DE2458121C3

DE2458121C3 - Mikrobiologisches Verfahren zur Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-13>4-trion- oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion-Substrates zu einem 2-substituierten-4 (R)-Hydroxycyclopentan-13-dion-Produkt

Info

Publication number: DE2458121C3
Application number: DE2458121A
Authority: DE
Inventors: Lung Ting Elkhart Ind. Chang; Carol Ann Cassopolis Mich. Terry
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1973-12-10
Filing date: 1974-12-09
Publication date: 1978-04-13
Also published as: IL46103A; CA1038785A; GB1442553A; PL92530B1; HU168825B; ATA981074A; US3925156A; FR2253827B1; BE823174A; DE2458121A1; AT333690B; NL7415982A; BG27094A3; RO63720A; IL46103A0; AR207967A1; FR2253827A1; ZA747392B; DE2458121B2; ES432718A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Umwandlung eines 2-substiluierten-Cyclopentan-l^-trion- oder eines 2-substituierten - 3 - Alkoxy - cyclopenten -2-en- 1,4-dion -Substrates zu einem 2-substituierten-4 (R)-Hydroxycyclopentan-1,3-dion- Produkt.

Sih et al. (J. Am. Chem. Soc, 95, 1676 [1973]: DT-OS 23 48 471) haben ein Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-l,3,4-trion- oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cyclopent-2-en-l,4-dion-Substrates zu einem optisch aktiven 2-substituierten-4 (R)-hydroxy-cyclopentan-1,3-dion beschrieben. Die Anwendung des Symbols R hinsichtlich der 4*Hydroxygruppe gibt die Konformatiort der letzteren nach der Cahn-Ingold-Prelog-Konvention an. Das Verfahren nach S i h et al. bedient sich zur Bewirkung der Umwandlung des Substrates eines Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes.

Ein spezifisches Beispiel dieses Verfahrens umfaßt die Umwandlung von Substraten der allgemeinen Strukturformeln

(I)A (2)

j)₁-L-(CH₂I₁-COjM

und

(ι I₇JUi¹

b)

O ^w OM

zu einem 2-substituierten-4-(R)-Hydroxy-cyclopentan-1,3-dion

_r(CH₂),-L-(CH₂J₄-CO₂M (HI)

HO

durch einen Mikroorganismus der Ordnungen Endomycetales, Mucorales, Moniliales oder Eurotiales. In den Formeln I, II und III bedeutet L einen Äthylenoder Vinylen-Rest, M stellt eine Alkylgruppe mit I bis 4 Kohlenstoffatomen dar, und j und k bedeuten ganze Zahlen von I bis 4. In den Fürmein I, II und III sind die Kohlenstoffatome des Cyclopentanringes im Uhrzeigersinn wie angegeben bezeichnet. In Formel III bedeutet die gestrichelte Linie zwischen C₄ des Cyclo pentanringes und dem Sauerstoffatom der 4-HydroxyI- gruppe eine Valenzbindung, die sich unterhalb der Ringebene erstreckt, wodurch die R-Konformation in der Cahn-Ingold-Prelog-Konvention strukturell ausgedrückt ist.

Ein noch spezifischeres Beispiel des S i h et al.-Verfahrens bezieht sich auf die Umwandlung eines Substrates, wie beispielsweise 2-(6'-Carbomethoxyhcxyl)-cyclopentan-l,3,4-trion (nachfolgende Formel IV) oder 2 - (6' - Carbomethoxyhexyl) - 3 - methoxy - cyclopent- 2-en- 1,4-dion (nachfolgende Formel V) zu 2-(6'-Carbo- methoxyhexyl) - 4 (R) - hydroxy - cyclopenten -1,3 - dion (nachstehende Formel VI) durch die fermentative Einwirkung von Dipodascus uninucleatus oder Schizosaccharomyces pombi:

CO₂CH₃

(IV)

O	O	0	\	0


HO''

CO₂CH₃

(Vl)

CO₂CH,

OCH,

In Formel VI hat die gestrichelte Linie zwischen dem C₄-AtOm des Cyclopentankerns und dem Sauerstoffatom der 4-Hydroxyl-Gruppe die gleiche Bedeutung, wie sie vorstehend för Formel III angegeben ist.

