DE2524320C2

DE2524320C2 - Cephalosporansäureverbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2524320C2
Application number: DE2524320A
Authority: DE
Inventors: Daniel Franconville Bouzard; Abraham Paris Weber
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1974-06-05
Filing date: 1975-06-02
Publication date: 1985-01-24
Also published as: SE7506294L; HU173040B; SE434840B; AT339480B; HU172448B; FR2296639A1; ES438179A1; YU45103B; IE43052L; FR2296639B1; JPS6219160B2; ES454964A1; YU199881A; SE7803860L; DK155943C; CA1051799A; BE828686A; IE43052B1; DK155943B; DK559588A

Description

COOH H

worin

R für ein Wasseirstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht,

15 und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.

2. 7-D-(-säure.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daS man in an sich nekannter Weise eine Verindung der allgemeinen Formel II

CH- C—NH-, / \

NH, ^ "" * J—^ΟΗϊ—^S~n^ ^N ®

oder einen Siiylester oder ein Salz davon, worin Y der l,2,3-Triazol-5-ylthiorest ist oder für Acetoxy steht, mit einem entsprechenden D-(-)-acylierenden Mittel einer Säure der allgemeinen Formel III JO

(DI)

worin R die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt und B eine übliche Amino-Schutzgruppe darstellt, umsetzt und die Amino-Schutzgruppe entfernt, und, wenn Y für Acetoxy steht, die genannte Verbindung in die entsprechende Verbindung überführt, in der Y die Bedeutung l,2,3-Triazol-5-ylthio besitzt und gewünschtenfalls, entweder vor oder nach dem Entfernen von B das Produkt in Form der freien Säure oder eines Silylesters oder eines Salzes davon nach an sich bekannten Methoden in die entsprechende freie Säure oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon überführt.

4. Pharmazeutisches Mittel, das als aktiven Bestandteil eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmitteln, enthält.

Die Erfindung betrifft 7-D-(-)-ff-Amino-er-(p-acyloxyphenylacetamido)-cephalosporansäur'ⁱ.verbindungen, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es sind bereits verschiedene Cephalosporine bekannt, die in 7-SteHung einen p-hydroxysubstituierten Phenylglycinrest aufweisen, siehe die DE-OSen 17 95 292, 20 18 600, 2? 16 866 und 23 16 867.

Jedoch sind keine Cephalosporine bekannt, bei denen die p-Hydroxygruppe verestert ist und die oral verabreicht werden können.

Gegenstand der Erfindung sind 7-D-(-)-e-(p-acyloxyphenylacetamido)-cephalosporansäureverbindungen der allgemeinen Formel I

60 R —C —<

^N=/ ' ' -N J-CH₂-S^f N

NH

O I ^χν,/

COOH H

65 worin

R für ein WasserstofTatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.

7-D-(-)-ir-Amino-a-(p-acetoxyphenylacetamido)-3-[l^,3-triazol-5-yl)-thiomethyl]-3-cephem-4-carbonsäure ist bevorzugt

Zu den oben erwähnten pharmazeutisch verträglichen Salzen gehören die nicht-toxischen Carbonsäuresalze, beispielsweise nicht-toxischs Metallsalze, wie das Natrium-, Kalium-, Calcium- und Aluminium-, das Ammoniumsalz und Salze mit nicht-toxischen Aminen, beispielsweise Trialkylaminen, Procain, Dibenzyl- s aminen, N-Benzyi^phenäthylamin, 1-Ephenamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, N-Alkylpiperidin und andere Amine, die zur Bildung von Salzen von Penicillinen und Cenhalosporinen verwendet werden. Von der Definition pharmazeutisch verträglicher Salze sind auch die nicht-toxischen Säureadditionssalze (Aminsalze) eingeschlossen, beispielsweise Salze mit Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Maleinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure, Fumarsäure, Mandelsäure, Ascorbinsäure und Äpfelsäure.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel Π

H₃N

-N J-CH₂-Y GD

θ" J

COOH

oder einen Silylester oder ein Salz davon, worin Y der l,2,3-Triazol-5-ylthiorest ist oder für Acetoxy steht, mit einem entsprechenden D-(-)-acylierenden Mittel einer Säure der allgemeinen Formel III

Il j^

R—C —O—^ y— CH-COOH (ΠΙ)

I

NHB

worin R die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt und B eine übliche Amino-Schutzgruppe darstellt, umsetzt und die Ämiß -Schutzgruppe entfernt, und, wenn Y für Acetoxy steht, die genannte Verbindung in die entsprechende Verbindung überführt, in der Y die Bedeutung U,3-Triazol-5-ylthio besitzt und gewünschtenfalls, entweder vor oder nach dem Entfernen von B das Produkt in Form der freien Säure oder einss Silylesters oder eines Salzes davon nach an sich bekannten Methoden in die entsprechende freie Saure oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon überführt.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Cephalosporinverbindungen wird eine entsprechende 7-Aminocephalosporansäureverbindung der Formel II oder ein Salz davon nach bekannten Methoden mit dem ent- sprechenden D-(->Acylierungsmittel der Formel IK acyliert.

