DE2458121A1

DE2458121A1 - Verbessertes mikrobiologisches verfahren zur herstellung von 2-substituierten-4(r)-hydroxy-cyclopentan-1,4-dionen

Info

Publication number: DE2458121A1
Application number: DE19742458121
Authority: DE
Inventors: Lung Ting Chang; Carol Ann Terry
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1973-12-10
Filing date: 1974-12-09
Publication date: 1975-06-12
Also published as: ATA981074A; DE2458121B2; HU168825B; PL92530B1; US3925156A; BG27094A3; IL46103A; SE7415405L; BE823174A; AR207967A1; DD114397A5; GB1442553A; AT333690B; CA1038785A; FR2253827B1; NL7415982A; CS177040B2; NO744417L; AU7561674A; ES432718A1

Description

26 195 n/wa

MILES LABORATORIES, INC., ELKHART, INDIANA/USA

Verbessertes mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 2-substituierten-4(R)-Hydroxy-cyclopentan-1 ,.4-dionen

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von optisch aktiven Verbindungen, die in der Synthese natürlicher Prostaglandine, deren Analoga und Derivaten wichtige Zwischenprodukte darstellen. .

Sih et al (J. Am. Chem. Soc, j)5: 1676 /~1973_7; US-PS 3 773 622 /~1973__7) haben ein Verfahren zur mikrobiologischen

509824/0961 ^.

ORIGINAL INSPECTED

Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-1,3,4-trion- oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion-Substrates zu einem optisch aktiven 2^t-substituierten-4(R)-hydroxy-cyclopentan-i,3-dion beschrieben. Die Anwendung des Symbols R hinsichtlich der 4-Hydroxygruppe gibt die Konformation der letzteren nach der Cahn-Ingold-Prelog-Konvention an. Das Verfahren nach Sih et al bedient sich zur Bewirkung der Umwandlung des Substrates eines Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes.

Ein spezifisches Beispiel dieses Verfahrens umfasst die Umwandlung von Substraten der allgemeinen Strukturformeln

(CH₂) j-L- (CH₂ )_k-C0₂

(D

c/

(CH₂).-L-(CH₂)_k-CO₂M

(4) ^N0M

(ID

zu einem 2-substituierten-4-(R)-Hydroxy-cyclopentan-1,3-dion

'\ (CH₂) J-L-(CH₂)^CO₂M

.(III)

(4)

9824/0961:.'

durch einen Mikroorganismus der Ordnungen Endoraycetales, : Mucorales, Moniliales oder Eurotiales. In den. Formeln;I, . · 1I^ und III bedeutet L einen Äthylen- oder Viny len-*Rest, M stellt/eine Alky!gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar und j und-k bedeuten ganze Zahlen von-1 bis.; 4. In den Formeln I, TZ und III sind die Kohlenstoffatome des Cyclopentanringes im Uhrzeigersinn -wie angegeben- bezeichnet....-.- . In Formel III bedeutet die gestrichelte Linie., zwischen C₄ des Cyclopentanringes und dem Sauerstoffatom der 4-Hydroxyl-, gruppe eine Valenzbindung ., die sich unterhalb der Ringebene erstreckt, wodurch die R-rKonformation in der Cahn— Ingold-Prelög-Konvention strukturell ausgedrückt ist.

Ein noch spezifischeres Beispiel des Sih et al,-Verfahrens bezieht sich auf die Umwandlung eines Substrates, wie beispielsweise 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cycldpentan-1,3,4-trion (nachfolgende Formel IV) oder 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-3-methoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion (nachfolgende Formel V) zu 2-(6 ^% -Carbomethoxyhexyl)-4(R)-hydroxy-cyclopentan-1,3-dion (nachstehende Formel VI) durch die fermentative Einwirkung von Dipodascus uninucleatus oder Schi'zosaccharomyces pombi:

CO₂CH₃

SQ9824/OS61

CO₂CH₃

(VI)

(V)

In Formel VI hat die gestrichelte Linie zwischen dem C«- Atom des Cyclopentankerns und dem Sauerstoffatom der 4-Hydrox'yl-Gruppe die gleiche Bedeutung, wie sie vorstehend für Formel III angegeben ist.

