe et stabilisert interferon som er egnet for ytterligere rensing og klinisk evaluering uten vesentlig tap av dets aktivitet.

I henhold til oppfinnelsen har det nå blitt funnet at interferon kan stabiliseres ved behandling med en kombinasjon av tre reagenser: (a) et middel til å spalte ikke-covalente

bindinger, slik som urea eller guanidin-hydroklorid, (b) et middel til å redusere disulfid bindinger, slik som merkapto-etanol, og (c) et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel slik som natrium-dodecyl-sulfat eller dodecyl-amin. Når det behandles med disse reagenser, vil interferon i det vesentlige beholde sin opprinnelige aktivitet og vil være stabilt overfor inaktivering under påvirkning av de forannevnte forhold og manipulasjoner.

Takket være denne uventede oppdagelse er det nå mulig å fremstille et stabilt interferonprodukt som er egnet for ytterligere rensing og klinisk evaluering. Dessuten er det nå mulig å starte produksjon av interferon i storre målestokk.

Mekanismen av stabiliseringen tilveiebragt av oppfinnelsen

er enda ikke helt klar. Antas det imidlertid at interferonmolekylet omfatter en polypeptid-kjede som har co<y>alente og ikke-covalente bindinger og ytterligere har. en eller flere dissulfidbroer , så blir den naturlige form eller konfigurasjon- av molekylet antagelig omdannet av midlet til å spalte ikke-convalente bindinger og midlet til reduksjon av disulfidbroer til en annen konfigurasjon som viser en .såkalt "lineær tilfeldig spiral" (linear random coil) og har frie sulfhydryl grupper. Deretter kan det overflateaktive middel binde til

de ladede grupper på det polypeptide molekyl og skjerme de frigjorte sulfhydrylgrupper og derved beskytte disse grupper

mot re-oksydering fulgt av intramolekular eller inter-molekular omdannelse av disulfidbroer. Selv om disse reaksjoner forårsaker en denaturering av interferonmolekylet, har de ikke desto mindre en beskyttende virkning, og det er derfor mulig å snakke om en beskyttende.denaturering.

Om onskelig kan det resulterende produkt fris fra spalt-nings- og reduksjonsmidlene og fris fra overskuddet av overflateaktivt middel ved hjelp av dialyse. Når produktet er inkubert lateron med et protein-innholdende medium, slik som et medium som omfatter levende celler, vil produktet spontant utvikle en aktive konfigurasjon som i det vesentlige har den opprinnelige aktivitet av naturlig interferon. Hele prosessen kan beskrives som en stabilisering av interferon ved hjelp av beskyttende denaturering.

Det er selvfolgelig innlysende at oppfinnelsen ikke er be-grenset av denne teoretiske forklaring.Istedet omfatter oppfinnelsen alle trekk og materialer som faller innenfor området av de vedlagte krav.

For utforelse av fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen kan startmaterialet være en hvilken som helst type naturlig eller renset interferon i en tilstand som er et resultat av produksjon og/eller rensing, forutsatt at det i det vesentlige ikke har mistet noe av sin opprinnelige aktivitet. Opprinnelsen av interferonet er ikke spesielt avgjorende, selv om de typer interferon foretrekkes, som er forholdsvis ustabile av natur eller ustabile som et resultat av rensing, slik som mus-interferon og "fibroblust" interferon fra mennesker. I de fleste tilfeller er dette interferon tilgjengelig i form av en vandig opplosning som har en aktivitet mellom 3 8 1 10 og 10 interferondeler pr. mg protein (eller ca. 10 . ca. 10 interferondeler pr. ml opplosning), og denne opplosning kan brukes som sådan ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen.

Ifolge oppfinnelsen blir dette interferon nå behandlet med

en kombinasjon av tre reagenser, nemlig et middel til å

spalte ikke-covalente bindinger, et middel til å redusere

disulfidbroer og et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel.

Midlet til å spalte ikke-covalente bindinger kan være et hvilket som helst passende middel av denne type. Typiske eksempler er urea og guanidin-hydroklorid, hvorav urea foretrekkes.