Im Falle des Ui 3-Stellung thiolierten 7-Aminocephalosporansäure-Zwischenprodukts der Formel II kann wenn Y für U,3-TriazoI-5-y!-thio steht, das genannte Zwischenprodukt hergestellt werden, indem man die 3-Acetoxygruppe der 7-Aminocephalosporansäure oder eines Salzes davon mit dem entsprechenden heterocyclischen Thiol oder einem Salz davon verdrängt. Die Verdrängung einer Estergruppe durch eine Thiolgruppe ist eine bekannte Reaktion und wird zweckmäßigerweise in wäßriger Lösung unter Erhitzen durchgeführt.

Das Zwischenprodukt der Formel II kann gewünschtenfalls vor der Acylierungsreaktion in einen Silylester oder ein Säureadditionssalz davon überfuhrt werden. Die Silylester können nach den in der Literatur beschriebenen Methoden, beispielsweise gemäß der US-Patenächrift 32 49 622, hergestellt werden. Die Silylestergruppe kann im Anschluß an die Acylierungsreaktion durch Hydrolyse entfernt werden.

Vor der Acylierungsreaktion kann die Aminogruppe des Acylierungsmittels der Formel III durch eine gebräuchliche Amino-Schutzgruppe B geschützt sein, die am Ende der Reaktion durch an sich bekannte Methoden leicht entfernt werden kann. Zu Beispielen geeigneter Amino-Schutzgruppen gehören tert.-Butoxycarbonyl, Carbobenzyloxy, 2-Hydroxy-l-naphthcarbonyI, Trichloräthoxycarbonyl, 2-Äthoxycarbonyl-lnwthylvinyl und 2-Meihoxycarbonyl-l-methylvinv!. Eine besonders wertvolle Blockierungsgruppe ist ein Proton, wie in der Verbindung der Formel:

R—C —0—f ^CH-COCl

NHj HCl

Es kann beispielsweise nach der acylierenden Kupplungsreaktion durch Neutralisation leicht entfernt werden. Auch andere funktionell äquivalente Amino-Schutzgruppen können verwendet werden

Die Acylierung einer 7-Aminogruppe einss Cephalosporins ist eine bekannte Reaktion. Es kann irgendeines der funktioneilen Äquivalente der Formel III, die üblicherweise als Acylierungsmittel für primäre Aminogruppen verwendet werden, eingesetzt werden. Zu Beispielen geeigneter acylierender Derivate der freien

Säure gehören die entsprechenden Saureanhydride, gemischten Anhydride, beispielsweise Alkoxyameisensäureanhydride, Säurehalogenide, Siureazide, aktive Ester und aktive Thioester. Die freie Säure kann mit Verbindung Π gekuppelt werden, nachdem man zuerst die genannte freie Säure mit Ν,Ν'-Dimethylchlorformiminiumchlorid oder unter Verwendung von Enzymen oder eines Ν,Ν'-Carbonyldiimidazols oder eines N₉N'-s Carbonylditriazols oder eines Carbodiimidreagenzes, beispielsweise N^-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Cyclohexylcarbodiimid oder N-Cyclohexyl-N'-il-morpholinoäthylJcarbodiimid oder eines Alkylylamiiireagenzes oder eines Isoxazoliumsalzreagenzes, gekuppelt hat. Ein weiteres Äquivalent der freien Säure ist pin entsprechendes Azolid, d. h. ein Amid der entsprechenden Säure, deren Amidstickstoffglied eines quasi-aromatischen 5-gliedrigen Rings ist, der mindestens 2 Stickstoffatome enthält, d. h. Imidazol, Pyrazol, die Triazole, Benzimidazol, Benzotriazol und deren substituierte Derivate. Ein reaktives Derivat der Phenylglycinsäure der Formel ΙΠ ist das N-Carboxyanhydrid (Leuchs'sches Anhydrid). In dieser Struktur dient die Gruppe, die die Carboxylgruppe aktiviert, auch dazu, die Aminogruppe zu schützen. Ein besonders bevorzugtes Acylierungsmittel ist das Säurechlorid-Hydrochlorid der Formel