Die spezifischen Bedingungen des Sih et al.-Verfahrens umfassen die folgenden:

1. Verwendung eines Soja-Dextrose-, Cerelose-Edamin-

oder Dextran-Maisqüellflüssigkeit-Mediums, welches eine Ausgangskohlehydratkonzentration von 0,1 bis 0,5 % und einen eingestellten Ausgangs-pH-Wert von 5 bis besitzt;

2. Inkubation eines Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes (spezifische Ordnungen Endomycetales, Mucorales,

-S-

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Moniliales oder Eurotiales) in dem Medium, bis eine Mikroorganismuskonzentration von 10 % erhalten
wird;

3. anschliessende 'Zufügung eines 2-substituierten-Cyclopentan-1,3,4-trions oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cyclopentan-i,4-dions zu dem Medium mit
einer Geschwindigkeit von etwa 0,2 g pro Stunde pro 10 1 Medium; und

4. Gewinnung des 2-substituierten-4(R)-Hydroxy-eyeIopentan-1,3-dion aus dem Medium durch Extraktion mit Äthylacetat.

In einem typischen Ansatz mit einer Dauer von 72 Stunden
können etwa 5 g des Substrates pro 10 1 Medium zu Produkt
umgewandelt werden. ■ ■

Es ist erkennbar, dass das Sih et al.-Verfahren eine Aufrechterhaltung der Kohlehydratkonzentration oder des pH-Wertes des Mediums während der Inkubation des Mikroorganismus oder der Zugabe des Substrates nicht umfasst.

Den Gegenstand der Erfindung stellt ein verbessertes mikrobiologisches Verfahren zur Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-1,3,4-trion - oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cyclopentⁱ-2-en-1 ,4-dion-Substrates in ein optisch aktives 2-substituiertes-4. (R)-Hydroxy-cyclopentan-i ,3-dion-Produkt durch einen Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes dar, welches die folgenden Verbesserungen umfasst:

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1. Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, welches eine Ausgangskohlehydratkonzentration von 2 bis 6 % und einen Ausgangs-pH-Wert von 5 bis 6 aufweist und Aufrechterhaltung einer anschliessenden Kohlehydratkonzentration von 0,1 bis 1 % und eines anschliessenden pH-Wertes von 4 bis 5, bis eine Konzentration des Mikroorganismus von 20 bis 35 % erhalten wird;

2. Zufügung des Substrates zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 1,0 g pro Stunde pro 10 1 Medium;

3. Aufrechterhaltung der anschliessenden Kohlehydratkonzentration des Mediums zwischen 0,1 und 1,0 % durch ansatzweise oder kontinuierliche Zuführung während der Inkubationsstufe und der Substratzugabestufe; und

4. Aufrechterhaltung des anschliessenden pH-Wertes des Mediums zwischen 4 und 5 während der Inkubationsstufe und der Substratzugabestufe.

Ein spezifischeres Beispiel der Erfindung umfasst das verbesserte Verfahren zur Umwandlung eines Substrates der Strukturformel

Cf

—(CH₂)j-L-(CH₂)_k-CO₂M (I)

—~ "7

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(CH2).-L-(CH₂)_k-CO₂M

OM

(II)

zu einem Produkt der Formel

₂) .-L-(CH₂) _k-C0₂!