Mengden av slikt middel som brukes" ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen skal være tilstrekkelig til å forårsake utfolding av polypeptidkjeden av interferonmolekylet for å oppnå en "lineær tilfeldig spiral" (linear random coil). Generelt er mengden av urea som brukes slik at den resulterende opplosning omfatter fra 0,1 - 10 M urea og konsentrasjonen er fortrinnsvis 5 M urea. Lavere konsentrasjoner enn 0,1 M vil være uten virkning og hoyere konsentrasjoner enn 10 m er

ubrukelige fordi metningspunktet da har blitt nådd.

Midlet til å spalte disulfidbroer kan være et hvilket som helst konvensjonelt middel av denne type. Et typisk eksempel er etanetiol eller merkaptoetanol. Mengden av dette som brukes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen skal.være tilstrekkelig til å redusere alle disulfidbroer i interferonmolekylet så langt som de er tilstede i det. I de fleste tilfeller er mengden av merkaptoetanol slik at den resulterende opplosning omfatter minst 10 _ 2M merkapto-etanol. Lavere mengder enn

_2

10 M vil ha liten eller ingen virkning. En ovre grense kan

vanskelig gis fordi hoyere mengder ikke er uheldige. Det foretrekkes å bruke konsentrasjoner på ca. 1.4 x 10 _ 2M til 1,4 x IO- M merkaptoetanol i oppløsningen.

Det anioniske eller kationiske overflateaktive middel kan være et hvilket som helst konvensjonelt middel av denne type. Et alkylsulfat som har 8-22 karbonatomer i sin alkylgruppe, slik som natrium-dodecylsulfat eller natrium-decylsufat, vil

i de fleste tilfeller være tilstrekkelig som et anionisk overflateaktivt middel, men et tilsvarende alkylsulfonat,

slik som natrium-dodecylsulfonat kan også ha den onskede

virkning. Det kationiske middel vil i alminnelighet være et alkylamin som har 8-22 karbonatomer i sin alkylgruppe, slik som dodecylamin eller decylamin. Mengden av dette middel skal være tilstrekkelig til å binde proteinet og til å skjerme sulfhydrylgruppene av interferonmolekylet som er frigjort av det forannevnte reduksjonsmiddel. For å være sikker på den onskede virkning vil et 1-fold til 5-fold overskudd av det overflateaktive middel beregnet på den totale mengde av protein i opplosningen, i de fleste tilfelle bli brukt. Hvis startmaterialet er en interferonopplosning som omfatter ca.

10 4 interferondeler pr. mm, vil dette bety at opplosningen

-3 -1

skal omfatte minst 1. x 10 og maksimum 1 x 10 M overflateaktivt middel. En mengde på 3,5 x 10 -3 M til 3,5 x 10 -2M natrium-dodecylsulfat foretrekkes i det tilfelle.

Tilforingsrekkefolgen av de tre reagenser er ikke særlig viktig, selv om det foretrekkes å tilfore det overflateaktive middel samtidig med eller for de andre to midler for å være sikker på at dette overflateaktive middel er istand til å reagere med ladede grupper på peptid-grunnstrukturen (back-bone) for å skjerme sulfhydrylgruppene. så snart de har blitt frigjort av reduksjonsmidlet. Det foretrekkes å tilfore alle tre midler på omtrent samme tid eller like etter hverandre.

Nevnte tre midlers reaksjon med interferonet kan forlope glatt ved romtemperatur eller generelt ved en temperatur fra 15° 30°C. Derfor trenges ingen spesielle foranstaltninger for å påskynne disse reaksjoner. Etter reaksjonen kan overskuddet av overflateaktivt middel og hele mengden av de andre to reagenser bli fjernet ved dialyse, selv om dette ikke er helt nodvendig.