f \—CH-COCl

NH₂ · HCl

bei der die Carboxylfunktion aktiviert und die Aminogruppe geschützt ist. üben wurde t-jschrieben, daß Enzyme eingesetzt werden können, um die freie Säure, deren Aminogruppe geschützt ist, mit der Verbindung II zu kuppeln. Dabei können auch Ester, beispielsweise der Methylester, dieser freien Säure mit den Enzymen

eingesetzt werden, welche von verschiedenen Mikroorganismen produziert werden, beispielsweise den von T. Takahasi et al., J. Amer. Chem. Soc., 94 (11), 4035 bis ^037 (1972) und von T. Nara et al., J. Antibiotic (Japan), 24(5), 321 bis 323 (1971) und in der deutschen Patentanmeldung P 22 16 113, beschriebenen.

Die besonderen Verfahrensbedingungen, beispielsweise Temperatur, Lösungsmittel und Reaktionszeit, die für die Kupplungsreaktion gewählt werden, werden durch die Art der angewendeten Acylierungsmethode bestimmt und sind dem Fachmann bekannt. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, ein organisches tertiäres Amin, tielspleTsweise Triäthylamin, N^I-Dimethylanilin, Äthylpiperidin, 2,6-Luiidin oder Chinolin, zuzusetzen, um als Protonenakzeptor oder salzbildendes Mittel .'U dienen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach einem der üblicherweise zur Isolierung ähnlicher Cephalosporine eingesetzten Verfahren isoliert werden. So kann das Produkt als neutrales Molekül erhalten werden. Im Falle von Verbindungen der Formel I, werden diese besser als Zwitterion dargestellt; sie können aber auch als Salz isoliert werden. Die Bildung des gewünschten pharmazeutisch verträglichen Carbonsäureoder Säureadditionssalzes wird nach bekannten Methoden, beispielsweise Reaktion der Säure mit einer entsprechenden Base oder Säure, durchgeführt.
Am Ende der Acylierungsreaktion kann das erhaltene Produkt (entweder vor oder nach dem Entfernen der Amino-Schutzgruppe) durch an sich bekannte Methoden in ein anderes gewünschtes Produkt der Formel I überführt werden. So kann beispielsweise das Produkt der Formel I in Form eines Silylesters oder eines Salzes davon in das freie Säureprodukt oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon durch Entfernen der SiIyI-estergruppe, beispielsweise durch Hydrolyse, überfuhrt werden.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutisch aktiven Verbindungen sind wirksame antibakterielle Mittel, die bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen bei Geflügel und Tieren, einschließlich des Menrchen, die durch viele gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht werden, brauchbar sind. Die aktiven Verbindungen sind auch als Beifuttermittel bei Tierfutter und als Mittel zur Behandlung von Mastitis bei Rindern brauchbar. Es wurde überraschend gefunden, daß die bevorzugten Verbindungen bei oraler Verabreichung wirksam absorbiert werden.

Gegenstand der Erfindung sind somit auch pharmazeutische Mittel, die zusätzlich zum Wirkstoff einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten können. Die Verbindungen können sowohl oral als auch parenteral verabreicht werden. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, wie Kapseln, Tabletten oder Emulsionen, vorliegen. Bei der Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen können die erfindungsgemäßen Verbindungen parenteral in einer Menge von ungefähr 5 bis 200 mg/fcg/Tag in aufgeteilten Dosen, beispielsweise drei- bis viermal täglich, verabreicht werden. Sie werden in Dosiseinheiten verabreicht, die beispielsweise 125, 250 oder 500 mg Wirkstoff zusammen mit geeigneten physiologisch verträglichen Trägern oder Bindemitteln enthalten.

Nachstehend wird die Herstellung der Ausgangsmaterialien, die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden, näher erläutert.

Ausgangsmaterialien
l,2,3-Triazol-5-thioI

kann nach dem von G. Goerdler und G. Gnad in Chem. Ber. 99, 1618 Π966) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Herstellung dieser Verbindung verläuft über das 5-Amino-l,2,3-thiadiazol. Letztere Verbindung kann aur.h nach dem von D. L. Pain und R. Slack in J. Chem. Soc. 5166 (1965) beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Kalium-l,2,3-triazol-5-thiolat

Zu einer Lösung von 2,84 g (28,1 mMol) des obigen Thiols in 28 ml absolutem Äthanol gibt man 14,5 ml einer l,93n alkoholischen Kaliumhydroxydlösung. Damn wird die Lösung mit wasserfreiem Äther verdünnt, bis die Kristallisation des Salzes beendet ist. Den Feststoff sammelt man durch Filtrieren, wäscht mit Äther i und trocknet im Vakuum. Die 3,65 g (93%) des auf diese Weise erhaltenen Salzes besitzen einen Schmelzpunkt von 225°C und Zersetzung.