Die spezifischen Bedingungen des S i h et al,-Ver- s fahrens umfassen die folgenden;

1. Verwendung eines Soja-Dextrose-, CereloseiEdamin- oder Dextran-Maisquellflüssigkeit-Mediums, welches eint Ausgangskohlehydratkonzentration von 0,1 bis 0,5% und einen eingestellten Ausgangs-pH-Wert von 5 bis 7 besitzt,

2. Inkubation eines Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes (spezifische Ordnungen Endomycetales, Mucorales, Moniliales oder Eurotiales) in dem Medium, bis eine Mikroorganismuskonzen- '⁵ tration von 10% erhalten wird,

3. anschließende Zufügung eines 2-substituierten-CycIopentan-I,3,4-trions oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cjxJopentan-l,4-dions zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,2 g pro Stunde pro 10 I Medium und

4. Gewinnung des 2-substituierten-4 (R)-Hydroxycyclopentan-I,3-dions aus dem Medium durch Extraktion mit Äthylacetat.

In einem typischen Ansatz mit einer Dauer von 72 Stunden können etwa 5 g des Substrates pro 10 1 Medium zu Produkt umgewandelt werden.

Die Wichtigkeit einer Aufrechterhaltung der Kohlehydratkonzentration oder des pH-Wertes des Mediums während der Inkubation des Mikroorganismus oder der Zugabe des Substrates wurefs jedoch von S i h et al. nicht erkannt.

Beim Verfahren der Erfindung, das im Patentanspruch 1 beschrieben ist, ist es besonders vorteilhaft, wenn die Geschwindigkeit der Substratzugabe 0,5 g/ Std./101 beträgt, und wenn man einen pH-Wert von 4,2 bis 4,7 aufrechterhält. Vorzugsweise wird eine Glucosekonzentration von 0,1% aufrechterhalten.

Das Verfahren der Erfindung betrifft beispielsweise die Umwandlung eines Substrates der Strukturformel worin L einen Äthylen^ oder Vinylen-Rest bedeutet, M eine Alkylgruppe von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, und/ und k ganze Zahlen bedeuten, die einen Wert von I bis 4 besitzen. Daher können /und k unabhängig voneinander 1, 2, 3 oder 4 bedeuten. Somit kann M eine Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Butyl-Gruppe bedeuten. Wie bereits vorstehend angegeben wurde, bezeichnet die gestrichelte Linie zwischen C₄ des Cyclopentankerns und dem Sauerstoff der 4-Hydroxygruppe eine Valenzbindung, deren Richtung sich unterhalb der Ebene des Cyclopentanringes erstreckt. Hierdurch ist die R-Konfonnation grafisch ausgedrückt. Die Umwandlung der Substrate I oder II zu dem Produkt III wird durch die fermentative Einwirkung eines Mikroorganismus der Ordnung Endomycetales, Mucorales, Moniliales oder Eurotiales erreicht und umfaßt die folgenden Verbesserungen:

1. Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, das eine Ausgangsglukosekonzentration von 2 bis 6%, Casaminosäuren, Hefeextrakt und gewisse essentielle Mineralsalze, wie beispielsweise Natriumeitrat, Kaliumdihydrogenorthophosphat. Ammoniumnitrat, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid umfaßt und einen pH-Wert von 4 bis 5 aufweist, bis eine Konzentration des Mikroorganismus voa 20 bis 35% erhalten wird, und Aufrechterhaltung einer anschließenden Glukosekonzentration von 0,1 bis 1% und eines anschließenden pH-Wertes von 4 bis 5 in dem Medium,

2. anschließende Zufügung des Substrates I oder II zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 1,0 g pro Stunde pro 10 I Medium,

3. Aufrechterhaltung der anschließenden Glukosekonzentration des Mediums zwischen 0,1 und 1,0% durch ansatzweise oder kontinuierliche Zuführung während der obigen Stufen und