Behandlingen med de tre nevnte reagenser vil resultere i en fullstendig stabilisering av interferon overfor inaktiverings-fremkallende omstendigheter og manipuleringer, slik som langvarig lagring, usedvanlig oppvarming eller lignende. Etter behandling med urea, merkaptoetanol og natrium-dodecylsulf at ,|

synes både' interferon fra mennesker og mus-interferon å

være fullstendig stabil overfor oppvarming ved 56°C og 100°C. En langvarig kokebehandling i nærvær av de tre reagenser vil resultere i et meget lite tap av aktivitet, men hvis urea fjernes ved dialyse for koking, forblir interferonet stabilt selv ved langvarig koking.

Det må legges merke til at den samme virkning ikke kan opp-nås med bare en eller to av de forannevnte tre reagenser. Således vil urea og merkaptoetanol, når de brukes alene eller sammen, ikke ha noen stabiliserende virkning, men heller en ustabilitets-fremkallende virkning på interferon. Antagelig blir interferon fremdeles omdannet til en "lineær tilfeldig spiral" (linear random coil), som har frie sulfhydrylgrupper, men molekylet er ikke beskyttet mot oksydering på denne måten, og derfor blirdet nesten fullstendig inaktivert under en kokebehandling.

I det tilfelle at overflateaktivt middel blir tilfort alene til interferon, vil aktiviteten derav minskes med 60 - 90% under kokebehandling av produktet. Den gjenværende aktivitet vil bli opprettholdt på samme nivå så lenge det overflateaktive middel er tilstede, men en fullstendig stabilisering av interferonet trenger alltid en kombinasjon av de forannevnte tre reagenser.

Fremgangsmåten for å stabilisere interferon som fremlagt i denne beskrivelse gir en mulighet for å stabilisere interferon på flere stadier av gjenvinning og rensing og gir også en mulighet for langvarig lagring av interferon. Et forholdsvis rent stabilisert interferon som har en spesifikk aktiVitet på ca. 10 tt deler pr. mg protein, kan således bli gitt klinisk i stabilisert form. På grunn av det faktum at proteiner i alminnelighet bare binder 1,44 g natrium-dodecyl-sulfat pr. g. protein, vil en dose som inneholder millioner av deler av interferon bare omfatte noen få mikrogram natrium-dodecylsulf at , og derfor er det ingen risiko for komplika-sjoner ved klinisk administrasjon.

De folgende eksempler er ment å illustrere noen detaljer

og ikke å begrense oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Startmaterialet var en opplosning av mus-interferon oppnådd fra celler av Lg2g-typen stimulert av Newcastle-syke-virus. Denne opplosning ble surgjort til en pH på 2, hvorpå fremmede proteiner ble presipitert ved tilforsel av ammonium-sulfat inntil en metningsgrad av 20% ved 20°C ble nådd. Den klarede opplosning ble tilpasset til en pH på 7,2 ved dialyse overfor en 0,01 M TRIS-HC1 buffer. Den resulterende rensede opplosning hadde en aktivitet på 10 interferondeler pr. mm (bestemt ved biologisk proving).

Til en aliquot del av denne rensede interferonopplosning

ble tilfort en vandig opplosning av natrium-dodecylsulfat (NDS), øyeblikkelig fulgt av fast urea og flytende merkapto-etanol. De tilforte mengder var slike at den resulterende opplosning omfattet 5M urea, 1,4 x 10 merkaptoetanol og 3,5 x 10~^M NDS. Den resulterende opplosning ble oppvarmet ved 56°C i lopet av 60 min., men ingen forandring i utseendet kunne sees. En biologisk proving viste at interferonaktiviteten hadde blitt opprettholdt på samme nivå. Tilsvarende resultater ble oppnådd etter 2 1/2 min. koking ved 100°C og etter 30 perioder med frysing ( i en blanding av torris og aceton) og tining (ved 37°C). Den behandlede interferonopplosning syntes således å være fullstendig stabilisert overfor inaktivitetsfremkallende omstendigheter og manipulasjoner. Som kontroll, ble en annen aliquot del av den rensede startopplosning utsatt for de samme prover uten tilforing av de forannevnte reagenser. Aktiviteten av opplosningen gikk ned til ca. 10% av dens opprinnelige verdi etter oppvarming ved 56°C i lopet av 60 min. og gikk også ned til ca. 10% av dens opprinnelige verdi etter 30 fryse-tine-perioder. I kokeproven viste det seg at interferonaktiviteten allerede hadde gått ned til en