Synthese von 7-Amino-3-( 1 ^,S-triazol-S-ylthiomethylJO-cephem^-carbonsäure

Die Reaktionen werden unter einer Stickstoffatmosphäre in einem ReaktionsgefäB durchgeführt, das vor Licht geschützt ist. Das Wasser und der Phosphatpuffer werden vor der Verwendung heftig mit Stickstoff begast, um den Sauerstoff zu verdrängen.

10,3 g (0,102 Mol) 5-Amino-l,2,3-thiadiazol werden zu einer Lösung von 8,16 g Natriumhydroxyd in 100 ml Wasser zugegeben. Die Mischung wird schnell zum Rückfluß erhitzt und anschließend 10 Minuten am Rück- IS fluß gehalten, um das 5-Amino-l,2,3-thiadiazol in das 5-Mercapto-l,2,3-triazol umzulagern. Zur Reaktionsmischung, die das 5-Mercapto-l,2,3-triazol enthält und in einem Eisbad gekühlt ist, gibt man 1100 ml eiskalten 0,1 m pH 6,4 Phosphatpuffer. Die Lösung, die einen pH von 10,5 aufweist, wird mit 42%iger Phosphorsäure auf pH 8,5 eingestellt. Man gibt 21,8 g (0,08 Mol) 7-Aminocephalosporansäure zu und erhitzt die Mischung 4 Stunden auf 50⁰C. Die klare Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und mit konz. HCl auf pH 4,5 eingestellt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute 16,2 g.

15,2 g des rohen Produkts werden mit 600 ml Methanol und 40 ml konz. HCI in Lösung gebracht. Nach Behandlung mit Kohle wird die Lösung mit 1,5 Liter Eiswasser verdünnt und einmal mit Äthylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wird bei vermindertem Druck konzentriert, um Methanol zu entfernen. Das kalte wäßrige Konzentrat wird mit 20%igem Natriumhydroxyd langsam auf pH 4,0 eingestellt, wodurch Kristallisation des Produkts bewirkt wird. Das Produkt wird abnitriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute 11,4 g. Die IR- und NMR-Spektren stehen in vollem Einklang mit dem gewünschten Produkt.

Analyse C₁₀HnN₅O₃S₂:

berechnet: C 38,42; H 345; N 22,40

gefunden: C 38,27, 38,26; H 3,76, 3,40; N 21,02, 21,00; H₂O 1,70.

Reinigung von 7-Amino-3-(l,2,3-triazol-5-ylthiornethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (II)

ϊό,ΐ g rohe 7-Anninö-3-{i,2,3-ifiäZüi-5-yiiniömcihyi)-3-Ccpncfn-4-carbonsäurc, die angenähert 20 Moi-yi 7-Aminocephalosporansäure als Verunreinigung enthält, wird mit 600 ml Methanol und 40 ml konz. HCl in Lösung gebracht. Nach Behandlung mit Aktivkohle wird die Lösung mit 1,5 Liter Eiswasser verdünnt und einmal mit Äthylaoetat extrahiert. Die wäßrige Phase wird bei vermindertem Druck konzentriert, um Methanol zu entfernen. Das kalte wäßrige Konzentrat stellt man dann langsam mit 20%igem Natriumhydroxyd auf pH 4,0 ein, wodurch die Kristallisation des Produkts bewirkt wird. Das Produkt wird abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 11,4 g. Das NMR-Spektrum zeigt an, daß dieses Produkt ungefähr 7 Mol-% 7-Aminocephalosporansäure als Verunreinigung enthält. .

Das obige Reinigungsverfahren wird bei 11,4 g des Produkts unter Verwendung von 425 ml Methanol, 28 ml konz. HCl und 1 Liter Eiswasser wiederholt, wobei man 8,0 g Produkt erhält. Das NMR-Spektrum steht mit dem gewünschten Produkt in völligem Einklang und zeigt keine Spur von 7-Aminocephalosporansäure als Verunreinigung an.

50 Analyse Ci₀H₁₅N₅O₃S₂:

berechnet: C 38,42; H 3,55; N 22,40

gefunden: C 39,(16, 38,53; H 3,56, 3,51; N 22,05, 21,60; H₂O 1,78.

7-Amino-3-(l,2,3-triazol-5-yIthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (H)

10 g (0,075 Mol) 5-Marcapto-l^,3-triazol-Kaliumsalz werden zu einer gerührten Aufschlämmung von 19 g

(0,07 Mol) gereinigter 7-Aminocephalosporansäure und 5,9 g (0,07 Mol) NaHCO₃ in 350 ml 0,1m Phosphat- f

puffer (pH 6,4) zugegeben, und die Mischung wird 3V₂ Stunden erhitzt und bei 55°C unter einer Stickstoff- i

atmosphäre gerührt. Die erhaltene Lösung wird auf 22°C gekühlt und mit 40%iger H₃PO₄ auf pH 54 einge- 60 I

stellt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit 50 ml kaltem Wasser gewaschen und an der Luft getrok- §

knet. Die Ausbeute an 7-Amino-3-(lr2,3-triazol-5-yIthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure beträgt 8 g; Zer- |

setzungspunkt 230⁰C. Die IR-Analyse zeigt etwas Zersetzung des^-Lactamrings, jedoch wird das Produkt so wie |

es ist für die nächste Stufe verwendet. |

Analyse C₁₀H₁₁N₅Ci₃S₂: " |

berechnet: C 38,39; H 3,54 I

gefunden: C 38,36; H 3.78. i

7-Amino-3-(l,2,3-triazol-5-yithiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (II)

272 g (1,0MoI) 7-Aminocephalosporansäure werden in 3000 ml 0,1m Phosphatpuffer von pH 6,4 und 150 ml Methylisobutylketon suspendiert, gefolgt von 84 g (1,0MoI) Natriumbicarbonat (beachte: das Natriumbicarbonat wird in Portionen zugegeben). Dann gibt man 143 g (1,0MoI) 5-Mercapto-l(H)-1.2.3-triazol-Kaiiumsalz zu und rührt die Mischung unter einer Stickstoffatmosphäre 4 Stunden bei 55°C± 1°C. Nach einer Stunde wird der pH durch Zugabe einer kleinen Menge 40%iger H₃PO₄ wieder auf 6,4 eingestellt. Am Ende der 4-stündigen Erhitzungszeit gibt man 50 g entfärbende Aktivkohle zu und filtriert nach 15-minütigem Rühren bei 55⁰C die Aufschlämmung heiß durch ein Bett aus Diatomeenerde. Das Bett wird mit drei- mal 100 ml Wasser gewaschen. Der pH der vereinigten Filtrate wird noch in der Hitze durch langsame Zugabe von 6n HCl auf 4,5 eingestellt. Nach 30-minütigem Kühlen bei 0⁰C wird das rohe Produkt abfiltriert, mit zweimal 200 ml kaltem Wasser, gefolgt von zweimal 1000 ml Methanol, gewaschen und an der Luft getrocknet. Das rohe Produkt wird in 3000 ml 50% Methanol/Wasser suspendiert, und 300 g (1,5 Mol) p-Toluolsulfon säure werden zugesetzt. Man rührt die Mischung 15 Minuten und gibt dann 50 g entfärbende Aktivkohle zu. Nach 15-minütigem Rühren bei 22⁰C wird die Aufschlämmung durch ein Diatcmeenerde-Bett filtriert, und das Bett wird mit zweimal 100 ml 50% Methanol/Wasser gewaschen. Der pH der vereinigten Filtrate wird durch Zugabe von angenähert 210 ml Triäthylamin auf 4,0 eingestellt. Nach 1-stündigem Kühlen auf O⁰C wird das Produkt durch Filtrieren gesammelt, mit zweimal 400 ml 50% Methanol/Wasser und anschließend zweimal iOOO mi Methanol gewaschen und an der Luft getrocknet.

Dieses Material wird in 2000 ml Wasser suspendiert, und 84 g (1 Mol) Natriumbicarbonat werden zugesetzt. Nach 10-minütigem Rühren bei 22⁰C gibt man 50 g Aktivkohle zu und filtriert nach 15-minütigem Rühren bei 22°C die Aufschlämmung durch ein Diatomeenerde-Bett. Das Produkt wird mit zweimal 100 ml Wasser gewaschen, und der pH der vereinigten Filtrate wird durch langsame Zugabe von 6n HCl auf 3,5 eingestellt.

Nach 10-minütigem Rühren bei 22⁰C wird die Mischung 1 Stunde auf 0⁰C gekühlt. Das Produkt wird durch Filtrieren gesammelt, mit zweimal 200 ml kaltem Wasser und zweimal 1000 ml Aceton gewaschen.

Nach der Trocknung über P₂O₅ in einem Vakuumexsiccator während 14 Stunden bei Raumtemperatur beträgt die Ausbeute 100 g. Zersetzungspunkt 23O⁰C. Das IR und NMR stehen in Einklang mit der gewünschten Struktur.

Herstellung von D-(-)-2-Amino-2-(4-acetoxyphenyl)essigsäure Methode A (in Essigsäure als Lösungsmittel)

203,5 g (1 Mol) D-(-)-p-Hydroxyphenylglycinchlorid, 800 ml Essigsäure und 314 g (4 Mol) Acetylchlorid werden bei Raumtemperatur 48 Stunden gerührt. Der Feststoff wird gesammelt, dreimal mit Aceton (dreimal 250 ml) und zweimal mit Äthanol (zweimal 250 ml) gewaschen und bei 4O⁰C getrocknet. Die Ausbeute beträgt 210 g (85,4%). Dieses Hydföchiorid wird in 3,0 Liter Wasser geiöst, die Lösung wird auf+5 bis itrC gekühlt und der pH wird mit 20% NH₄OH auf 4,5 eingestellt. Man rührt die Suspension 1 Stunde bei 5°C

und sammelt den Feststoff, wäscht zweimal mit Wasser und zweimal mit Aceton und trocknet bei 40⁰C. Die Ausbeute beträgt 133 g (64% aus D-(-)-p-Hydroxyphenylglycin). aD (1% HCl n/10) = -104,5.

Methode B (in Methylenchlorid)

4.07 g (0,02 Mol) D-(-)-p-Hydroxyphenylglycin-hydrochlorid, 30 ml Methylenchlorid und 6,28 g (0,08 Mol) Acetylchlorid werden 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man sammelt den Feststoff, wäscht zweimal mit Aceton und zweimal mit Äthanol. Die Ausbeute beträgt 4,17 g (84,5%).

Analyse: Cl = 14,8% (berechnet 14,4%). 50

Methode C (in Trifluoressigsäure)

i,67 g (0,01 Mol) D-(-)-p.Hydroxyphenylglycin werden unter Rühren zu 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur zugegeben. Nach dem Auflösen werden 1,57 g (0,02 Mol) Acetylchlorid zugesetzt. Nach einer leicht exothermen Reaktion tritt ein Feststoff auf. Die Suspension wird IV₂ Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und die Trifluoressigsäure wird im Vakuum entfernt. Der verbleibende Feststoff wird gesammelt, mit Methylenchlorid und mit Äthanol gewaschen. Die D-(-)-2-Amino-2-(4-acetoxyphenyl)essigsäure ist mit der nach den Methoden A oder B hergestellten identisch. Ausbeute: 1,9 g (75%).

« Herstellung von D-(-)-2-Amino-2-2(4-pivalyloxyphenyl)essigsäure-hydrochlorid

1,67 g (0,01 Mol D-(->p-Hydroxyphenylglycin werden zu 10 ml Trifluoressigsäure zugegeben, gefolgt von 2,4 g (0,02 Mol) Pivalylchlorid. Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der Feststoff wird gesammelt und mit Äther gewaschen. Ausbeute: 2,56 g (89%).

Dieses Hydrocnlond wird aus Isopropanol umkristaiiisiert. Analyse: Cl = 11,8% (berechnet 12,3%). UV λ max. 205 nm und 220 nm.

Herstellung von D-(-)-2-Amino-2-(4-acetoxyphenyl)acety' -hlorid-hydrochlorid

83,6 g (0,40 Mol) D-(-)-2-Amino-2-(4-acetoxyphenyl)essigsäure und 1,25 Liter wasserfreies Methyienchlorid werden unter Rühren auf -5⁰C gekühlt. Dann gibt man 152 g Phosphorpentachlorid langsam zu, gefolgt von 4 ml Dimethylformamid. Die Mischung wird 4 Stunden bei 0⁰C gerührt. Man sammelt den Feststoff, wäscht mit wasserfreiem Mcthylenchlorid und trocknet im Vakuum bei Raumlemperatur. Ausbeute: 61 g (57,5%).

Analyse: gtsamtes Chlor = 27,2% (Theorie 26,9%).

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben. 7-AminoesphaIosporansäure ist als 7-ACA abgekürzt.

Beispiel 1

7-[D-(-)-2-Amino-2-(4-acetoxyphenylacetamido)]-3-[(l,2,3-triazol-5-yl)-thiomethyl]-3-cephem-4-carbonsäure

RN 1396 "

62,6 g (0,2 Mol) 7-Amino-3-[(l,2,3-triazol-5-yl)-thiomethyl]-3-cephem-4-carbonsäure (7-TACA), 1,5 Liter Methylenchlorid und 60,2 g (0,374 Mol) Hexamethyldisilazan werden gerührt und 20 Stunden unter einem leichten Stickstoffdruck am Rückfluß gehalten (nach ungefähr 2 Stunden ist die gesamte 7-TACA in Lösung gegangen). Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt, und 30,4 ml Dimethylanilin werden zugegeben, gefolgt von 20,4 ml einer Lösung von Dimethylanilin-hydrochlorid in Methylenchlorid (30%), und 1,35 g Imidazol werden zugesetzt.

Dann werden 60,5 g (0,229 Mol) 2-Amino-2-(4-acetoxyphenyl)-acetylchIorid-hydrochlorid in kleinen Anteilen (ungefähr 1V₂ Stunden) bei 0⁰C zugesetzt. Die Mischung wird dann 3 Stunden bei 2O⁰C gerührt und über Nacht bei +5⁰C stehengelassen. Man gibt 25 ml Methanol, gefolgt von 750 ml Wasser zu. Der pH wird mit Triäthylamin auf 2,3 bis 2,5 eingestellt, und die Mischung wird durch ein Diatomeenerde-Bett filtriert. Die wäßrige Phase wird abgetrennt, zweimal mit Methy'enchlorid gewaschen und mit Aktivkohle behandelt. Die Lösung wird auf pH 4,3 eingestellt und 2 Stunden bei +5⁰C gerührt. Der Feststoff wird gesammelt, zweimal mit Wasser gewaschen und bei 40⁰C getrocknet. Ausbeute: 53 g (ungefähr 50%).

Dieses rohe Material wird zweimal wie folgt gereinigt:

Der Feststoff wird mit 8 Volumina 0,5n Chlorwasserstoffsäure behandelt, und die Suspension wird mit Aktivkohle entfernt. Ein gleiches Volumen an Methanol wird zur Lösung zugegeben, und der pH wird auf 2 bis 2,1 eingestellt; nach 15 Minuten wird eine kleine Menge suspendierter Feststoff gesammelt und verworfen. Das Filtrat wird auf pH 4 eingestellt. Der ausgefällte Feststoff wird gesammelt, mit MeOH/H₂O (50/50) und reinem Methaol gewaschen. Ausbeute: 25 g (nach zwei Reinigungen).

IR: in Übereinstimmung mit der zugeordneten Struktur.

Feuchtigkeit (KF): 5,i%.

Chemische Untersuchung:

Jodometrische Untersuchung: 885 y/mg.

Potentiometrische Aminuntersuchung: 97%.

Biologische Daten

Tabelle I zeigt vergleichende MIC-Daten für die oben hergestellte 7-[D-(-)-2-Amino-2-(4-acetoxyphenylacetamido^a-KU^-triazol^-yO-thiomethylj-S-cephem^-carbonsaure, RN-1396, und ihr p-Hydroxyanaloges, BL-S640. Die minimalen Hemmkonzentrationen wurden nach der zweifachen Brühenverdünnungsmethode unter Verwendung äquimolarer Konzentrationen jeder Verbindung bestimmt.

Tabelle I	A 9585	BL-S 640	p-Acetoxy-
MIC (,ug/ml)	A 9604		BL-S 640
Nährbrühe	A 9537		Hydrat
	A 9537		RN 1396
	A 9606	0,04	0,04
Organismen	A 9606	0,04	0,04
D. pneumonäae) (10-3)*)	A 15097	0,3	0,16
Str. pyogenes) (10-3)·)	A 9531	1	1
S. aursus Smith (10-4)		0,6	0,6
S. aureus + 50% Serum (10-4)		1	4
S. aureus BX1633 (10-3)	4	8
S. aureus BX1633 (10-2)	0.6	0.3
S. aureus Meth-Res (10-3)
SaI. enteritidis (10-4)

Fortsetzung

Nährbrühe Organismen

E. coli Juhl (10-4) E. coli (10-4) K. pneumoniae (10-4) JC pneumoniae (10-4) Pr. mirabilis (10-4) Pr. morganii (10-4) Ps. aeruginosa (10-4) Ser. marcescens (10-4) Ent. cloacae (10-4) Ent. cloacae (10-4) Ent. cloacae (10-4)

·) 45% AAB + 5% Serum + 50% NB.
'*) Verdünnung der Über-Nacht-Brühenkultur.

Vergleichsversuche
Die nachstehend aufgeführten Verbindungen der Formeln (1) und (2)

	BL-S 640	p-Acetoxy BL-S 640 Hydrat RN 1396
A15119	0,5	2
A 9675	4	8
A 9977	0,5	1
A 15130	1	2
A 9900	0,5	0,5
A 15153	63	63
A 9843 A	125	125
A20019	125	125
A 9656	125	125
A 0ÄS7	0,5	1
A 9659	32	32

COOH

HjC- C — O—<f V-CH-C —NH

wurden mit Verbindungen des Standes der Technik, nämlich Cefetrizin und Cefalexin verglichen.

1. Minimale Hemmkonzentrationen

Die minimalen Hemmkonzentrationen für die oben erwähnten Verbindungen gegenüber mehreren Mikroorganismen sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt.

Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Cefalexin überlegen und mit Cefatrizin vergleichbar sind.

Tabelle II

Organismen	A 9585	Verbin	MHK-Werte	(mcg/ml)	Verbin	MHK-Werte	(mcg/ml)
	A 9604	dung (1)			dung (2)
	A 9537		Cefatrizin	Cefalexin		Cefatrizin	Cefalexin
Diplococcus pneumoniae	A 9606	0,25	0,13	0,25	0,03	0,03	0,13
Streptococcus pyogenes	A 9606	0,03	0,03	0,13	0,03	0,03	0,13
Staphylococcus aureus	A15097	1	0,5	0,5	0,25	0,5	0,13
Staph aureus AT lOE-3 DIL	2	1	2	1	1	1
Staph aureus AT 10E-2DIL	16	8	8	4	2	4
St aur meth-resioe-3 DIL	16	16	32	4	4	32

Fortsetzung

Organismen	A 9531	Verbin	MHK-Werte	(mcg/uil)	Verbin	MHK-Werte (mcg/ml)	Cefalexin
	A15119	dung (1)			dung (2)		2
	A 9675		Cefatrizin	Cefalexin		Cefatrizin	8
Salmonella enteritidis	A 9977	1	04	2	04	04	16
Escherichia coli	A15130	4	2	8	1	2	4
Escherichia coli	A9900	4	4	16	8	8	16
Klebsieila pneumoniae	A15153	2	1	8	1	1	4
Klebsiella pneumoniae	A9884A	4	4	16	4	2	>125
Proteus mirabilis	A20019	1	0,5	4	0,5	04	>125
Proteus raorganii	A 9656	32	63	>125	63	32	>125
Pseudomoflas aeruginosa	A 9657	>125	>125	>125	>125	>125	>125
Serratia marcescens		>125	125	>125	>125	>125	4
Enterobacter cloacae	125	>125	>125	125	>125
Enierobacter cloacae	2	1	4	1	1
	2. Blutspiegelwerte

Zur Bestimmung der Blutspiegelwerte wurden Mäusen jeweils 100 mg/kg der zu testenden Verbindungen peroral verabreicht Die zu testenden Verbindungen wurden in einem Gemisch aus Tween'/Carboxymethylzellulose als Träger gelöst Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle ΙΠ zusammengeheilt

Tabelle IU	Blutspiegelwerte (mcg/ml) -nach	1	2	3 Stunden
Verbindung	0,5	50,8	26,6	11,1
	50,4	48,3	25,1	104
(1)	49,7	32,2	27,5	12,0
Cefatrizin	24,3	49,2	24,1	10,7
(2)	53,4	21,6	7,0	3,3
Cefatrizin	4U
Cefalexin

Es ist ersichtlich, daß die Verbindung (1) gegenüber Cefatrizin eine gewisse Überlegenheit besitzt, zumindest aber vergleichbar ist. Die Verbindung (2) ergibt zwar geringere Spitzenwerte als Cefatrizin. Dies wird dadurch ausgeglichen, daß die Verbindung (2) länger und mit höheren Werten im Blut zur Verfugung steht. Weiter ist ersichtlich, daß sowohl (1) als auch (2) Cefalexin überlegen sind.

CD₅₀-WeIIe

Die CD₅₀-WdIe wurden nach peroraler Verabreichung der zu testenden Verbindungen an Mäuse bestimmt. Der Challenge erfolgte durch intraperitioneale Verabreichung von Proteus mirabilis A 9900 im Falle der Verbindung (1) und durch intraperitoneale Verabreichung von Escherichia coli A 15119 im Falle der Verbindung^). Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV Verbindung

CD» (mg/kg)

(D

Cefatrizin Cefalexin

(2) Cefalexin

7,1 9,6 50

4 18

Es ist ersichtlich, daß die Verbindung (1) Cefatrizin geringfügig überlegen und daß sowohl (1) ala auch (2) Cefalexin überlegen sind.

55 60 65

Claims

Patentansprüche:

1. T-D-i-j-flr-ip-acyloxyphenylacetamidoHephalosporansäureverbindunf en der allgemeinen Formel I

O O

R—C—O—<f

'¹I₂ 10 O I