4. A ufrechterhaltung des anschließendem pH-Wertes des Mediums zwischen 4 und 5 während der Stufen I und 2.

Durch das Verfahren der Erfindung werden beispielsweise die Substrate 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-l,3,4-trion oder 2-(6'-Carbomethoxy-(I) 45 hexyl)-3-methoxy-cyclopenl-2-en-l,4-dionin2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-4 (R)-hydroxy-cyclopentan-l,3-dion durch die fermentative Einwirkung der Mikroorganismen Dipodascus uninucleatus oder Schizosaccharomyces pombi umgewandelt, und zwar auf folgende Weise:

50

(II)

OM
Produkt der Formel

-(CH₂),-l.-(CH₂)» —CO₂M (III)

fio

1. Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, das 3 g Natriumeitrat, 5 g wasserfreies Kaliumdihydrogenorthophosphat, 3 g wasserfreies Ammoniumnitrat, 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,1 g Calciumchloriddihydrat, 5 g Hefeextrakt, 5 g Casaminosäuren, 40 g Glukose und 1 I Wasser umfaßt und einen pH-Wert von 5 bis 6 aufweist und Aufrechterhaltung einer anschließenden Glukosekonzentration von OJ % und eines anschließenden pH-Wertes von 4,2 bis 4.7. bis eine Konzentration des Mikroorganismus von 25% in dem Medium erhalten wird,

2. anschließende Zufügung des Substrates zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0.5 g pro Stunde pro 101 Medium;

3. Aufrechterhaltung der anschließenden Glukosekonzenlration auf 0.1% während der vorstehen-

den Stufen durch ansatzweise oder kontinuierliche Zuführung und

4, Aufrechterhaltung des anschließenden pH-Wertes des Mediums zwischen 4,2 und 4,7 während der Stufen I und 2 durch Zugabe von 1 M KH₂PO₄,

In einem typischen 72-Stunden-Ansatz dieses verbesserten Verfahrens ist eine Umwandlung von 35 bis g des Substrates pro 10 I zu Produkt möglich.

Die folgenden Mikroorganismen der Klasse Ascomycetes können in diesem verbesserten Verfahren zur Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-l,3, 4-trions oder eines 2-substituierten-3-A!koxy-cycIopent-2-en-l,4-dions zu einem 2-substituierten-4 (R)-hydroxy-cyclopentan-l,3-dion angewandt werden:

Ordnung — Endomycetales

Byssoclamys fulva,
Dipodascus uninucleatus,
Dipodascus aggregatus,
Dipodascus albidus,
Zygosaccharomyces priorianus, Zygosaccharomyces ashbya,
Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces cerevisiae var. Odessa, Saccharomyces cerevisiae fragilis, Saccharomyces cerevisiae acidifaciens, Saccharomyces cerevisiae lactis, Saccharomyces cerevisiae dobzanskii. Endomycopsis fibuliger,
Endomycopsis javaanesis,
Hansenula anomala,
Schizosaccharomyces pombi,
Schizosaccharomyces octosporum.

Ordnung — Moniliales

Rhodotorula aurantiaca,
Rhodotorula pallida,
Geotrichum candidum,
Toruiopsis pulcherrima,
Candida krusei,
Gliocladium fimbriatum,
Gliocladium vermoeser.i,
Paecilomyces varioti,
Stachybotrys lobulata,
Trichoderma viride,
Memnonieila echinata,
Gliocladium roseufn,
Fusarium decemcellulare,
Alternaria tenuis,
Gliocladium catenulatum.

Ordnung — Eurotiales

Penicillium striatum,

P. claviforme,

P. pseudostromaticum,

P. roqueforti,

P. cascicolum.

P. expansum,

P. purpurogenum,

P. varioti.

P. frcquentans.

P. ducluuxi.

P. multicolor,

P. sclcrotic.riim.

P. granulatiim.

P. vcrmiculalurr·.

P. lerlikowskii.

P, itah'cum,
Aspergillus ustus,
A, restrictus,
A. ungins,
A. terreus,
A. liichensis,
A. ornatus,

Ordnung — Mucorales

Absidia blakesleeana,
Absidia regnieri,
Mucor rammannianus,
Zygorhynchus heterogamus (±),
Pharmolomyces articulosus,
Phycomyces blakesleeanus.

