DE3687702T2 - Schutz von methionin in einer polypeptid-kette von irreversibler oxydation. - Google Patents
Schutz von methionin in einer polypeptid-kette von irreversibler oxydation.Info
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Description
- Methionin wird in einer Polypeptidkette vor der irreversiblen Oxidation, bedingt durch oxidierende Medien, durch Alkylierung mit einem Alkylhalogenid und Bildung eines Sulfoniumsalzes, das gegenüber der weiteren Oxidation resistent ist, geschützt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Peptid-Chemiegebiet und insbesondere ein Verfahren zum Schutz einer reaktiven Aminosäure vor der irreversiblen Oxidation.
- Seit einigen Jahren besteht Interesse für die Herstellung von Pharmazeutika der Proteinart durch Genetic Engineering von Bakterienzellen Diese Pharmazeutika wurden in der Vergangenheit durch chemische Synthese hergestellt oder aus natürlichen Quellen mit relativ hohen Kosten extrahiert.
- Solche Polypeptide sind im allgemeinen in ihrer Größe groß, sie werden durch E. coli-Zellen direkt als vollständige Moleküle exprimiert, und sie unterscheiden sich von den natürlichen Molekülen, bedingt durch die Anwesenheit von Methionin an dem Aminoende.
- Alternativ können kleine Peptide in E. coli-Zellen exprimiert werden als Teil von Hybridproteinen, aus denen sie durch chemische oder enzymatische Reaktionen, die für eine gegebene Aminosäure oder Aminosäuresequenz spezifisch sind, abgetrennt werden.
- Itakura et al. (Science, 198, 1056, 1977) beschreiben die Expression von Somatostatin in E. coli als Hybridprotein mit β-Galactosidase. Somatostatin wird von dem Hybrid durch Spaltung mit Bromcyan (CNBr), das spezifisch den Methioninrest abspaltet, abgetrennt. Goeddel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106, 1979) beschreiben die Expression von humanen A- und B-Insulinketten in E. coli als Hybridproteine mit β-Galactosidase.
- In der schwebenden italienischen Patentanmeldung Nr. 47856A/85, die der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 199 018 entspricht, wird die Expression in E. coli des Wachstumshormon-Releasing-Factor-(GRF-)Peptids als Hybridprotein TrpE-GRF beschrieben.
- Zur Herstellung des GRF-Polypeptids wird das Hybridprotein einer Reihe chemischer Reaktionen unterworfen, nämlich der Spaltung des Hybrids an der Aminosäure Tryptophan durch Behandlung mit Iodosobenzoesäure, die das GRF-Fragment von der TrpE-Gruppierung abtrennt, wobei der Cysteinrest zuvor reduziert und Carboxyamido-methyliert worden ist. Bedauerlicherweise wird durch die Behandlung mit Iodosobenzoesäure die Thioethergruppe des Methionins in Stellung 27 zu dem Sulfon oxidiert. Das erhaltene GRF unterscheidet sich somit, obgleich es biologisch aktiv ist, von dem nativen GRF insoweit, daß seine Met27-Aminosäure zu dem Methionin-Sulfonderivat oxidiert ist.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, gemäß dem Methionin vor der irreversiblen Oxidation, die durch Iodosobenzoesäure oder andere Oxidationsmittel bewirkt wird, geschützt wird.
- Die Erfindung, obgleich sie unter besonderer Bezugnahme auf den Schutz von Methionin in der Stellung 27 des GRF-Peptids beschrieben wird, das gemäß der oben erwähnten italienischen Patentanmeldung erhalten wird, stellt ein Verfahren zur Verfügung, das bei einem ähnlichen Fall, bei dem ein solcher Schutz nützlich oder notwendig ist, verwendet werden kann.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet, wenn das Polypeptid von Interesse in Form eines fusionierten Hybridproteins gemäß einem Genetic Engineering-Verfahren erhalten wird, wie bei den oben beschriebenen Beispielen.
- Es wurde berichtet, daß Iodessigsäure und sein Amid spezifisch mit dem in Methionin vorhandenen Schwefelatom reagiert. Eine solche Reaktion wurde verwendet, um Methionin-enthaltende Peptide von einem Peptidgemisch, das durch tryptischen Abbau erhalten wurde, abzutrennen (Degen und Kyte, Anal. Biochem. 89, 529, 1978). Es ist weiterhin bekannt, daß Methyliodid mit dem Schwefelatom von Methionin reagiert, und diese Reaktion wurde zum Ersatz der Methylgruppe von Methionin mit einer radioaktiv markierten verwendet (Rothgeb et al., Biochemistry 16, 5813, 1977; Barling et al., Anal. Biochem. 144, 542, 1985).
- Jedoch finden sich in der Literatur keinerlei Hinweise für die Verwendung eines Alkylhalogenids zum Schutz von Methionin.
- Gegenstand der Erfindung ist eine Schutzreaktion, die nach dem folgenden Schema abläuft (worin X = I oder Br und R = H, COOH oder CONH&sub2;):
- Das so gebildete Sulfoniumsalz ist gegenüber der weiteren Oxidation resistent, und insbesondere ist es gegenüber der Oxidationswirkung von Iodosobenzoesäure beständig.
- Methionin kann regeneriert werden, wenn das Sulfoniumsalz mit einem Di- oder Polythiol der allgemeinen Formel: HS-(-M-)A-Y, worin
- "n" eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeutet;
- M eine -CH&sub2;- oder - H-Gruppe bedeutet;
- Y eine -OH- oder -SH-Gruppe bedeutet, umgesetzt wird.
- Typische Verbindungen innerhalb dieser allgemeinen Formel sind 2-Mercaptoethanol und 1,4-Dithiotreit.
- Das Schema für die Regenerationsreaktion ist wie folgt:
- Die genaue Beschreibung, die folgt, betrifft das spezifische Beispiel für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für den Schutz von Methionin, das in der Stellung 27 des GRF-Peptids vorhanden ist, exprimiert als Hybridprotein (TrpE-GRF).
- In einem spezifischen Beispiel wurde Iodacetamid als Alkylierungsmittel verwendet. Es ist jedoch offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung anderer Alkylhalogenide umfaßt, mit denen das Schwefelatom des Methionins alkyliert werden kann, wie beispielsweise Bromessigsäure, Iodessigsäure, ihre Ester und Salze, Bromacetamid, Alkylbromide und -iodide, wie Methylbromid, Ethylbromid und die entsprechende Iodide, usw.
- Die Erfindung betrifft weiterhin die Anwendung der Alkylierungsreaktion und die folgende Schutzgruppen-Abspaltungsreaktion in irgendeinem Fall, wo es nützlich oder erforderlich ist, auf reversible Art Methionin vor der irreversiblen Oxidation zu Methioninsulfon zu schützen.
- 5 mg Hybrid-TrpE-GRF44, erhalten wie in der schwebenden italienischen Patentanmeldung Nr. 47856A/85 beschrieben, die zuvor Carboxyamido-methyliert wurden, werden in 0,5 ml des folgenden Puffers gelöst: 4M Guanidin-HCl, gelöst in 30% Essigsäure. Zu der Lösung werden 277,5 mg (Sättigungsmenge) Iodacetamid gegeben, und dann wird das Gemisch in der Dunkelheit 2 Stunden bei 50ºC inkubiert. 1 ml Wasser wird dann zugegeben, und das Gemisch wird 2 Stunden bei 4ºC stehengelassen.
- Während dieser Inkubationszeit bildet sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 10.000 UpM gesammelt wird.
- Das Iodacetamid reagiert mit der Seitengruppe von Methionin, wobei das entsprechende S-Methylcarbamino-Sulfoniumsalz, wie in dem vorherigen Schema dargestellt, erhalten wird.
- 5 mg o-Iodosobenzoesäure (IBA) werden in 375 ul des folgenden Puffers gelöst: 4M Guanidin-HCl, gelöst in 80% Essigsäure. Zu dieser Lösung werden 7,5 ul p-Kresol gegeben, und der zuvor erhaltene Niederschlag, der das Hybridprotein TrpE-GRF44, geschützt an Methionin 27, enthält, wird darin gelöst. Nach 20stündiger Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur werden 750 ul Wasser zugegeben, und nach 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch während 5 Minuten bei 12.000 UpM zentrifugiert. In der wäßrigen Phase sind die Peptide vorhanden, unter ihnen GRF44.
- Die wäßrige Lösung, die wie oben beschrieben, erhalten worden ist, wird durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G25-Säule, 1·25 cm, equilibriert mit 5%iger Essigsäure, entsalzt. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt etwa 12 ml/Stunde. Das ausgeschlossene Material wird schnell mittels Verdampfung entwässert und in 500 ul 0,2M Hepes, pH 8,9, enthaltend 0,12M Mercaptoethanol, aufgenommen. Das entstehende Gemisch wird bei 37ºC während 24 Stunden inkubiert und dann mit Trifluoressigsäure (pH = 4) angesäuert. Der GRF44 wird anschließend mittels HPLC unter Verwendung einer C18-Säule, equilibriert mit 0,1% Trifluoressigsäure, gereinigt und mit 0,05% Trifluoressigsäure in Acetonitril eluiert. Eine Untersuchung der Aminosäuresequenz zeigt, daß die Reste des erhaltenen GRF44 identisch sind mit denen von natürlichem GRF44.
- 5 mg Hybrid-TrpE-GRF44-Protein, erhalten gemäß der italienischen Patentanmeldung Nr. 47856A/85, die zuvor Carboxyamido-methyliert wurden, werden in 0,5 ml des folgenden Puffers gelöst: 4M Guanidin-HCl, gelöst in 30% Essigsäure.
- Zu der Lösung werden 90 ul Methyliodid zugegeben, und das Gemisch wird in der Dunkelheit 18 Stunden bei 37º geschüttelt. 1 ml Wasser wird dann zugegeben, und das Gemisch wird 2 Stunden bei 4ºC stehengelassen.
- Während dieser Inkubationszeit bildet sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 10.000 UpM abgetrennt wird.
- Das Methyliodid reagiert mit der Seitengruppe von Methionin unter Bildung des entsprechenden S-Methylsulfoniumsalzes, wie es in dem vorhergehenden Schema dargestellt wurde.
- 5 mg o-Iodosobenzoesäure (IBA) werden in 375 ul des folgenden Puffers gelöst: 4M Guanidin-HCl, gelöst in 80%iger Essigsäure. Zu dieser Lösung werden 7,5 ul p-Kresol gegeben, und der zuvor erhaltene Niederschlag, der das Hybrid-TrpE-GRF44, geschützt an dem Methionin 27, enthält, wird darin gelöst. Nach 20stündiger Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur werden 750 ul Wasser zugegeben, und nach 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch während 5 Minuten bei 12.000 UpM zentrifugiert. In der wäßrigen Phase sind die Peptide vorhanden, unter ihnen GRF44.
- Die wäßrige Lösung, die zuvor erhalten worden ist, wird durch Gelfiltration entsalzt. Eine Sephadex-G25-Säule, 1·25 cm, equilibriert mit 5%iger Essigsäure, wird verwendet. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt etwa 12 ml/Stunde. Das ausgeschlossene Material wird schnell mittels Verdampfung entwässert und in 500 ul 0,2M N-Ethylmorpholin, pH 9, enthaltend 0,5M Dithiothreit, aufgenommen. Das Reaktionsgemisch für die Schutzgruppenabspaltung wird bei 37ºC während 24 Stunden inkubiert und dann mit Trifluoressigsäure (pH = 4) angesäuert.
- Das GRF44 wird anschließend durch HPLC unter Verwendung einer C18-Säule, equilibriert mit 0,1% Trifluoressigsäure, gereinigt und mit 0,05% Trifluoressigsäure in Acetonitril eluiert. Eine Untersuchung der Aminosäuresequenz zeigt, daß der GRF44, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, Reste aufweist, die identisch sind mit denen von natürlichem GRF44.
Claims (8)
1. Verfahren zur Abtrennung von einem
Methionin-enthaltenden Polypeptid aus einem Hybrid-Protein, das es enthält,
wobei das Methionin von der irreversiblen Oxidation
geschützt ist, dadurch gekennzeichnet, daß
das Hybrid-Protein mit einem Alkylhalogenid unter
Bildung eines Hybrid-Proteins, das ein
Methionin-Sulfoniumsalzenthaltendes Polypeptid enthält, umgesetzt wird;
das Methionin-Sulfoniumsalz-enthaltende Polypeptid von
dem Hybrid-Protein abgespalten wird; und
das Methionin-Sulfiniumsalz-enthaltende Polypeptid mit
einem Mono- oder Dithiol zur Gewinnung des
Methionin-enthaltenden Polypeptids umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Alkylhalogenid die Formel X-CH&sub2;-R
aufweist, worin X I oder Br und R H, CH&sub3;, COOH oder CONH&sub2;
bedeuten.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Mono- oder Dithiol die Formel
HS-(M)n-Y besitzt, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4, M
-CH&sub2;- oder -CH(OH)- und Y -OH oder SH bedeuten.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Methionin-enthaltene Polypeptid
GRF ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hybrid-Protein TrpE-GRF ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das GRF von dem Hybrid-Protein durch
Umsetzung mit Iodosobenzoesäure abgespalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Alkylhalogenid Iodacetamid oder
Methyliodid ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Mono- oder Dithiol
Mercaptoethanol oder 1,4-Dithiothreit ist.
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