PL92530B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób mikrobiologicznego wytwarzania podstawionego w pozycji 2 4 (R)-hydroksy- cyklopentanodionu-1, 3, optycznie czynnego zwiazku, który jest waznym pólproduktem w syntezie naturalnych pros- taglandyn, ich analogów i pochodnych. 5 Sih i wspólpracownicy (J.Am.Chem.Soc, 95, 1676 (1973); opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 3773622) opisali sposób mikrobiologicznego przetwarzania podsta¬ wionego w pozycji 2 cyklopentanotrionu-1, 3, 4 lub pod¬ stawionego w pozycji 2 3-alkoksycyklopenten-2-dionu-l, 10 4 w optycznie czynny podstawiony w pozycji 2 4(R)- Jiydroksycyklopentanodion-1, 3, w którym symbol R przy grupie 4-hydroksylowej oznacza konformacje tej grupy zgodna z konwencja Cahna-Ingolda-Preloga w pro¬ cesie Sina i wspólpracowników w celu przetwarzania sub- 15 stratu stosuje sie mikroorganizm z klasy workowców Asco- mycetes.Specyficznym przykladem ilustrujacym ten proces jest konwersja zwiazków o wzorach 1 i 2, w podstawiony w pozycji 2 4-(R)-hydroksycyklopentanodionu-l, 3 o wzo- 20 xze 3 za pomoca mikroorganizmu z rzedu Endomyce- tales, Mucorales, Moniliales lub Eurotiales. We wzorach 1, 2 i 3 L oznacza grupe etylenowa lub winylowa. M ozna¬ cza grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla, j i k oznaczaja liczby calkowite 0—4. We wzorach 1, 2 i 3 atomy wegla 25 w pierscieniu cyklopentanu sa, jak zaznaczono numerowa¬ ne zgodnie z kierunkiem ruchu wskazówek zegara. We wzorze 3 linia przerywana pomiedzy atomem wegla 4 w pierscieniu cyklopentanu a atomem tlenu grupy hy¬ droksylowej w pozycji 4 oznacza wiazanie walencyjne 30 skierowane pod plaszczyzne pierscienia, w ten sposób przedstawia sie strukturalnie R-konformacje zgodnie z konwencja Cahna-Ingolda-Preloga.Bardziej specyficznym przykladem ilustrujacym pro¬ ces Siha i wspólpracowników jest przemiana substratu, takiego jak 2- (6'-karbometoksyheksylo)-cyklopentanotrion- -1, 3, 4 o wzorze 4 lub 2- (6'-karbometoksyheksylo)-3- metoksycyklopenten-2-dion-l, 4 o wzorze 5 w 2-(6'-karbo- metoksyheksylo)-4 (R)-hydroksycyklopentanodion-l, 3 o wzorze 6 podczas prowadzenia fermentacji wywolanej przez Dipodascus uninucleatus lub Schizosaccharomy- ces pombi.We wzorze 6 linia przerywana pomiedzy atomem wegla 4 czasteczki cyklopentanu a atomem tlenu grupy hy¬ droksylowej w pozycji 4 ma to samo znaczenie co linia opisanego powyzej wzoru 3.W procesie Siha i wspólpracowników stosuje sie nas¬ tepujace warunki: pozywke o skladzie soja-dekstroza, cereloza-edamma lub pozywke z dekstranem i wyciagiem namokowym kukurydzy o poczatkowym stezeniu weglo¬ wodoru 0,1—0,5% i poczatkowej wartosci pH 5—7, inkubacje mikroorganizmu z klasy workowców Ascomy- cetes, szczególnie rzedów Endomycetales, Mucorales, Moniliales, lub Eurotiales w pozywce do chwili gdy ste¬ zenie mikroorganizmu osiagnie 10% dodawanie pod¬ stawionego w pozycji 2 cyklopentanotrionu-1, 3, 4 lub podstawionego w pozycji 2 3-alkoksycyklopentanodion-l, 4 do pozywki z szybkoscia 0,2 grama na godzine na 10 litrów pozywki i wyodrebnianie z pozywki podstawionego 92 53092 530 3 w pozycji 2 4(R)-hydroksycyklopentanodionu-l, 