Dieses verbesserte Verfahren ergibt mehrere unerwartete Vorteile gegenüber dem bekannten Verfahren nach S i h et al. Die Aufrechterhaltung der anschließenden bzw. nachfolgenden KrAIehydratkonzentralion zwischen 0,1 und 1,0% und der- anschließenden pH-Wertes zwischen 4 und 5 des Mediums während der Mikroorganismusinkubaticins- und der Substratzufiigungsstufen führt zu einer schnellen Proliferation des Mikroorganismus zu einer Konzentration von 20 bis 35% in dem Medium und zu einer erhöhten Umwandlungsrate des Substrates zu Produkt von 0,4 bis 1,0 g pro Stunde pro 10 1 Medium. In dem S i h et al.-Verfahren stellen eine Konzentration des Mikro-Organismus von 10% und eine Umwandlungsgeschwindigkeit von etwa 0,2 g des Substrates pro Stunde pro 10 1 Medium die maximalen Parameter des Verfahrens dar. Somit erlaubt dieses verbesserte Verfahren eine 2- bis 3fache Erhöhung in der Konzentration des Mikroorganismus in der Inkubationsstufc und eine 2- bis 5fache Erhöhung der Substraiumwandlungsgeschwindigkeit. Darüber hinaus beträgt die Gesamtmenge des Substrates, die in einem 72 Stunden-Zeitraum umgewandelt werden kann, 35 bis 80 g pro 10 1 Medium oder eine 7- bis 15fache Erhöhung gegenüber ecm, welches in dem bekannten Verfahren umgewandelt wird.

Zum Nachweis der vorteilhaften Eigenschaften des beanspruchten Verfahrens wurden die folgenden Versuche vorgenommen:

Das Verfahren der Umwandlung von 2-(6'-CarbomethoxyhexylJ-cyclopcnlan-l.S^-trion (»Substrat«) zu 2 - (6' - Carbomethoxyhexyl) - 4 (R) - hydroxy - cyclopentan-I,3-dion (»Produkt«), das in der DT-OS 23 48 471 (die die Priorität der US-PS 37 73 622 in Anspruch nimmt) vorgeschlagen ist, wurde mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verglichen:

Fs wurden jeweils parallele vergleichende Versuche in dem Soja-Dextrose-Mcdiumi, das auf Seile 7 der DT-OS beschrieben wird, und in dem Hifo-Casaminosäure-Glucose-Medium der vorliegenden Erfindung durchgeführt. Bei jedem Versuch wurden die folgenden Bedingungen bzw. Parameter eingehalten:

fio (I) Als Mikroorganismus wurde Dipodascus uniclcatus herangezogen.

(2) Das Rcaklionsvolumcn des Mediums betrug 10 Liter.

(3) Die Temperatur wurde auf 28 bis 29 C gehalten: f.s Belüftung und Rührung wurden auf jeweils

4 I/Sld. und 3(K) UpM eingestellt, und

(4) das Medium wurde mit 5% Samcnkulliir des Mikroorganismus inokuliert und während 36 Stun-

den inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde das Substrat zu dem Medium mit einer Konzentration von 0,4 I alle 4 bis 6 Stunden während eines Zeilraumes von 72 Stunden hinzugefügt. Darüber hinaus wurden die Bedingungen des Beispiels I der DT-OS 23 48 471 und des Beispiels 1 der vorliegenden Anmeldung eingehalten.

In der nachfolgenden Tabelle sind die vergleichenden Daten im Hinblick auf die Zeilmassenkonzentration, die nach 36stündiger Inkubation erhältlich ist, und die Substratmenge, die nach 6()stündiger Umwandlung erzielt wurde, einander gegenübergestellt.

Medium

Verfahrensbedingungen

Stand der
Technik¹)

Stand der
Technik¹)
gemäß der 25
Erfindung⁴)

Gemäß der Stand der 18
Erfindung²) Technik¹)

gemäß der 28
Erfindung⁴)

Zellvolumen

nach

36stündigcr

ιΠΛϋΓΜΪΐΟΓι

Menge des in das Produkt umgewandelten
f..ι . ., u

ouuaiicinn nni.ii

72s(ündiger
Umwandlung

35

26

¹) Soja-Dextrose: DT-OS 23 48 471, Seite 7.

