SE445148B - Forfarande for framstellning av en biologisk komposition for anvendning som en referenskomposition for blodserum vid diagnostisk analys - Google Patents

Description

7906148-7 2 man skall kunna erhålla större kvantiteter människoblod som erfordras vid kommersiell tillverkning av referenskontroller.

Citraterad plasma i stället för humant blodserum är den enda användbara källan för erhållning av tillräckligt mycket människoblod för kommersiell tillverkning. Citraterad plasma kommer från plasmaferes-blodgivarbanker, som specialiserar sig på försäljning av citraterad plasma. Citraterad plasma er- hålles från givare via plasmaferes i en mängd av l liter per vecka per givare och har den ytterligare fördelen i förhål- lande till kliniskt i laboratorium sammanblandat människoblod, att den kontrolleras med avseende på hepatit och veneriska sjukdomar. Den metod som anges i patentet för behandling av humant blodserum medför dessutom förlust av väsentliga mängder protein. Förfarandet enligt patentet innefattar frysning av ett block av serum från blandat blod och efterföljande långsam upptining av det frysta blocket vid reglerad temperatur under en tidsperiod av 3 - 7 dagar för erhållning av en önskad volym av koncentrerat protein. Mer än 25 % av proteinet kvarblir i den frysta matrix som bortkastas enligt det i patentet angivna förfarandet.

Sammanfattning av uppfinningen.

Föreliggande uppfinning avser ett kommersiellt användbart för- farande för framställning av en biologisk komposition av den typ som anges i patentet, varvid källan för råmaterialet ut-V göres av citraterad plasma och varvid mindre än 0,10 % protein förloras under tillverkningen.

Förfarandet enligt uppfinningen innefattar: (a) tillsats av kalcium till citraterad plasma och noggrann blandning för bildning av decitraterad plasma; (b) tillsats av trombin till den decitraterade plasman och noggrann blandning till bildning av en fibrinklump; (C) utförande av åtminstone en frysnings/upptinings~rutin på klumpen för att bringa fibrinet att kontrakteras; (d) avlägsnande av fibrinet för erhållning av serum; (e) molekylärtvättning och ultrafiltrering av serum för erhållning av koncentrerat serum; och 19oe14sl7 3 (f) tillsats till det koncentrerade serumet av minst en alkylenpolyol innehållande 2 - 5 kolatomer i en mängd som är sådan att kompositionens icke biologiska komponent utgör från ungefär 40 till ungefär 85 viktprocent vatten och från ungefär 15 till ungefär 60 viktprocent av alkylenpolyolen.

Beskrivning av föredragna utföringsformer.

Förfarandet enligt uppfinningen innefattar: (a) tillsats av kalcium till citraterad plasma och noggrann blandning till bildning av decitraterad plasma; (b) tillsats av trombin till den decitraterade plasman och noggrann blandning till bildning av en fibrinklump; (c) utförande av minst en, företrädesvis minst tre och mer föredraget tre eller fyra, frysnings/upptinings-rutiner på klumpen för att förorsaka sammandragning av fibrinet; (d) avlägsnande av fibrinet för erhållning av serum; (e) molekylärtvättning och ultrafiltrering av serum för' erhållning av koncentrerat serum; och (f) tillsats till det koncentrerade serumet av minst en alkylenpolyol innehållande 2 - 5 kolatomer i en mängd som är sådan att kompositionens icke biologiska beståndsdel utgör från ungefär 40 till ungefär 85, företrädesvis från ungefär 60 till ungefär 80 viktprocent vatten och från ungefär 15 till ungefär 60, företrädesvis från ungefär 20 till ungefär 40 viktprocent av alkylenpolyolen.

Tillräckligt med kalciumsalt sättes till den citraterade plasman för att undanröja det citrat som är närvarande i plasman. Vanligen tillsättes minst 10 mg kalciumsalt per 100 ml plasma. Företrädesvis tillsättes minst 20 mg kalcium- salt per 100 ml plasma. Det föredrages även att inte mer än ungefär 40 mg kalcium tillsättes per lOO ml plasma. Om allt- för mycket kalciumsalt tillsättes blir halten kalcium i slut- produkten alltför hög för diagnostisk användning.

Det trombin som sättes till den decitraterade plasman kan härröra från varje animal källa såsom nötkreatur eller hästar.

Företrädesvis tillsättes minst l eller mer företrädesvis minst 7906148-7 4 3 NIH-enheter trombin per ml serum. På grund av de förluster som därvid uppkommer är det icke önskvärt att tillsätta mer än 10 NIH-enheter/ml serum trombin till plasman.

Efter tillsatsen av trombin skall plasman stå under en tid som är tillräcklig för bildning av en fast klump i plasman, t.ex. från ungefär 5 minuter till ungefär 6 timmar vid rumstempe- ratur.

Frysnings/upptinings-rutinen kan genomföras på varje konven~ tionellt känt sätt. Exempelvis kan frysningen utföras vid en temperatur från ungefär -5 till ungefär -20°C. Även om tiden inte är kritisk föredrages det att utföra frysningsförfarandet under minst 8 timmar. Det frysta materialet kan få tina på varje lämpligt sätt. Upptiningen kan exempelvis ske vid ungefär l5 till ungefär 35°C i ett vattenbad. Upptiningen genomföres företrädesvis under den tidsperiod som är nödvän- dig för att fullständigt till vätska överföra den fasta massan.

Denna tidsperiod är vanligen från ungefär 2 till ungefär 5 timmar, Det bör observeras att det föreligger en fundamental funk- tionell skillnad mellan det frysnings/upptinings-förfarande som användes enligt uppfinningen och det som användes enligt patentet. Enligt patentet är ändamålet med frysnings/upp- tinings-förfarandet att avlägsna en volym vatten från serumet och därvid koncentrera proteinet. Såsom diskuterats ovan förloras ungefär 25 % eller mera av proteinet i den frysta matrixen som bortkastas enligt patentet.

I motsats därtill användes enligt föreliggande uppfinning ett frysnings/upptinings-förfarande för att kontrahera íibrin- klumpen vid överföring av plasma till serum. Det samman- dragna fibrinet avlägsnas från serumet och bortkastas.

Mindre än 0,10 % protein förloras i den bortkastade fibrin~ klumpen.

Fibrinet kan avlägsnas från materialet på varje sätt som är 7906148-7 5 välkänt för fackmannen. Exempelvis kan materialet antingen uthällas i ett filtreringssystem såsom en kalender eller centrifugeras för avlägsning av fibrinet.

En molekylärtvättning kan genomföras på varje sätt som är välkänt för fackmannen. Vanligen sättes destillerat eller avjoniserat vatten till serumet.

Ultrafiltreringsstegen kan även utföras på varje sätt som_är välkänt för fackmannen. Ultrafiltret har företrädesvis en nominell diskrimination med avseende på molvikten (m.v.) av ungefär 10.000. Vid användning av ett ultrafilter med en molviktsdiskrimination av ungefär 10.000 kan man erhålla ett hastigt serumflöde genom ultrafiltret under kvarhållande av lågmolekylära beståndsdelar (t.ex. glukos, molvikt 180; salt, molvikt 58; kalcium, molvikt 40; vatten, molvikt 18).

Proteinerna avlägsnas icke desto mindre från serumet på grund av att de har en molvikt som är större än 50.000 (t.ex. har albumin en molvikt av ungefär 64.000), Om man önskar inaktivera all endogen enzymverkan kan man syra- behandla serumet efter steg (d) på så sätt att man först sänker pH-värdet däri till från ungefär 3,0 till ungefär 4,5, företrädesvis ungefär 4, varefter man höjer pH-värdet i serumet till från ungefär 6,0 till ungefär 9,0, företrädesvis från ungefär 6,5 till ungefär 8,5. Serumets pH kan sänkas med varje lämplig syra, t.ex. HCl, och kan höjas med varje lämplig bas, t.ex. Na0H.