3 na drodze ekstrakcji octanem etylu.W typowym, trwajacym 72 godziny procesie mozna poddac przemianie okolo 5 gramów substratu na 10 li¬ trów pozywki.Nalezy podkreslic, ze w procesie Siha i wspólpracow¬ ników nie utrzymuje sie na tym samym poziomie ani ste¬ zenia weglowodoru ani wartosci pH pozywki podczas inkubacji mikroorganizmu lub dodawania substratu.Przedmiotem wynalazku jest sposób mikrobiologicz¬ nego wytwarzania podstawionego w pozycji 2 4(R)-hydro- ksycyklopentadionu-1, 3 na drodze przemiany podsta- wionejpjar ^zytjf 2 cyklopentanotrionu-1, 3, 4 lub pod- Jtawjonego* w pozycji* 2 3-alkoksycyklopenten-2-dionu-l w optycznie czynny, podstawiony w pozycji 2 4 (R)- -hydroksycyklopenpanodion-1, 3 za pomoca mikroorga¬ nizmu*'^ klasy workowców Ascomycetes, polegajacy na inkubacji mikroorganizmu w pozywce o poczatkowym stezeniu weglowodoru 2—6% i poczatkowej wartosci pH —6 i utrzymaniu stezenia weglowodoru na poziomie 0,1—1% i wartosci pH w zakresie 4—5 do czasu osiag¬ niecia stezenia mikroorganizmu w pozywce 20—35%, dodawaniu do pozywki substratu z szybkoscia 0,4—1,0 grama na godzine na 10 litrów pozywki, utrzymaniu ste¬ zenia weglowodoru w pozywce w zakresie 0,1—1,0% za pomoca okresowego lub ciaglego zasilania pozywki pod¬ czas inkubacji i dodawania substratu i utrzymaniu war¬ tosci pH w zakresie 4—5 podczas inkubacji i dodawania substratu.Przykladem bardziej szczególowo ilustrujacym sposób wedlug wynalazku jest przemiana substratu o wzorze 1 lub w produkt o wzorze 3, w których to wzorach L ozna¬ cza grupe etylenowa lub winylowa, M oznacza grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla, j i k oznaczaja liczby cal¬ kowite o wartosci 1—4. Jak podano powyzej, linia prze¬ rywana pomiedzy atomem wegla 4 z czasteczki cyklopen- tanu a atomem tlenu grupy hydroksylowej w pozycji 4 oznacza wiazanie walencyjne skierowane pod plaszczyz¬ ne pierscienia, w taki sposób przedstawiono graficznie R-konformacje. Przemiana substratów o wzorze 1 lub 2 w produkt o wzorze 3 zwiazana jest z fermentacja wywo¬ lana przez mikroorganizm rzedu Endomycetales, Muco- rales, Moniliales lub Eurotiales. Inkubacje mikroorga¬ nizmu prowadzi sie w pozywce o poczatkowym stezeniu glukozy,2—6% i wartosci pH 4—5, zawierajacej ponadto kwasne hydrolizaty kazeiny, ekstrakt drozdzy i pewne niezbedne sole mineralne, takie jak cytrynian sodowy, dwuwodororotofosforan potasowy, azotan amonowy, siar¬ czan magnezowy, chlorek wapniowy do chwili az ste¬ zenie mikroorganizmu nie osiagnie wartosci 20—35%, przy utrzymanym na jednakowym poziomie 0,1—1,0% pózniejszym stezeniu glukozy w pozywce i pózniejszej wartosci pH pozywki 4—5. Do pozywki dodaje sie sub- strat o wzorze 1 lub 2 z szybkoscia 0,4—1,0 grama na godzine na 10 litrów pozywki. Pózniejsze stezenie glu¬ kozy w pozywce utrzymuje sie w zakresie 0,1—1,0% za¬ silajac pozywka okresowego lub w sposób ciagly. War¬ tosc pH utrzymuje sie w zakresie 4—5 podczas pierwsze¬ go i drugiego etapu.Przykladem bardziej szczególwo opisujacym sposób wedlug wynalazku jest przemiana substratu, takiego jak 2-(6/-karbometoksyheksyJo)-cyklopentanotrion-l, 3, 4 lub 