(III)

worin L einen Äthylen- oder Vinylen-Rest bedeutet, M eine Älky!gruppe von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, und j und k ganze Zahlen bedeuten, die einen Wert von 1 bis 4 besitzen. Daher können j und k unabhängig voneinander 1, 2, 3 oder 4 bedeuten. Somit kann M eine Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Butyl-Gruppe bedeuten. Wie bereits vorstehend angegeben wurde, bezeichnet die gestrichelte Linie zwischen C- des Cyclopentankerns und dem Sauerstoff der 4-Hydroxy-

ft _f j .

gruppe eine Valenzbindung, deren Richtung sich unterhalb der Ebene des Cyclopentanringes erstreckt. Hierdurch·ist die R-Konformation grafisch ausgedrückt. Die Umwandlung der Substrate I^ oder JEJE zu dem Produkt III wird durch die fermentative Einwirkung eines Mikroorganismus der Ordnung Endomycetales, Mucorales, Moniliales oder Eurötiales erreicht und umfasst die folgenden Verbesserungen:

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1. Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, das eine Ausgangsglukosekonzentration von 2 bis 6 %, Casaminosäuren, Hefeextrakt und gewisse essentielle Mineralsalze, wie beispielsweise Natriumeitrat, Raliumdihydrogenorthophosphat, Ammoniumnitrat, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid umfasst und einen pH-Wert von 4 bis 5 aufweist, bis eine Konzentration des Mikroorganismus von 20 bis 35 % erhalten wird, und Aufrechterhaltung einer anschliessenden Glukosekonzentration von 0,1 bis 1 % und eines anschliessenden pH-Wertes von 4 bis 5 in dem Medium;

2. anschliessende Zufügung des Substrates I^ oder 1I^ zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 1,0g pro Stunde pro 10 1 Medium;

3. Aufrechterhaltung der anschliessenden Glukosekonzentration des Mediums zwischen 0,1 und 1,0 % durch ansatzweise oder kontinuierliches Zuführung während der obigen Stufen; und

4. Aufrechterhaltung des anschliessenden pH-Wertes des Mediums zwischen 4 und 5 während der Stufen 1 und

Ein detailliertes Beispiel gemäss der Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Umwandlung eines Substrates, wie beispielsweise 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-1,3,4-trion oder 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-3-methoxy-cyclopent-2-en~1,4-dion zu 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-4(R)-hydroxy-cyclopentan-1,3-dion durch die fermentative Einwirkung der

— Q _

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Mikroorganismen Dipodascus uninucleatus oder Schizosaccharomyces pombi und umfasst die Verbesserungen:

1. Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, das

3 g Natriumeitrat, 5 g wasserfreies K'aliumdihydrogenorthophosphat, 3 g wasserfreies Ammoniumnitrat, 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,1 g Calciumchloriddihydrat, 5 g Hefeextrakt, 5 g Casaminosäuren, 4Ö g Glukose und 1 1 Wasser umfasst und einen pH-Wert von 5 bis 6 aufweist und Aufrechterhaltung einer anschliessenden Glukosekonzentration von 0,1 % und eines anschliessenden pH-Wertes von 4,2 bis 4,7, bis eine Konzentration des Mikroorganismus von 25 % in dem Medium erhalten wird;

2. Anschliessende Zufügung des Substrates zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,5 g pro Stunde pro 10 1 Medium; ■

3. Aufrechterhaltung der anschliessenden Glukosekonzentration auf 0,1 % während der vorstehenden Stufen durch ansatzweise oder kontinuierliche Zuführung; und

4. Aufrechterhaltung des anschliessenden pH-Wertes des Mediums zwischen 4,2 und 4,7 während der Stufen 1 und 2 durch Zugabe von 1 M KH₃PO₄.

In einem typischen 72-Stunden-Ansatz dieses verbesserten Verfahrens ist eine Umwandlung von 35 bis 75 g des Substrates pro 10 1 zu Produkt möglich-

- 10 -

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Die folgenden Mikroorganismen der Klasse Ascoraycetes können in diesem verbesserten Verfahren zur Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-1,3,4-trions oder eines 2-substituierten-3-Alkqxy-cyclopent-2-en-1,4~diors zu einem 2-substituierten-4(R)-hydroxy-cyclopentan-i,3-dion angewandt werden:

Ordnung - Endomycetales

Byssoclamys fulva Dipodascus uninucleatus Dipodascus aggregatus Dipodascus albidus Zygosaccharomyces priorianus Zygosaccharomyces ashbya Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae var. Odessa Saccharomyces cerevisiae fragilis Saccharomyces cerevisiae acidifaciens Saccharomyces cerevisiae lactis Saccharomyces cerevisiae dobzanskii Endomycopsis fibuliger Endomycopsis javaanesis Hansenula anomala .
Schizosaccharomyces pombi Schizosaccharomces octosporum