Dessutom föredrages det att bringa det koncentrerade serumet efter steg (e) eller det rekoncentrerade serumet efter (fi i kontakt med i gasfas framställd kiseldioxid, varefter blandas och kiseldioxiden separeras därifrån. Det senare förfarandet ger serumet ett förbättrat estetiskt utseende och avlägsnar även eventuellt närvarande lipider och triglycerider därifrån.

Följande exempel belyser uppfinningen närmare. 7906148-7' Exempel l.

Serum med en initiell koncentration av 5,6 g/dl protein fördes genom en "Millipore Pellicon.c) Cassette System", som är en ultrafiltreringsenhet. Ultrafiltreringsenheten har tvâ ut- flöden, varav det ena utgör det kvarhâllna och det andra filtratet. Filtratet innehållande vatten och låqmolekylära föreningar avlägsnas från serumet och bortkastades senare.

Den kvarhållna delen innehöll det koncentrerade serumet, som efter återcykling hade en proteinkoncentration av 14 - 16 mq/dl totalt protein.

Innan filtratet bortkastades undersöktes det med avseende på proteinhalt enligt Extons metod och halten visade sig vara negativ, dvs. produkten var fri från varje protein.

Exemplet ovan visar klart att inget protein förloras under ultrafiltreringen. Det enda protein som förloras vid metoden enligt uppfinningen är sålunda den som är närvarande i fibrin- klumpen. Såsom påpekats ovan medför detta att prutuinför- lusten är mindre än 0,10 %.

Baserat på grundtanken i uppfinningen kan förfarandet modi- fieras på sätt som är uppenbara för fackmannen. Sådana modi- fikationer avses falla inom ramen för uppfinningen.

Claims (7)

7906148-7 PATENTKRAV .

1. l. Förfarande för framställning av en biologisk komposi- tion för användning såsom en referenskomposition för blodserum vid diagnostisk analys, k ä n n e t e c k n a t därav, att man: (a) sätter kalcium till citraterad plasma och blandar noggrant till bildning av decitraterad plasma; (b) sätter trombin till den decitraterade plasman och blandar noggrant till bildning av en fibrinklump; (c) utför minst en frysnings/upptinings-rutin på fibrin- klumpen för att bringa fibrinet att kontraheras; (d) avlägsnar fibrinet för erhållning av serum; (e) molekylärtvättar och ultrafiltrerar serumet för erhållning av koncentrerat serum; och (f) sätter till det koncentrerade serumet minst en alkylen- polyol med 2 - 5 kolatomer i en mängd som är sådan att kompo- sitionens icke biologiska komponent utgör från 60 till ungefär 80 viktprocent vatten och från 20 till 40 viktprocent av alkylenpolyolen.

2. Förfarande enligt patentkravet L, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man efter steg (d) syrabehandlar serumet på så sätt att man först sänker dess pH till från 3,0 till 4,5, varvid man ínaktiverar alla endogen enzym- verkan, och därefter höjer pH-värdet för serumet till från 6,0 till 9,0.

3. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n 3 e t e c k - n a t därav, att pH-värdet först sänkas till 4 och därefter höjes till från 6,5 till 8,5.

4. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e 1 e c k - n a t därav, att minst tre frysnings/upptinings-rutiner utföres på fibrinklumpen.

5. Füríarandc enligt patentkravct 4, K Ä n n e L u c k - n a L därav, att fyra frysnings/ypptinings-rutiner utföres 7906148-7 på fibrinklumpen._

6. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man efter steg (e) bringar det koncentrera- de serumet i kontakt med i ångfas framställd kiseldioxid, varefter blandas och separeras.

7. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man efter steg (f) bringar i ångfas fram- ställd kiseldioxid i kontakt med alkylenpolyolen innehållande biologisk komposition, varefter blandas och separeras.