²) Hefe-C'asaminosäurenglucose: gemäß Beispiel I der Erfindung.

³) DT-OS 2348471. Beispiel 1.

⁴J Beispiel I der Erfindung. Glucosekonzentration. bei 0.1% und pH-Wert zwischen 4 und 5 aufrechterhalten.

Die Angaben der vorstehenden Tabelle zeigen die vorteilhaften Ergebnisse, die erfindungsgemäß erhalten worden sind. Hierbei ist insbesondere auf die gegenüber dem bekannten Stand der Technik etwa dreifach erhöhte Ausbeute hinzuweisen.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen beschrieben.

Beispiel I

Ein Nährmedium der nachfolgenden Zusammensetzung wurde für die Inkubation des Mikroorganismus und die Umwandlung des Substrates verwendet:

& Liter H₂O

Na₃ Citrat 3

KH₂PO₄ (wasserfrei) 5

NH₄NO₃ (wasserfrei) 2

MgSO₄ - 7H₂O 0,2

CaCl₂-2H₂O 0,1

Hefeextrakt 5

Casaminosäuren 5

Glukose 40

Ein Schleifeninhalt des Oberflächenwachstums von einer I Woche alten Malzextraktagarschrägkultur von Dipodascus uninucleatus wurde angewandt, um 50 ml des vorstehend angegebenen Mediums in einem 250-ml-ErIenmeyerkolben zu inokulieren. Der Kolben wurde bei 26 bis 32" C inkubiert und mit 300 UpM in einem Rotationsschüttler während 36 Stunden geschüttelt. Hiernach wurde ein Transfer von 5 Vol.-% zu einem 2,8-l-Fembachkolben, der I I des gleichen Nährmediums enthielt, vorgenommen. Nach 24stündiger Inkubation, wenn das Wachstum zumindest 25% Feststoffe erreicht hatte, wurden 400 mg der Verbindung 2-(6'-Carbomelhoxyhexyl)-cyclopenlan-l.3.4-trion in Pulverform zu jedem der Fernbachkolbcn alle 8 Stunden während der nächsten 3 Tage hinzugegeben. Während des Verlaufs der Umwandlung wurde der

in pH-Wert des Mediums zwischen 4,2 bis 4,5 durch Verwendung von I M KH₂PO₄ und die Glukosekonzentration innerhalb 0,1 bis 0,4% durch ansatzweise Zugabe von Glukose gehalten. Die Umwandlung von 2 - (6' - Carbomethoxyhexyl) - cyclopentan -1,3,4 - trion

is zu 2-(6'-Carbomethoxy)-4(R)-hydroxy -cyclopentan-1,3-dion wurde periodisch dadurch gemessen, daß man das als Probe entnommene Bier mit dem 0,5fachen Volumen Äthylacetat extrahierte und den Rückstand (suspendiert in Aceton) auf einer Dünnschichtchromatografieplatte unter Anwendung eines Lösungsmittelsystems tüpfelte, welches IIO ml Äthylacetat. 50 ml Iso-octan und 20 ml Essigsäure umfaßte. Die Substrat- und Produkt-Flecken wurden mit Kurzwellen-UV festgestellt. 72 Stunden nach der ersten Substrates zugabe wurden die Zellen durch Filtration entfernt. Das überstehende wurde mit NaCI gesättigt, mit HCI auf pH 2,0 angesäuert und mit I Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde entfernt und zur Trockene eingedampft. Durch Umkristallisicrung

ίο aus Äthylacetat-Petroläther wurden 2,8 g Produkt erhalten: Schmelzpunkt 80 bis 86 C; Mi," +20,3 (CHCl₃).