Ordnung - Moniliales

Rhodotorula aurantiaca Rhodotorula pallida

- 11 -

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Ordnung - Moniliales (Fortsetzung)

Geotrichum candidum Torulopsis pulcherrima Candida krusei Gliocladium fimbriatum Gliocladium vermoeseni Paecilomyces varioti Stachybotrys lobulata Trichoderma viride Memnoniella echinata Gliocladium roseum Fusarium decemcellulare Alternaria tenuis Gliocladium catenulatum

Ordnung - Eurotiales

Penicillium striatum	claviforme
P.	pseudostromaticum
P.	roquefort!
P.	"caseicolum
P.	expansum
P.	purpurο genum
P.	varioti
P.	frequentans
P.	duclauxi
P.	multicolor
P.

5.0 9 8 24/0 9 6

Ordnung - Eurotiales (Fortsetzung)

P.	sclerotiorum	restrictus
P.	granulatum	ungins
P.	vermiculatum	terreus
P.	terlikowskii	luchensis
P.	italicum	ornatus
Aspergillus ustus
A.
A.
A.
A.
A.

Ordnung - Mucorales

Absidia blakesleeana Absidia regnieri Mucor Ranunannianus Zygorhynchus heterogamus (+)
Pharmolomyces articulosus Phycomyces blakesleeanus

Dieses verbesserte Verfahren ergibt mehrere unerwartete" Vorteile gegenüber dem bekannten Verfahren nach Sih et al. Die Aufrechterhaltung der anschliessenden bzw. nachfolgenden Kohlehydratkonzentration zwischen 0,1 und 1,0 % und des anschliessenden pH-Wertes zwischen 4 und 5 des Mediums während der
Mikroorganismusinkubations- und der Substratzufügungsstufen

_ 11

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_ -1 O _

führt zu einer sehr schnellen Proliferation des Mikroorganismus zu einer Konzentration von 20 bis 35 % in dem Medium und zu einer erhöhten Umwandlungsrate des Substrates zu Produkt von 0,4 bis 1,0 g pro Stunde pro 10 1 Medium. In dem Sih et_al-Verfahren stellen eine Konzentration des Mikroorganismus von 10 % und eine Umwandlungsgeschwindigkeit von etwa 0,2 g des Substrates, pro Stunde pro 10 1 Medium die maximalen Parameter des Verfahrens dar. Somit erlaubt dieses verbesserte Verfahren eine 2- bis 3-fache Erhöhung in der Konzentration des Mikroorganismus in der Inkubationsstufe und eine 2- bis 5-fache Erhöhung der Substratumwandlungsgeschwindigkeit. Darüber hinaus beträgt die Gesamtmenge Jdes Substrates, die in einem 72-Stunden-Zeitraum "umgewandelt werden kann35 bis 80 g pro 10 1 Medium oder eine 7- bis 15-fache Erhöhung gegenüber dem, welches in dem bekannten Verfahren umgewandelt wird'.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen beschrieben. ·

Beispiel 1

Ein Nährmedium der nachfolgenden Zusammensetzung wurde für die Inkubation des Mikroorganismus und die Umwandlung des Substrates verwendet:

g/Liter H₃O

Na₃ Citrat 3

KH₂PO₄ (wasserfrei) 5

- 14 -

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NH₄NO₃ (wasserfrei) 2

MgSO₄.7H₂O 0.2

CaCl₂.2H₂O · 0.1

Hefeextrakt 5

Casaminosäuren 5

Glukose 40

Ein Schleifeninhalt des Oberflächenwachstums von einer 1 Woche alten Mal zextr aktagarschrägkulturvon Dipodascus uninucleatus wurde angewandt, um 50 ml des vorstehend angegebenen Mediums in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Der Kolben wurde bei 26 bis 32 C inkubiert und mit 300 Upm in einem Rotationsschüttler während 36 Stunden geschüttelt. Hiernach wurde ein Transfer von-5 Vol.% zu einem 2,8 Liter-Fernbach-Kolben, der 1 1 des gleichen Nährmediums enthielt, vorgenommen. Nach 24-stündiger Inkubation, wenn das Wachstum zumindest 25 % Feststoffe erreicht hatte, wurden 400 mg der Verbindung 2-(6'-Carbomethoxyhexy1) cyclopentan-1,3,4-trion in Pulverform zu jedem der Fernbachkolben alle 8 Stunden während der nächsten 3 Tage hinzugegeben. Während des Verlaufs der Umwandlung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 4,2 bis 4,5 durch Verwendung von 1 M KH₃PO₄ und die Glukosekonzentration innerhalb 0,1 bis 0,4 % durch ansatzweise Zugabe von Glukose gehalten. Die Umwandlung von 2-(6'-Carbomethoxyhexy1)-cyclopentan-1,3,4-trion zu 2-(6'-Carbomethoxy)-4(R)-hydroxy-cyclopentan-i,3-dion wurde periodisch dadurch gemessen, dass man das als Probe entnommene Bier mit dem 0>5-fachen Volumen Äthylacetat extrahierte und den Rückstand (suspendiert in Aceton) auf

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einer Dünnschichtchromatografieplatte unter Anwendung eines Lösungsmittelsystems tüpfelte, welches 110 ml Äthylacetat, 50 ml Iso-octan und 20 ml Essigsäure umfasste. Die Substrat- und Produkt-Flecken wurden mit Kurzwellen-UV festgestellt. 72 Stunden nach der ersten Substratzugabe wurden die Zellen durch Filtration entfernt. Das Überstehende wurde mit NaCl gesättigt, mit HCl auf pH 2,0 angesäuert und mit 1 Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wurde entfernt und zur Trockene eingedampft. Durch Ümkristallisierung aus Äthylacetat-Petroläther wurden 2,8 g Produkt erhalten; Schmelzpunkt 80 bis 86°C; C⁰J^ + 20,3 (CHCl₃).

Die Verwendung von 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-3-methoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion anstelle von 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-1,3,4-trion als Substrat ergibt 2'-(6'-Carbomethoxyhexyr)-4(R)-hydroxy-cyclopentan-i,3-dion in im wesentlichen der gleichen Ausbeute, wie sie vorstehend angegeben ist. -

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde in einem 14 Liter-Fermentor unter Anwendung des gleichen Mediums durchgeführt. Ein l~Liter-24-Stunden-Wachstum von Dipodascus uninucleatus in einem Z,8 Liter-Fernbach-Kolben wurde angewandt, um 9 1 des in einem 14-Liter-Fermentor eingebrachten Mediums zu inoku-· lieren. Die Fermentationsbedingungen wären: Temperatur 30 Cj Belüftung 5 1 Luft/Minute., Rührung 300 Upm.

Zur Kontrolle der Schäumung, soweit erforderlich, wurde

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Antifoam 130S verwendet. Nach 24-stündiger Inkubation wurden 4 g 2—(6'-Carbomethoxyhexy1)-cyclopentan-1,3,4-trion als Pulver alle 8 Stunden während der folgenden 72 Stunden hinzugegeben. Während des Verlaufs der Umwandlung wurde der pH-Wert des Mediums innerhalb 4,2 bis 4,5 durch Verwendung von 1M KH₂PO. gehalten und die Glukosekonzentration wurde innerhalb 0,1 bis 0,4 % durch ansatzweise Zufügung von Glukose gehalten. 72 Stunden nach der ersten Zugabe von 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-1,3,4-trion wurden die Zellen entfernt und das Produkt, 2-(6'-Carboinethoxyhexyl)-4 (R)-hydroxy-cyclopentan-1, 3-dion, wurde in der in Beispiel 1 angegebenen Weise isoliert. Die Ausbeute des umkristallisierten Produktes betrug 25,0 g; Schmelzpunkz 89,5 bis 91°C; CcxT/^⁵ +19,1 (CHCl₃).

In diesem Beispiel kann 2-(6'-Carbomethoxyhexy1)-3-methoxycyclopent-2-en-1,4-dion als Substrat ohne Einbusse an Produktausbeute verwendet werden.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass das Substrat in Dimethylformamid (10 g in 20 ml DMF) aufgelöst und kontinuierlich in den Fermentor mit einer Geschwindigkeit von 0,5 g/Stunde eingeführt wurde. Die Beschickung wurde unter Anwendung einer an eine Spritzpumpe angefügtenTeflonröhre erreicht, um die Korrosionswirkung des DMF gegenüber Tygon- oder Gummiröhren zu umgehen. Die Umwandlungsgeschwindigkeit bzw. -rate war bei Anwendung

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einer kontinuierlichen Beschickung deutlich höher als bei ansatzweiser Beschickung: 36 gin 60 Stunden int Vergleich zu 36 g in 70 Stunden.

Die vorstehend angeführten Kohlehydratkonzentrationen stellen Gewichtsproζentangaben dar.

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Claims

Patentansprüche

1/ Verbessertes mikrobiologisches Verfahren zur Umwandlung eines 2-substituierten-Cyclopentan-1,3,4-trion- oder eines 2-substituierten-3-Alkoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion-Substrates zu einem 2-substituierten-4(R)-Hydroxy-cyclopentan-1,3-dion unter Anwendung eines Mikroorganismus der Klasse Ascomycetes, gekennzeichnet durch Inkubation des Mikroorganismus in einem Medium, das eine Ausgangskohlehydratkonzentration von 2 bis 6 % und einen Ausgangs-pH-Wert von 5 bis 6 aufweist, und Aufrechterhaltung einer anschliessenden Kohlehydratkonzentration von 0,1 bis 1 % und eines anschliessenden pH-Wertes von 4 bis 5, bis eine Zellkonzentration des Mikroorganismus von 20 bis 35 % in dem Medium erhalten wird, Zufügung des Substrates zu dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 1,0g pro Stunde pro 10 1 Medium, und Aufrechterhaltung der anschliessenden Kohlehydratkonzentration des Mediums ^wischen 0,1 und 1,0 % und des nachfolgenden pH-Wertes des Mediums zwischen und 5 während der Zufügung des Substrates.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus der Gruppe von Verbindungen ausgewählt ist, die die Formel

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(CH₂).-L-(CH₂)_k-CO₂M

oder

H₂) . -L- (CH₂) _k-

aufweisen, worin L eine Äthylen- oder Vinylengruppe bedeutet, M einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, und j und k ganze Zahlen von 0 bis 4 bedeuten. _v
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man als Substrat 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-cyclopentan-1,3,4-trion verwendet.
4.. Verfahren nach'Anspruch T, dadurch gekennzeichnet , dass man als Substrat 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-3-methoxy-cyclopent-2-en-1,4-dion verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,

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dadurch gekennzeichnet , dass die Geschwindigkeit der Substratzugabe 0,5 g pro Stunde pro 10 1 be-.trägt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Kohlehydratkonzentration 0,1 % beträgt und als Kohlehydrat Glukose verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Kohlehydratkonzentration durch ansatzweise Beschickung aufrechterhalten wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlehydratkonzentration durch kontinuierliche Beschickung aufrechterhalten wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass das Medium 3 g Natriumeitrat, 5 g wasserfreies Kaliumdihydrogenorthophosphat, 2 g Ammoniumsulfat, 0,2 g Magnesiumchloridheptahydrat, 0,1 g Calciumchloriddihydrat 5 g Hefeextrakt, 5g Casaminosäuren, 40 g Glukose und 1 1 Wasser umfasst.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wert auf 4,2 bis 4,7 gehalten wird.

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11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH durch Anwendung von 1 M KH-PO. aufrechterhalten wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, .dadurch gekennzeichnet , dass man als Mikroorganismus Djpodascus uninucleatus verwendet.

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