verdi under 10^" interf erondeler pr. ml etter 1 min. koking ved 100°C. Et presipitat viste seg etter 2 min. koking. Denne

ubehandlede ■ interferonopplosning var derfor meget labil<I>'

overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Eksempel 2.

Til en aliquot del av den samme rensede mus-interferonopplosning som ble brukt i eksempel 1, ble tilfort en opplosning avNDS fulgt av fast urea og merkaptoetanol-væske. Disse midler ble tilfort i slike mengder at den resulterende opplosning omfattet 5 M urea, 1,4 x 10<_1>M merkaptoetanol og 3,5 x 10 MNDS. Den resulterende opplosning ble utsatt for de samme prover som i eksempel 1 og resultatene av disse var de samme. Den behandlede interferonopplosning var således fullstendig stabilisert overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Som kontroll, ble en annen aliquot del av den rensede startopplosning utsatt for de samme prover uten tilforing av de forannevnte tre reagenser. I likhet med kontrollprovene i eksempel 1 mistet denne opplosning det meste av sin aktivitet ved oppvarming ved 56°C og ved 1 min. koking ved 100°C. Den ubehandlede interferonopplosning var derfor meget labil overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Eksempel 3.

Startmaterialet var en opplosning av interferon fra mennesker, oppnådd fra diploide "fibroblast" celler fra mennesker, stimulert med syntetisk dobbelt-kjedet polyribonucleinsyre, poly-riboinosinsyre og polyribocytidylinsyre. Dette materiales pH ble tilpasset til en verdi på 7,2 ved hjelp av dialyse overfor en 0,01 M TRIS-HCl buffer. Den resulterende opplosning hadde en aktivitet på ca. IO<4>interferondeler pr. ml (bestemt ved biologisk proving).

Til en aliquot del av denne interferonopplosning ble tilfort

folgende bestanddeler: forst en vandig opplosning av natrium-dodecylsulfat, så fast urea og merkaptoetanol-væske. De til-

forte mengder var slike at den resulterende opplosning om--2 -3 fattet 5 M urea, 1,4 x 10 M merkaptoetanol og 3,5 x 10 M NDS. Den resulterende opplosning ble utsatt for de samme prover som i eksempel 1 og tilsvarende resultater ble oppnådd. Den behandlede interferonopplosning var således fullstendig stabilisert overfor.inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Som kontroll ble en annen aliquot del av den rensede interferonopplosning utsatt for de samme prover uten tilforing av reagenser. Resultatene tilsvarte kontrollprovene i eksempel 1, dvs. bare 10% av aktiviteten igjen etter oppvarming ved 56°C og 30 f ryse-tine-perioder, og dessuten mindre enn 10^" interferondeler pr. ml igjen etter 1 min. koking ved 100°C. Denne ubehandlede opplosning var derfor meget labil overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Eksempel 4.

Til en aliquot del av den samme rensede interferonopplosning fra mennesker som ble brukt i eksempel 3, ble tilfort en opplosning av NDS, fulgt av fast urea og merkaptoetanol-væske i slike mengder at den resulterende opplosning om--1 -2 fattet 5M urea, 1,4 x 10 M merkaptoetanol og 3,5 x 10 M NDS. Den resulterende opplosning ble utsatt for de samme prover som i eksempel 1 og resultatene var tilsvarende. Den behandlede interferonopplosning var således igjen fullstendig stabilisert overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Som kontroll ble en annen aliquot del av den rensede startopplosning utsatt for de samme prover uten tilforing av de forannevnte tre reagenser. I likhet med kontrollprovene i eksempel 3, mistet denne opplosning det meste av sin aktivitet ved oppvarming ved 56°C og ved 1 min. koking ved 100°C. Den ubehandlede interferonopplosning var derfor meget labil overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

I

Eksempel 5.