2- (6'-karbometoksyheksylo)-3-metoksycyklopenten-2-dion- I 4 -1, 4 w 2- (6'-karbometoksyheksylo)-4 (R)-hydroksycyklo- pentanodion-1, 3 na drodze fermentacji wywolanej przez Dipodascus uninucleatus lub Schizosaccharomyces pombL Inkubacje mikroorganizmu prowadzi sie w pozywce za- wierajacej 3 g cytrynianu sodowego, 5 g bezwodnego dwu- wodoroortofosforanu potasowego, 3 g bezwodnego azo¬ tanu amonowego, 0,2 g siedmiowodzianu siarczanu mag¬ nezowego 0,1 g dwuwodzianu chlorku wapniowego, 5 g ekstraktu drozdzowego, 5 g kwasnego hydrolizatu ka- zeiny, 40 g glukozy i 1 litr wody o wartoscipH 5—6 i utrzy¬ muje sie stezenie glukozy na poziomie 0,1% i wartosc- pH w zakresie 4,2—4,7 do czasu osiagniecia stezenia mi¬ kroorganizmu w pozywce 25%. Do pozywki dodaje sie; substrat z szybkoscia 0,5 grama na godzine na 10 litrów pozywki i utrzymuje sie 0,1% stezenia glukozy podczas obu etapów prowadzac okresowe lub ciagle zasilanie i nas¬ tepnie utrzymuje sie pH pozywki w zakresie od 4,2—4,7 podczas etapów 1 i 2 dodajac IM KH2P04. W tego typu. procesie, trwajacym 72 godziny ulega przemianie w pro- dukt 35—75 gramów substratu na 10 litrów pozywka Nastepujace mikroorganizmy klasy workowców Ascic* mycetes moga znalezc zastosowanie przy przeprowadza¬ niu przemiany podstawionego w pozycji 2 cyklopenysyc- trionu-1, 3, 4 lub podstawionego w pozycji 2 3-alkokinot- klopenten-2-dionu-l, 4 w podstawiony w pozycji 2 4(R)- -hydroksycyklopentanodion-1,3; Rzad — Endomycetales: Byssoclamys fulva, Dipodascus- uninucleatus, Dipodascus aggregatus, Dipodascus albidus, Zygosaccharomyces priorianus, Zygosaccharomyces ashbya, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. odessa, Saccharomyces cerevisiae fragillis, Saccharomyces cerevisiae acidifaciens, Saccharomyces cerevisiae lactis Saccharomyces cerevisiae dobzanskij, Endomycopsis fi- 3 buliger, Endomycopsis javaanesis, senula anomala, Schizo¬ saccharomyces pombi, Schizosaccharomyces octosporunu Rzad — Moniliales: Rhodotorula aurantiaca,Rhodotorula palliada, Geotrichum candidum, Torulopsis pulcherrima* Candida krusei, Glocladium fimbriatum, Gliocladium 40 vermoeseni, Paecilomyces varioti, Stachybotrys lobulata, Trichoderma viride, Memnoniella echinata, Gliocladium loseum, Fusarium decemcellulare, Alternaria tenuis Glioc- radium catenulatum.Rzad — Eurotiales: Penicilium striatum, P. clayiforme, 45 P. pseudostromaticum, P. rogueforti, P. caseicolum* P. expansum, P. purpurogenum, P. varioti, P. freguen- tans, P. duclauxi, P. multicolor, P. sclerotiorum, P.gra- nulatum, P. vermiculatum, P. terlikowskij, P. italicum, Aspergillus ustus, A. restrictus, A. ungins, Aspergillus 50 terreus, A. luchensis, A. ornatus.Rzad Mucorales: Absidia blakesleeana, Absidia reg- nieri, Mucor Rammannianus, Zygorhynchus heteroga- mus (=b)3 Pharmolomyces articulosus, Phycomyces blak- esleeanus. 