Die Verwendung von 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-3-methoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion anstelle von

.15 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-1,3,4-trion alsSubstrat ergibt 2'-(6'-Carbomethoxyhexyl)-4 (R)-hydroxy-cyclopentan-1,3-dion in im wesentlichen der gleichen Ausbeute, wie sie vorstehend angegeben ist.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde in einem 14-1-Fermentor unter Anwendung des gleichen Mediums durchgeführt. Ein l-Liter-24-Stunden-Wachstum von Dipodascus uninucleatus in einem 2,8-1-Fernbachkolben wurde angewandt, um 9 1 des in einem I4-I-Fermentor eingebrachten Mediums zu inokulieren. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30 C; Belüftung 5 I Luft/Minute, Rührung 300 UpM.
Zur Kontrolle der Schäumung, soweit erforderlich.

wurde Antifoam 130S verwendet. Nach 24stünd'ger Inkubation wurden 4 g 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-l,3,4-trion als Pulver alle 8 Stunden während der folgenden 72 Stunden hinzugegeben. Während des Verlaufs der Umwandlung wurde der pH-Wert des Mediums innerhalb 4,2 bis 4,5 durch Verwendung von 1 M KH₂PO₄ gehalten, und die Glukosekonzentration wurde innerhalb 0,1 bis 0,4% durch ansatzweise Zufügung von Glukose gehalten. 72 Stunden nach der ersten Zugabe von 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-l,3,4-trion wurden die Zellen entfernt und das Produkt, 2-(6'-CarbomethoxyhexyI)-4 (RJ-hydroxy-cyclopentan-l,3-dion, wurde in der in Beispiel 1 angegebenen Weise isoliert. Die Ausbeute des umkristallisierten Produktes betrug 25,0 g; Schmelzpunkt 89,5 bis 91°C; [«]? + 19,1 (CHCl₃).

In diesem Beispiel kann 2-(6'-CarbomethoxyhexyI)-3-methoxycyclopent-2-en-1,4-dion als Substrat ohne Einbuße an Produktausbeute verwendet werden.

9 10

Beispiel 3 pumpe angefügten Teflonröhre erreicht, um die Korro

sionswirkung des DMF gegenüber Tygon- oder

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, Gummiröhren zu umgehen. Die Umwandlungsgejedoch mit der Ausnahme, daß das Substrat in Dirne- schwindigkeit bzw. -rate war bei Anwendung einer thylformamid(IO gin 20 ml DMF)aufgelöst und kon- 5 kontinuierlichen Beschickung deutlich höher als bei tinuierlich in den Fermentor mit einer Geschwindig- ansatzweiser Beschickung: 36 g in 60 Stunden im Verkeit von 17,5 g/Stunde eingeführt wurde. Die Beschik- gleich zu 36 g in 70 Stunden,
kung wurde unter Anwendung einer an eine Spritz- Die vorstehend angeführten Kohlehydratkonzen-

traiionen stellen Gewichtsprozentangaben dar.

Claims

Patentansprüche; '

1. Mikrobiologisches Verfahren zur Umwandlung eines 2-sub$tituierten-CycIepentan-I,3,4-trion- oder eines 2-sub.stituierten-3-Alkoxy-eycIopent-2Ten-lv4-dion-Substrates zu einem 2-substituierten - 4 (R) - Hydroxycyclopentan - 1,3 - dion-Produkt unter Anwendung eines Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes durch Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, das eine Ausgangskohlehydratkonzentration von 2 bis 6% und einen Ausgangs-pH-Wert von 5 bis 6 aufweist, und nachfolgende Zufügung des Substrates zu dem Inkubationsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bis zu einer Zellkonzentration von 20 bis 35% im Medium inkubiert, sodann das Substrat zu dem inkubierten Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 1,0 g/Std./101 Medium zugibt und daß man sowohl während der Inkubation des Mikroorganismus als auch während der gesamten mikrobiologischen Umwandlung des Substrates zu Produkt im Medium eine Kohlehydratkonzentration von 0,1 bis 1 % und einen pH-Wert von 4 bis 5 aufrechterhält.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit der Substratzugabe 0,5 g pro Stunde pro 10 1 beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Glucosekonzentration von 0,1% aufrechterhält.

Λ. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pH-Wert von 4.2 bis 4,7 aufrechterhält.