FI94134C - Menetelmä metioniinia sisältävän polypeptidin erottamiseksi hybridiproteiinista - Google Patents

Description

j 94134

Menetelmä metioniinia sisältävän polypeptidin erottamiseksi hybridiproteiinista Förfarande för separation av en metioninhaltig polypeptid frän ett hybridprotein

Keksintö liittyy peptidikemian alaan ja erityisesti menetelmään reaktiokykyisen aminohapon suojaamiseksi irreversiibeliltä hapetukselta.

Useiden vuosien aikana on kehittynyt kiinnostus tuottaa geneettisesti manipuloitujen bakteerisolujen avulla proteiinin luonteisia farmaseuttisia tuotteita, joita aikaisemmin valmistettiin kemiallisen synteesin avulla tai uutettiin luonnollisista lähteistä suhteellisen kalliilla hinnalla.

Tällaisia, usein suurikokoisia polypeptidejä ilmennetään usein E. coli-soluissa suoraan matuureina molekyyleinä ja ne eroavat luonnollisista molekyyleistä, mikä johtuu metioniinin läsnäolosta aminopäässä.

Vaihtoehtoisesti pieniä peptidejä voidaan ilmentää E. coli-soluissa hybridiproteiinien osina, joista ne erotetaan tietylle aminohapolle tai aminohappojärjestykselle spesifisten kerni-I allisten tai entsymaattisten reaktioiden avulla.

Itakura et ai. (Science, 198, 1056, 1977) ilmoittivat somasto- statiinin ilmentämisestä E. colissa hybridiproteiinina beeta-galaktosidaasin kanssa. Somatostatiini erotetaan hybridistä pilkkomalla syanogenbromidilla (CDBr), joka spesifisesti jakaa metioniinitähteen. Goeddel et ai (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 106, 1979) ilmoittivat ihmisen A- ja B-insuliiniketjuj en ilmentämisestä E. colissa hybridiproteiineina beeta-galaktosi-daasin kanssa.

Vireillä oleva italialainen patenttihakemus 47856A/85 ilmoittaa kasvuhormonia vapauttavan tekijän (GRF) peptidin ilmentämisestä E. colissa hybridiproteiinina TrpE-GRF.

2 94134 GRF-polypeptidin saamiseksi tehdään hybridiproteiinille sarja kemiallisia reaktioita, jotka koostuvat hybridin pilkkomisesta aminohappo-tryptofäänin kohdalta käsittelemällä jodosobentsoe-hapolla, joka erottaa GRF-osan TrpE-puolikkaasta, kysteiini-tähteen ollessa aikaisemmin pelkistetty ja karboksiamidomety-loitu. Valitettavasti jodosobentsoehappokäsittely hapettaa metioniinin tioeetteriryhmän asemassa 27 sulfoniksi. Siten saatu GRF, vaikkakin se on biologisesti aktiivinen, eroaa luonnon GRF:stä siinä, että sen Met 27 aminohappo on hapettunut meti onii ni-s ui fonijohdannais eksi.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön menetelmä, joka kykenee suojelemaan metioniinia irreversiibeliltä hapettumiselta, jonka aiheuttaa jodosobentsoehappo tai muut hapettavat aineet. Keksintö määritellään tarkemmin oheisissa patenttivaatimuksissa.

Vaikkakin tämä keksintö on kuvattu koskien erityisesti GRF-pep-tidin, joka on saatu em. italialaisen patenttihakemuksen mukaisesti, asemassa 27 olevan metioniinin suojaamista, se tarjoaa käyttöön menetelmän, joka on käyttökelpoinen kaikissa samankaltaisissa tilanteissa, joissa tällainen suojaaminen on hyödyllistä tai välttämätöntä. Tämän keksinnön mukainen menetelmä on sopivin, kun kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi on tuotettu fuusioidun hybridiproteiinin muodossa yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, kuten em. esimerkeissä.

On ilmoitettu, että jodietikkahappo ja sen amidi reagoivat spesifisesti metioniinin rikkiatomin kanssa. Tällaista reaktiota on käytetty erottamaan metioniinia sisältäviä peptidejä peptidiseoksesta, joka on saatu trypsiinillä pilkkomalla (Degen ja Kyte, Anal. Biochem. 89, 529, 1978). Tiedetään myös, että metyylijodidi reagoi metioniinin rikkiatomin kanssa ja tätä reaktiota on käytetty korvattaessa metioniinin metyyli -ryhmä radioaktiiviseksi leimatulla metyylillä (Rothgeb et ai., 3 94134

Biochemistry 16, 5813, 1977; Barling et al., Anal. Biochem.

144, 542, 1985). Kuitenkaan aikaisemman tietämyksen mukaan ei mikään tuo mieleen ajatusta käyttää alkyylihalogenidia metio-niinin suojaamiseksi.