Til en aliquot del av den samme rensede mus-interferon-

•

opplosning som ble brukt i eksemplene 1 og 2 ble tilfort en opplosning av dodecylamin fulgt av urea og merkapto-etanol-væske. Disse midler blé tilfort i slike mengder at den resulterende opplosning omfattet 5 M urea, 1,4 x 10~ M

_2

merkaptoetanol og 2 x 10 M dodecylamin.

Den resulterende opplosning ble utsatt for de samme prover som i eksempel 1 og resultatene var tilsvarende. Den behandlede interferonopplosning var således fullstendig stabilisert overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Som kontroll ble en annen aliquot del av den rensede interferonopplosning utsatt for de samme prover uten tilforing av de forannevnte tre reagenser. I likhet med kontrollprovene i eksempel 1 mistet denne opplosning det meste av sin aktivitet ved oppvarming ved 56°C og ved 1 min. koking ved 100°C. Den ubehandlede interferonopplosning var derfor meget labil overfor inaktivitetsfremkallende forhold og manipulasjoner.

Claims

1. En fremgangsmåte for å stabilisere interferon, karakterisert ved at en vandig interferonopplosning behandles med en kombinasjon av: (a) et middel til å spalte ikke-covalente bindinger, (b) et middel til å redusere disulfidbroer, og (c) et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel.

2. En fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at startmaterialet ér en opplosning av naturlig eller renset interferon som i det vesentlige ikke har mistet noe av sin opprinnelige aktivitet.

3. En fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte interferonopplosning 3 8 omfatter ca. 10 - ca. 10 interferondeler pr. mg protein 1 6 eller ca. 10 - ca. 10 interferondeler pr. ml.

4. En fremgangsmåte ifolge et av kravene 1 - 3, karakterisert ved at nevnte middel til å spalte ikke-covalente bindinger er urea.

5. En fremgangsmåte ifolge krav 4, karakterisert ved at urea brukes i slik mengde at den resulterende opplosning omfatter fra 0,1 - 10 M urea og fortrinnsvis 5 M urea.

6. En fremgangsmåte ifolge et av kravene 1 - 5, karakterisert ved at midlet til å redusere disulfidbroer er merkaptoetanol.

7. En fremgangsmåte ifolge krav 6, karakterisert ved at nevnte merkaptoetanol brukes i en slik _2 mengde at den resulterende opplosning omfatter minst 10 M og fortrinnsvis 1,4 x 10 M til 1,4 x 10 M merkapto-etanol .

8. En fremgangsmåte ifolge et av kravene 1 - 7, karakterisert ved at nevnte anioniske eller kationiske overflateaktivt middel er henholdsvis natrium-dodecylsulf at eller dodecylamin.

9. En fremgangsmåte ifolge krav 8, karakterisert ved at nevnte natrium-dodecylsulfat eller dodecylamin brukes i et 1-fold til 5-fold' overskudd beregnet på den totale mengde av proteiner i opplosningen.

10. En fremgangsmåte ifolge krav 9, karakterisert ved at når interferoninnholdet i opplosningen er ca. IO <4> interferondeler pr. ml, er den tilforte mengde av overflate-_3 aktivt middel slik at opplosningen omfatter fra 1 x 10 til 1 x 10~"^M overf lateakti vt middel.

11. En fremgangsmåte ifolge et av kravene 1 - 10, karakterisert ved at etter behandling med de forannevnte tre reagenser, blir overskuddet av overflate-akti vt middel og hele omfanget av de andre to midler fjernet ved dialyse.

12. Et stabilisert interferonprodukt, karakterisert ved at det omfatter en vandig interferonopplosning behandlet med en kombinasjon av: (a) et middel til å spalte ikke-covalente bindinger, (b) et middel til å redusere disulfidbroer, og (c) et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel.