NO751117L - - Google Patents

Description

Reaktiver ing av interferon.

Foreliggende oppfinnelse vedrorer reaktivering av interferon.

Interferon er det navn som er gitt til et celleformet antivirus materiale som kan gjenvinnes fra levende celler og fra ekstracelleformede væsker. Dets produksjon i cellene kan sti-muleres ved hjelp av forskjellige midler, inkludert for det forste virus og ytterligere en mangfoldighet av andre midler i området fra bakterier til hoymolekulare polymerer. Interferon kan gjenvinnes fra cellene eller ekstracelleformede væsker i forskjellig grad av renhet og synes å være i stand til å beskytte vev og celler hos dyr mot virusangrep. Generelt er interferons antivirus-aktivitet ikke-spesifikk i dens evne til å gi beskyttelse mot andre virus i tillegg til de som har blitt brukt til å stimulere cellene, selv om forskjeller i folsomhet overfor interferon har blitt lagt merke til mellom forskjellige virus. I de fleste tilfeller har det vist seg at interferon gir bedre beskyttelse til vev og celler av den type som det har blitt produsert fra, enn til andre vev og celler.

Generell oversikt over nåværende kjennskap til. interferon

kan finnes i folgende boker: "Interferon" av J. Vilcek, (Springer-Verlag, Vienna-New York, 1969) og "Selective Inhi-bitors of Viral Functions" av W.A. Carter (ed),CRC-Press, Cleveland, 1973), som er tatt med heri som referanse.

Selv om my arbeide har blitt gjort vedrorende fysisk og kjemisk karakterisering av interferon, har det enda ikke vært mulig å bestemme dets kjemiske struktur med sikkerhet. Det synes opplagt at interferon er av protein-type, men de fleste av detaljene derom er usikre. Bestemmelsen av denne kjemiske struktur har i stor utstrekning blitt hemmet av det faktum at det synes å være flere molekular-arter av interferon, og slike arter har forskjellig molekularvekt og forskjellige faktorer, slik som typen av celler brukt til interferon- fremstilling (f.eks. celler fra forskjellige dyrearter slik som mus, kanin, kylling eller menneske, eller celler oppnådd fra forskjellige vev fra en enkelt dyreart), beskaffenheten av midlet som brukes for å stimulere produksjonen (f.eks. forskjellige virus), den virkelige produksjonsmetode og den virkelige metode for å gjenvinne interferon fra celler eller væsker.

Dessuten har produksjon, rensing og klinisk evaluering av interferon blitt hemmet opp til nå av forskjellige faktorer, av hvilke den viktigste er interferons ry for å være ustabilt. Selv om det har vist seg at noen typer av interferon, slik som leukocytt interferon fra mennesker og kanin-interferon, er mer eller mindre stabile overfor inaktivering, blir andre typer av interferon lett inaktivert av forskjellige omstendigheter, slik som langvarig lagring, uonskede pH verdier, hoye temperaturer og kjemiske og mekaniske manipuleringer, slik som risting, gjentatte fryse- og tineperioder, skumming ved filtrering og lignende. Enda flere typer av interferon, slik som "fibrobJast" interferon fra mennesker, er så ustabile at deres aktivitetsnivåer ikke er pålitelige. Ytterligere synes selv de forholdsvis mest stabile typer av interferon å bli labile så snart en hoy grad av renhet har blitt nådd. For å overkomme disse vanskeligheter har det blitt foreslått å tilfore fremmede proteiner for å beskytte interferonet under dets rensing, men denne proteintilforsel har mange ulemper fordi de fleste typer av interferon vil motstå beskyttelse og hensikten med rensingen motarbeides derved.

Det er derfor behov for en metode for å reaktivere interferon som har mistet en del av eller all sin aktivitet som et resul-tat av sin natur eller under innflytelse av en av de forannevnte omstendigheter. Mere spesielt er det behov for en metode som tillater slikt delvist eller totalt inaktivert interferon å reaktiveres fullstendig, d.v.s. gi det sin opprinnelige aktivitet tilbake.

I en svevende patentsøknad av samme dato er det allerede blitt fastslått at en vandig interferon-opplosning, hvor interferonet nesten ikke har mistet noe av sin aktivitet, kan stabiliseres ved behandling med en kombinasjon av tre reaksjonskomponenter, nemlig (a) et middel for å spalte ikke-kovalente bindinger, slik som urea eller guanidin-hydroklorid, (b) et middel for å redusere disulfidbroer, slik som merkapto-etanol, og (c) et anioni.sk eller kationisk overflateaktivt middel slik som natriumdodecyl-sulfat eller dodecylamin. Når det behandles med disse tre midler vil interferonet i det vesentlige beholde sin opprinnelige aktivitet og vil være stabilt overfor inaktivering under påvirkning av de forannevnte forhold og manipulasjoner..

Helt overraskende er det nå blitt funnet at et interferon, hvis aktivitet allerede er blitt redusert eller som ganske er blitt inaktivert, kan delvis eller fullstendig reaktiveres ved behandling med en kombinasjon av de samme tre reaksjonskomponenter. En fullstendig reaktivering er helt sikkert mulig hvis interferonet, etter tilsetning av de nevnte tre reaksjonskomponenter, oppvarmes ved 90 - 105 5C i noen minutter og det resulterende produkt i dette tilfelle har i det vesentlige den samme eller også hoyere aktivitet enn det opprinnelige, ennå ikke inaktivert interferon. Dessuten vil den resulterende aktivitet forbli konstant og således gi et produkt som er stabilt overfor inaktiverende forhold og manipulasjoner.

Oppfinnelsen fremskaffer en metode for å reaktivere interferon, som erkarakterisert vedbehandling av en vandig interferonopplosning, hvor interferonet har mistet i det minste en del av sin opprinnelige aktivitet, med en kombinasjon av (a) et middel for å spalte ikke-kovalente bindinger, (b) et middel for å redusere disulfid-broer, og (c) et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel. Det er foretrukket, etter tilsetning av de tre nevnte midler, å utsette interferonopplosningen for en varmebehandling, slik som oppvarmning ved 90 til 105°C i lopet av 0,5 til 10 minutter, for å oppnå fullstendig reaktivering.

i i

Takket være denne oppdagelse er det blitt mulig å oppnå hoye utbytter ved produksjonen og rensingen av interferon og dessuten å fremstille et stabilt interferonprodukt som er egnet for klinisk evaluering.

Reaktiveringsmekanismen tilveiebragt av oppfinnelsen er enda ikke helt klar. Det antas imidlertid at interferonmolekylet består av en polypeptidkjede med kovalente og ikke-kovalente bindinger og ytterligere har en eller flere disulfid-broer, og at forskjellen mellom biologisk aktivt interferon og et interferon som er blitt inaktivert av forannevnte forhold bare kan beskrives som en forskjell i molekylets romstruktur eller oppbygning. Således vil det eksistere en aktiv oppbygning og en inaktiv oppbygning. (Selvfolgelig kan man fore-stille seg forhold hvor interferonmolekylet er i noen grad brutt sammen, men slike forhold tas ikke med i betraktning her). Når det inaktiverte interferon nå behandles med de tre reaksjonskomponenter ifolge oppfinnelsen så omdannes molekylet tilsynelatende ved spaltning av ikke-kovalente bindinger og reduksjon av disulfid-broer til en annen oppbygning med en "liniær tilfeldig spiral" (linear random coil) og med frie sulfhydrylgrupper, hvoretter det anioniske eller kationiske overflateaktivt middel vil binde seg til de ladede grupper på polypeptidkjeden og beskytte de frigjorte sulfhydrylgrupper overfor reoksydasjon ledsaget av intramolekular eller intermolekular omdannelse av disulfid-broer. Disse reaksjo-ner vil begynne allerede ved omgivelsestemperatur for største-partens vedkommende, men kan akselereres eller fullendes ved hjelp av en varmebahdnling slik som oppvarmning ved 90 til 105°C i noen tid. Det resulterende produkt kan befries for overskuddet av overflateaktivt middel og for spaltnings- og reduksjonsmidlene ved hjelp av dialyse hvis onsket. Når produktet senere inkuberes med et proteinholdig medium, slik som et medium bestående av levende celler, vil produktet spon-tant utvikle en aktiv oppbygning som i det vesentlige har den opprinnelige aktivitet for det tilsvarende interferon eller i noen tilfeller også en hoyere aktivitet. Hele fremgangs-måten kan beskrives som en reaktivering av det inaktiverte interferon. I

Det vil selvfølgelig være innlysende at oppfinnelsen ikke er

begrenset til denne teoretiske forklaring. Derimot omfatter oppfinnelsen alle trekk og materialer som faller innenfor rammen av etterfølgende krav.

Ved utførelse av metoden ifolge oppfinnelsen kan utgangsmaterialet være en hvilken som helst type interferon som har mistet i det minste en del av sin opprinnelige aktivitet. Anven-delige utgangsmaterialer kan være interferon som har mistet en del av eller all sin aktivitet under innvirkning av inaktiverende forhold eller manipulasjoner såvel som interferon som er blitt utvunnet i labil eller inaktivert tilstand under sin produksjon eller rensning. Fra de folgende eksempler vil det fremgå at mus-interferon (av forskjellige typer) såvel som "fibroblast"-interferon fra mennesker i en mere eller mindre inaktivert tilstand, kan anvendes som utgangsmaterialer og mange andre typer av interferon (med unntagelsen av de typer som er i og for seg stabile) vil også være egnet. I de fleste tilfeller er dette interferon tilgjengelig i form av en vandig oppløsning bestående av en mengde interferon tilsvarende en

3 8

opprinnelig aktivitet mellom 10 og 10 interferonenheter pr. milligram protein (eller mellom ca. 10 1 og 10 6 interferonenheter pr. millimeter opplosning) og denne oppløsning kan anvendes som sådan ved metoden ifolge oppfinnelsen.

Ifolge oppfinnelsen behandles dette totalt eller delvist inaktiverte interferon deretter med en kombinasjon av tre reaksjonskomponenter, nemlig et middel for spaltning av ikke-kovalente bindinger, et middel for å redusere disulfid-broer og et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel.

Et egnet middel for å spalte ikke-kovalente bindinger kan anvendes ved metoden ifolge oppfinnelsen. Typiske eksempler er urea og guanidin-hydroklorid, idet urea er foretrukket.

Mengden av et slikt middel som brukes ved metoden ifolge oppfinnelsen skal være tilstrekkelig til å forårsake utfolding av polypeptidkjeden i interferonmolekylet for å oppnå en "lineær tilfeldig spiral". Generelt er mengden urea som brukes! slik at den resulterende opplosning omfatter fra 0,1 til 10 M urea og fortrinnsvis er konsentrasjonen 5M urea. Lavere konsentrasjoner enn 0,1 M vil være uten virkning og hoyere konsentrasjoner enn 10 M er ubrukelige fordi metningspunktet da er blitt nådd.

Ethvert egnet middel for å redusere disulfid-broer kan anvendes ved metoden ifolge oppfinnelsen. Et typisk eksempel er etantiol eller merkaptoetanol. Mengden av dette som brukes skulle være tilstrekkelig til å redusere alle disulfid-broer i interferonmolekylet så langt som de er tilstede i det. I de fleste tilfeller er mengden av merkaptoetanol slik at den resulterende opplosning omfatter minst 10 _ 2M merkapto-etanol. Lavere mengder enn 10 - 2 M vil ha liten eller ingen virkning. En ovre grense kan vanskelig gis fordi hoyere mengder ikke er uheldige. Det • er foretrukket å anvende konsentrasjoner på ca. 1,4 x 10 -<2>M til 1,4 x IO<->'<*>' M merkapto-etanol i opplosningen.

Ethvert egnet anionisk eller kationisk overflateaktivt middel kan anvendes ved metoden ifolge oppfinnelsen. Det anioniske middel vil i de fleste tilfeller være et alkylsulfat med 8 til 22 karbonatomer i sin alkylgruppe, slik som natriumdodecyl-sulfat eller natriumdecylsulfat, eller også et tilsvarende alkylsulfonat slik som natriumdodecylsulfonat. Det kationiske middel vil generelt være et alkylamin med 8 til 22 karbonatomer i sin alkylgruppe, slik som dodecylamin eller decylamin. Mengden av dette middel slik som det anvendes skal være tilstrekkelig til å binde proteinet og' til å beskytte sulfhy-drylgruppene i interf eronrtv o lekylet som er frigjort av forannevnte reduksjonsmiddel. For å være sikker på den onskede virkning vil et 1-fold til 5-fold overskudd av det overflateaktive middel beregnet på den totale mengde protein i opplosning i de fleste tilfeller bli brukt. Hvis utgangsmaterialet er en interferonopplosning som omfatter ca. lo 4 interferonenheter pr. millimeter, vil dette bety at opplosningen skal omfatte minst 1 x 10 - 3 M og maksimalt 1 x 10 -1M over-

i ■ i

flateaktivt middel. En mengde på 3,5 x 10 - 3 M til 3,5 x 10 - 2 M

natriumdodecylsulfat ér foretrukket i dette tilfelle.

Tilsetningsrekkefolgen for de tre reaksjonskomponenter er ikke kritisk, skjont det er foretrukket å tilsette detoverflateaktive middel samtidig med eller for de andre to midler for å være sikker på at dette overflateaktive middel er i stand til å reagere med polypeptidet for å beskytte sulfhydry]g ruppene så snart som de er blitt frigjort av reaksjonsmidlet. Det er foretrukket å tilsette alle tre midler på omtrent samme tid eller like etter hverandre.

Skjont generelt de tre reaksj onskomponenter vil reagere allerede ved omgivelsestemperatur med det inaktiverte interferon, behover ikke alltid reaksjonen å nå sin fullendelse da. Således, hvis utgangsmaterialet er en vandig interferonopplosning som er blitt inaktivert fullstendig ved kokning,vil en behandling med de tre reaksjonskomponenter ved omgivelsestemperatur bare resultere, i en reaktivering for oppnåelse av ca. 50 % av den opprinnelige interferonaktivitet. I slike tilfeller er det foretrukket å utsette interferonopplosningen for en varmebehandling etter tilsetning av de tre reaksjonskomponenter. Denne varmebehandling kan f.eks. omfatte oppvarmning ved en temperatur på 90 til 105°C i lopet av 0,5 til 10 minutter, og fortrinnsvis oppvarmning av opplosningen ved 100°C i 1 minutt. En slik varmebehandling kan allikevel resultere i en fullstendig reaktivering av interferonet.

Etter omsetningen med de tre reaksjonskomponenter kan overskuddet av overflateaktivt middel og den totale mengde av de andre to reaksjonskomponenter fjernes ved dialyse hvis onsket. Imidlertid er denne fjerning ikke absolutt nodvendig for ytterligere anvendelse av produktet.

Takket være metoden ifolge oppfinnelsen kan en betydelig

til fullstendig reaktivering av det inaktiverte interferon og dessuten en stabilisering av produktet overfor etterfølgende inaktiverende forhold og manipulasjon oppnås. Det fremgår at

inaktivert menneskelig "f ibroblast-interf eron såvel som inaktivert mus-interferon vil få igjen deres opprinnelige aktivitet ved hjelp av behandling med urea, merkaptoetanol og natriumdodecylsulfat, fulgt av oppvarmningsbehandling. Dessuten, det resulterende produkt synes å være stabilt overfor etterføl-gende oppvarmning ved 56°C og 100°C.

Det må legges merke til at den samme virkning ikke kan oppnås med bare en eller to av de forannevnte tre reaksjonskomponenter. Således vil urea og merkaptoetanol, når de brukes alene eller sammen, ikke ha noen stabiliserende virkning, men heller en ustabilitets-fremkallende virkning på interferon til tross for det faktum at flokkulerte deler av interferon gjen-opploses ved dette. Natriumdodecylsulfat eller en kombinasjon av natriumdodecylsulfat og urea kan fore til delvis reaktivering, men denne reaktivering forblir meget liten. Således, ved å starte med fullstendig inaktivert menneskelig "fibroblast-interferon eller mus-interferon og ved anvendelse av disse to reaksjonskomponenter, kan ikke mere enn ca. 5% av den opprinnelige aktivitet gjenvinnes ved romtemperatur og ikke mere enn ca. 10% av den opprinnelige aktivitet kan gjenvinnes ved 1 minutts kokning ved 100°C. Dette betyr at en kombinasjon av tre reaksjonskomponenter sammen eller ikke sammen med en varmebehandling alltid vil være nodvendig for å nå fullstendig reaktivering.

Metoden for å reaktivere interferon slik som fremlagt i denne beskrivelse gir en mulighet for å gjenvinne alle typer av interferon som har mistet deler av deres aktivitet under rensning og dessuten gjenvinne alle interferon-sammensetninger som er blitt redusert med hensyn til aktivitet ved langvarig lagring. Det kan således gjores bedre bruk av ethvert interferon som allerede er blitt fremstilt i et tidligere trinn. Det faktum at dette reaktiverte interferon er stabilt overfor ytterligere inaktivering gjor det mulig å anvende dette interferon på en rekke måter og å anvende det klinisk. Et rela-tivt rent reaktivert interferon med en aktivitet på ca. 10° til 10 g interferonenheter pr. milligram protein kan således administreres klinisk i reaktivert form. Generelt vil pro teiner bare binde 1,44 g natriumdodecylsulfat pr. gram protein og dette betyr at en dose som inneholder millioner av enheter interferon bare vil omfatte noen få mikrogram natriumdodecyl-sulf at.Det vil derfor ikke være noen risiko for komplikasjoner ved klinisk administrasjon.

De folgende eksempler er ment å illustrere formålene og begren-ser ikke oppfinnelsens ramme.

EKSEMPEL 1

Utgangsmaterialet var en opplosning av mus-interferon avledet fra celler av L-g2<g->typen stimulert av Newcastle-syke-virus (NDV). Opplosningen ble surgjort til en pH på 2, hvorpå fremmede proteiner ble presipitert ved tilsetning av ammoniumsul-fat inntil en metningsgrad på 20% ved 20°C var nådd. Den kla-rede opplosning ble tilpasset til en pH på 7,2 ved dialyse overfor en 0,01 M TRIS-HC1 buffer. Den resulterende rensede opplosning hadde en aktivitet på 10 4 interferonenheter pr. milliliter (bestemt ved biologisk prove).

En alikvot del på 1 ml av denne rensede interferonopplosning ble anbragt i et proveror som var neddykket i et beger fylt med kokende vann. Etter 2 1/2 minutts oppvarmning ved 100°C var interferonet stort sett fullstendig inaktivert, idet dets aktivitet var redusert til mindre enn 10 interferonenheter pr. milliliter.

Et antall ytterligere alikvote deler av 1 ml renset interferonopplosning ble forst oppvarmet ved 100°C på forannevnte måte i 2 1/2 minutt. Etter avkjoling ble de inaktiverte opp-losninger, en eller flere reaksjonskomponenter fra gruppen fast urea, flytende merkapto-(etanol og en vandig opplosning av natriumdodecylsulfat (SDS) tilsatt til denne i slike mengder at sluttkonsentrasjonen for disse reaksjonskomponenter, såfremt de var tilstede, var 5 M urea, 1,4 x 10 _ 2M merkapto-etanol og 3,5 x 10 oM SDS. Vann ble også tilsatt i noen tilfeller for å utligne fortynningsfaktoren for alle prover. For enhver reaksjonskomponent eller kombinasjon av reaksjonskomponenter ble reaksjonen utfort én gang ved romtemperatur og én gang ved forhoyet temperatur. Derpå ble opplosningen oppvarmet 1 minutt ved 100°C etter tilsetning av reaksjonskomponen-tene. Derpå ble de resulterende blandingers aktiviteter vur-dert ved hjelp av biologisk prove. Resultatene er angitt i den folgende tabell 1.

Uttrykket "titer" i denne er en indikasjon på den desimale

logaritme av aktiviteten (i interferonenheter pr. milliliter). Alle titer-verdier er et gjennomsnitt av tre separate forsok.l

Det fremgår av tabell 1 at en betydelig til fullstendig reaktivering av inaktivert interferon kan oppnås ved behandling med en kombinasjon av tre reaksjonskomponenter ifolge oppfinnelsen. Behandlingen av det inaktiverte interferon med SDS alene eller med kombinasjon av SDS med en av de andre reaksj onskomponenter vil resultere i en viss gjenoppbygning av aktivitet, men selv etter 1 minutts kokning ved 100°C er denne reaktivering ikke fullstendig. En behandling med urea og merkapto-etanol enten alene eller i kombinasjon forårsaker ingen reaktivering.

EKSEMPEL 2

Et antall interferonopplosninger av forskjellige kilder og aktiviteter ble forst inaktivert og derpå utsatt for en reaktiver ingsbehandling ifolge oppfinnelsen.

Opplosningene som anvendes for dette eksempel var:

1) En opplosning av mus-interferon fremstilt i L-celler inokulert med ultrafiolett bestrålt Newcastle-syke-virus (NDV-UV). Dette interferon omfattet 0,5 % serum albumin og hadde opprinnelig en aktivitet på 10 g interferonenheter pr. mg protein eller 10 interferonenheter pr. milliliter. 2) En opplosning av mus-interf eron fremstilt i Lg29ceHer inokulert med Newcastle-syke-virus (NDV). Tre typer ble anvendt som har aktiviteter på 10 4 , 10 6 henh.mer enn 10 7 interferonenheter pr. mg protein. Dette tilsvarer i hvert tilfelle 10 4 interferonenheter pr. ml. 3) En opplosning av mus-interferon fremstilt i interferon-påvirkede Lpa celler inokulert med MM stammen av encephalomyo-carditis virus. To typer ble anvendt som har aktiviteter på 4 6 10 henh. 5 x 10 interferonenheter pr. mg protein. Dette tilsvarer i begge tilfeller 10 4 interferonenheter pr. ml. 4) En opplosning av menneskelig diploid "fibroblast" interferon fremstilt i menneskelige diploide"fibroblast"celler indusert av polyriboinosinsyre og polycytidylinsyre (poly I, poly C) og derpå "super-indusert" ifolge metoden av Havell og Vilcek (Antimicrobial Agents Chemother., 2, 476-484 (1972). Tre typer ble anvendt med aktiviteter på 10 4 , ca. 10 3 henh. ca. 10<2>interferonenheter pr. ml.

De biologiske prover for å vurdere interferonaktiviteten ble utfort ved bestemmelse av sluttpunktet hvor 50 % plaque reduksjon inntraff. Dette ble utfort med vesicular stomatitis virus i Lg29-celler for mus-interf eron og med den samme virus i L-j^ "fibroblast" celler for menneskelig interferon.

Inaktiveringen ble utfort på forskjellige måter, nemlig ved

2 1/2 minutters kokning ved 100°C, ved 30 minutters oppvarmning ved 56°C, ved 100 gangers frysning og tining, eller ved å tilsette urea og merkapto-etanol i slike mengder at deres sluttkonsentrasjoner var 5 M urea henh. 1,4 x 10~merkapto-etanol. Disse inaktiverings-fremgangsmåter er angitt i tabell 2. Oppvarmning ved 100°C synte s å være den mest effektive inaktiveringsmåte. Hastigheten og graden av inaktivering var avhengig av den totale mengde av fremmede proteiner.

Etter inaktivering ble interferonopplosningene utsatt for en reaktiveringsbehandling ifolge oppfinnelsen. Denne behandling besto av en tilsetning av fast urea, flytende merkapto-etanol og en vandig opplosning av natriumdodecylsulfat i slike mengder at deres sluttkonsentrasjoner var 5 M urea, 1,4 x 10 _<2>M merkapto-etanol henh. 3,5 x 10 M natriumdodecylsulfat, fulgt av oppvarmning av hele blandingen ved 100°C i 1 minutt.

Ytterligere detaljer ved angår utgangsmaterialet, opprinnelig titer, inaktiveringsmåte, titer etter inaktivering og titeren etter reaktivering gjenfinnes i den folgende tabell 2. Uttrykket "titer" betyr den desimale logaritme av aktiviteten ut-trykt i interferonenheter pr. milliliter.

Uttrykket "spesifikk aktivitet" bestyr aktiviteten pr. milligram protein.

Det folger av tabell 2 at en fullstendig reaktivering kan oppnås med mange forskjellige utgangsmaterialer.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for reaktivering av interferon, karakterisert ved behandling av en vandig interferonopplosning hvor interferonet har mistet i det minste en del av sin opprinnelige aktivitet med en kombinasjon av: (a) et middel for å spalte ikke-kovalente bindinger, (b) et middel for å redusere disulfidbroer, og (c) et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel.

2. Fremgangsmåte etter krav 1, karakterisert ved ' at nevnte interf eronopplosning bestårav___ 3 8 ' ca. 10 til ca. 10 interferonenheter pr. milligram protein 1 6 eller ca. 10 til ca. 10 interferonenheter pr. milliliter.

3. Fremgangsmåte etter ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte middel for spaltning av ikke-kovalente bindinger er urea.

4. Fremgangsmåte etter krav 3, karakterisert ved at urea anvendes i en slik mengde at den resulterende opplosning består av fra 0,1 til 10 M urea og fortrinnsvis 5 M urea.

5. Fremgangsmåte etter ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at midlet for å redusere disulfidbroer er merkapto-etanol.

6. Fremgangsmåte etter krav 5, karakterisert ved at nevnte merkapto-etanol anvendes i en slik mengde at den resulterende opplosning består av minst 10 M og fortrinnsvis 1,4 x 10 M til 1,4 x 10 M merkapto-etanol . liF remgangsmåte etter et av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nevnte anioniske eller kationiske overflateaktive middel er natriumdodecylsulfat eller henh- dodecylamin.

8. Fremgangsmåte etter krav 7, karakterisert ved at nevnte overflateaktive middel anvendes i et 1-fold til 5-fold overskudd beregnet på den totale protein-mengde i opplosning.

9. Fremgangsmåte etter krav 8, karakterisert ved at når interferoninnholdet i opplosning er ca.

10 4interferonenheter pr. milliliter er den tilsatte mengde overflateaktivt middel slik at opplosningen består av fra 1 x 10~ <3> til 1 x 10 <_1> M overflateaktivt middel.

10. Fremgangsmåte etter et av kravene 1 til 9, karakterisert ved at etter tilsetning av de nevnte tre midler utsettes den resulterende interferonopplosning for en varmebehandling.

11. Fremgangsmåte etter krav 10, karakterisert ved at nevnte varmebehandling består av å opp-varme opplosningen ved 90 til 105°C i 0,5 til 10 minutter.

12. Fremgangsmåte etter et av kravene 1 til 11, karakterisert ved at etter behandling med forannevnte tre reaksjonskomponenter fjernes overskuddet av overflateaktivt middel og hele omfanget av de to andre midler ved dialyse.

13. Reaktivert interf er onpr^odukt, karakterisert ved at det omfatter en vandig interferonopplosning hvis aktivitet er blitt gjenopprettet ved behandling med en kombinasjon av (a) et middel for å spalte ikke-kovalente bindinger, (b) et middel for å redusere disulfidbroer, og (c) et anionisk eller kationisk overflateaktivt middel. /