Tämän keksinnön mukainen suojaava reaktio tapahtuu seuraavan kaavan mukaisesti (jossa X =1 tai Br ja R = H, COOH tai CONH2): -NH-CH-CO- -NH-CH-CO-

I I

<j«2 <j% CH + X-CH - R---> CHo

12 2 I

1 A

CH3 CH3 CH2 - R

Näin muodostunut sulfoniumsuola on vastustuskykyinen myöhemmälle hapettumiselle ja erityisesti jodosobentsoehapon hapet-:· tavalle vaikutukselle.

Metioniini voidaan regeneroida, kun sulfoniumsuolan annetaan reagoida yleisen kaavan HS -fMfnY mukaisen di- tai polytiolin kanssa, missä "n" on kokonaisluku välillä 1 ja 4; _CH- M on -CH2 tai | -ryhmä;

OH

Y on -OH tai -SH-ryhmä. Tyypillisiä tämän yleisen kaavan mukaisia yhdisteitä ovat 2-merkaptoetanoli ja 1,4-ditiotreito- li.

!. Regeneraatioreaktion kaava on seuraava -NH-CH-CO- -NH-(jH-CO-

CH ch2 AM^TY

I 2 \ S

CH? + HS-4m-rY ----> CH2 + S

I I \

ä CH. - R

/ \ I

CH. CH, -R CH3 O b 4 94134

Seuraava yksityiskohtainen kuvaus koskee keksinnön mukaisen menetelmän erityistä sovellutusesimerkkiä, jossa GRF-peptidin, joka on expressoitu hybridiproteiinina (TrpE-GRF), asemassa 27 oleva metioniini suojataan.

Erityisessä esimerkissä on käytetty jodiasetamidia alkyloivana aineena. On kuitenkin ilmeistä, että keksintö sulkee sisäänsä myös muiden alkyylihalogenidien käytön, jotka kykenevät alky-loimaan metioniinin rikkiatomin, kuten esim. bromietikkahappo, jodietikkahappo, niiden esterit ja suolat, bromiasetamidi, alkyylibromidi ja jodidit, kuten metyylibromidi, etyylibromidi ja vastaavat jodidit jne.

Keksintö sisältää myös alkyylireaktion ja sitä seuraavan suojauksen poistamisreaktion sovellutuksen kaikissa tapauksissa, joissa se voi olla käyttökelpoinen tai tarpeellinen suojaamaan reversiibelillä tavalla metioniinia sen irreversiibeliltä hapettumiselta metioniinisulfoniksi.

Esimerkki 1

Metioniinin suojaaminen 5 mg hybridi TrpE-GRF44:ää, joka on saatu kuten vireillä olevassa italialaisessa patenttihakemuksessa 47856A/85 on kuvattu, ja joka on aikaisemmin karboksiamidometyloitu, liuotetaan 0,5 ml:aan seuraavaa puskuria: 4m guanidiini-HCl liuotettuna 30 % etikkahappoon. Liuokseen lisätään 277,5 mg (kyllästävä määrä) jodiasetamidia ja seosta inkuboidaan pimeässä 2 tuntia 50 °C:ssa. Sitten lisätään 1 ml vettä ja seoksen annetaan seisoa 2 tuntia 4 °C:ssa.

Tämän inkubaatioajan aikana muodostuu saostuma ja se kerätään sentrifugoimalla 10 min. 10 000 rpm. Jodiasetamidi reagoi metioniinin sivuryhmän kanssa muodostaen vastaavan S-metyyli-karbaminosulfoniumsuolan, kuten on osoitettu edeltävässä kaaviossa.

5 94134

Reaktio o-jodosobentsoehapon kanssa 5 mg o-jodosobentsoehappoa (IBA) liuotetaan 375 pl:aan seu-raava puskuria: 4M guanidiini-HCl liuotettuna 80 % etikkahap-poon. Tähän liuokseen lisätään 7,5 μΐ p-kresolia, ja aikaisemmin saatu saostuma, joka sisältää TrpE-GRF44 hybridipro-teiinia suojattuna metioniinin 27 asemassa liuotetaan siihen, 20 tunnin inkuboinnin jälkeen pimeässä ja huoneen lämpötilassa lisätään 750 μΐ vettä ja 10 min. kuluttua reaktioseos sentri-fugoidaan 5 min. 12 000 rpm. Peptidit, joiden joukossa on GRF44, ovat läsnä vesifaasissa.

GRF44:n puhdistus ja suojauksen poisto

Yllä kuvatulla tavalla saadusta vesiliuoksesta poistetaan suolat geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G25, 1 x 25 cm pylvästä, joka on tasapainotettu 5 % etikkahapolla.

Virtausnopeus on noin 12 ml/h. Pylvään läpi tullut materiaali kuivataan nopeasti haihduttamalla ja otetaan talteen lisäämäl-lä 500 μΐ Hepes 0,2m pH 8,9, joka sisältää 0,12m merkaptoeta-nolia. Syntynyttä seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 24 tuntia ja hapotetaan sitten tr ifluorietikkahapolla (pH=4).

GRF44 puhdistetaan myöhemmin HPLC:llä, käyttäen C18 pylvästä, joka on tasapainotettu 0,1 * trifluorietikkahapolla, ja eluoi-daan 0,05 % tr ifluorietikkahapon asetonitriililiuoksella.

Aminohappojärjestyksen tutkiminen osoittaa, että saadun GRF44:n aminohappotähteet ovat identtisiä luonnollisen GRF44:n kanssa.

Esimerkki 2

Metioniinin suojaaminen 1 mg TrpE-GRF44 hybridiproteiinia, joka on saatu kuten italialaisessa patenttihakemuksessa 47856A/85 on kuvattu, ja joka on aikaisemmin karboksiamidometyloitu, liuotetaan 0,5 ml:aan seuraavaa puskuria: 4m guanidiini-HCl liuotettuna 30 % etikka-happoon.

6 94134

Liuokseen lisätään 90 ui metyylijodidia ja seosta ravistellaan pimeässä 18 tuntia 37 °C:ssa. Sitten lisätään 1 ml vettä ja seoksen annetaan seistä 2 tuntia 4 °C:ssa. Tämän inkubaatio-ajan aikana muodostuu saostuma, joka kerätään sentrifugoimalla 10 min 10 000 rpm.

Metyylijodidi reagoi metioniinin sivuryhmän kanssa muodostaen vastaavan S-metyylisulfoniumsuolan, kuten on osoitettu aikaisemmassa kaaviossa.

Reaktio o-jodosobentsoehapon kanssa 5 mg o-jodosobentsoehappoa (IBA) liuotetaan 375 pl:aan seu-raava puskuria: 4M guanidiini-HCl liuotettuna 80 % etikkahap-poon. Tähän liuokseen lisätään 7,5 μΐ p-kresolia, ja aikaisemmin saatu saostuma, joka sisältää TrpE-GRF44 hybridipro-teiinia suojattuna metioniinin 27 asemassa, liuotetaan siihen.

20 tunnin inkuboinnin jälkeen pimeässä, huoneen lämpötilassa : lisätään 750 μΐ vettä ja 10 min. kuluttua reaktioseos sentri- fugoidaan 5 min. 12 000 rpm. Peptidit, joiden joukossa on GRF44, ovat läsnä vesifaasissa.

GRF44:n puhdistus ja suojauksen poisto

Aikaisemmin saadusta vesiliuoksesta poistetaan suolat geeli-suodatuksen avulla. Tässä käytetään Sephadex G25, 1 x 25 cm pylvästä, tasapainotettu 5 % etikkahapolla. Virtausnopeus on noin 12 ml/h. Läpivirrannut materiaali kuivataan nopeasti haihduttamalla ja otetaan talteen lisäämällä 500 μΐ 0,2M N-etyylimorfoliinia pH 9, joka sisältää 0,5M ditiotreitolia. Suojauksen poistamisreaktioseosta inkuboidaan 37 °C:ssa 24 tuntia ja hapotetaan sitten tr ifluorietikkahapolla (pH = 4).

GRF44 puhdistetaan sitten HPLC:llä, käyttäen C18 pylvästä, joka on tasapainotettu 0,1 % trifluorietikkahapolla, ja eluoi-daan tr ifluorietikkahapon 0,05 % asetonitriililiuoksella.

Il

Claims (8)

1. 94134
2. 1. Menetelmä metioniinia sisältävän polypeptidin erottamiseksi sitä sisältävästä hybridiproteiinista, jolloin metionii-ni suojataan irreversiibeliltä hapettumiselta, tunnettu siitä, että mainittu hybridiproteiini saatetaan reagoimaan alkyylihaloge-nidin kanssa siten, että muodostuu hybridiproteiini, joka sisältää metioniinisulfoniumsuolan sisältävää polypeptidia; metioniinisulfoniumsuolan sisältävä polypeptidi pilkotaan hybridiproteiinista; ja metioniinisulfoniumsuolan sisältävä polypeptidi saatetaan reagoimaan mono- tai ditiolin kanssa metioniinia sisältävän polypeptidin talteenottamiseksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkyylihalogenidin kaava on X-CHa-R, missä X on I tai Br ja R on H, CH3, COOH tai CONHa.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mono- tai ditiolin kaava on HS-(M)n-Y, missä n on kokonaisluku 1-4, M on -CHa- tai -CH(OH)-, ja Y on -OH tai -SH.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metioniinia sisältävä polypeptidi on GRF.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hybridiproteiini on TrpE-GRF. 1 Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GRF pilkotaan hybridiproteiinista saattamalla se reagoimaan jodosobentsoehapon kanssa. 94134
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkyylihalogenidi on jodiasetamidi tai metyyli-jodidi.
8. 8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mono- tai ditioli on merkaptoetanoli tai 1,4-ditiotreitoli.