55 Sposób wedlug wynalazku wykazuje wiele niespodzie¬ wanych korzysci w porównaniu ze sposobem Siha i wspól¬ pracowników. Utrzymanie pózniejszego stezenia weglo¬ wodoru i wartosci pH pozywki w zakresie 0,1—1,0% i od- 60 powiednio 4—5 podczas etapów inkubacji mikroorga¬ nizmu i dodawania substratu powoduje bardzo szybkie rozmnozenie mikroorganizmu na drodze proliferacji da stezenia 20—35% w pozywce i zwieksza szybkosc prze¬ miany substratu w produkt z 0,4 do 1,0 grama na godzine: 65 na 10 litrów pozywki. W metodzie Siha i wspólpracowni-92 530 6V ków osiaga sie maksymalnie stezenie mikroorganizmu rzedu 10% i szybkosc przemiany okolo 0,2 grama sub- stratu na godzine na 10 litrów pozywki. Stad tez sposób wedlug wynalazku pozwala na 2—3 krotny wzrost ste¬ zenia mikroorganizmu w etapie inkubacji i na przyspie¬ szenie mikroorganizmu w etapie inkubacji i na przyspie¬ szenie 2—5 razy przemiany substratu. Co wiecej, calko¬ wita ilosc substratu przerobionego w czasie procesu trwa¬ jacego 72 godziny osiaga wielkosc 35—80 gramów na litrów pozywki, co oznacza 7—15 krotny wzrost w po¬ równaniu ze znanym sposobem.Przyklad I. Inkubacje mikroorganizmu i prze¬ miane substratu przeprowadzono w pozywce odzywczej o nastepujacym skladzie: g/litr wody Na3(cytrynian) 3 KH2P04 (bezwodny) 5 NH4NOs (bezwodny) 2 MgS047H20 0,2 CaCl22HaO 0,1 Ekstraktdrozdzy 5 kwasny hydrolizatkazeiny 5 Glikoza 40 Jedno pelne oczko powierzchniowej hodowli Dipo- dascus uninucleatus z jednotygodniowego agaru zawie¬ rajacego ekstrakt slodowy stosuje sie do zaszczepienia 50 ml opisanej wyzej pozywki w kolbie Erlenmeyera o objetosci 250 ml. Kolbe inkubuje sie w temperaturze 26—32 °C i wystrzasa na rotacyjnej wstrzasarce z szyb¬ koscia 300 obrotów na minute w ciagu 36 godzin. Nas¬ tepnie 5% objetosci przenosi sie do 2,8 litrowej kolby Fernbacha zawierajacej 1 litr pozywki odzywczej o po¬ danym skladzie. Po 24 godinach inkubacji, kiedy osiag¬ nieto co najmniej 25% ciala stalego, do kazdej kolby Fern¬ bacha dodaje sie co 8 godzin w ciagu nastepnych 3 dni po 400 mg sproszkowanego 2- (6'-karbometoksyheksylo)-cy- klopentanotrionu-1, 3, 4.Podczas procesu przemiany wartosc pH pozywki utrzy¬ muje sie w zakresie 4,2—4,5 za pomoca IM roztworu KH2P04, a stezenie glukozy utrzymuje sie w zakresie 0,1—0,4% za pomoca okresowego dodawania glukozy.Stopien przemiany 2- (6'-karbometoksyheksylo)-cyklopen- tanotrionu-1, 3, 4 w 2-(6'-karbometoksy)-4 (R)-hydroksy- cyklopentanodion-1, 3 bada sie okresowo za pomoca ek¬ strakcji próbki brzeczki 0,5 objetoscia octanu etylu i na- kraplania pozostalosci w postaci zawiesiny w acetonie na plytke do chromatografii cienkowarstwowej. Stosuje sie uklad rozpuszczalników o skladzie: 110 ml octanu etylu, 50 ml izooktanu i 20 ml kwasu octowego. Plamy substratu i produktu wykrywa sie za pomoca krótkich fal ultrafio¬ letu. Po uplywie 72 godzin od chwili dodania pierwszych porcji substratu komórki oddziela sie przez odsaczenie.Sklarowany roztwór nasyca sie NaCl, zakwasza HC1 do wartosci pH 2,0 i ekstrahuje jedna objetoscia octanu etylu.Warstwe octanu etylu oddziela sie i odparowuje do sucha.W wyniku rekrystalizacji pozostalosci z ukladu octan etylu — frakcja ropy naftowej wrzaca w temperaturze —135 °C utrzymuje sie 2,8 g produktu o temperaturze 80—86°C i (D25+20,3 (CHC13). W wyniku zastosowa¬ nia 2- (6'-karbometoksyheksylo)-3-metoksycyklopenten-2- dionu-1, 4 zamiast 2-(6/-karbometoksyheksylo)-cyklopen tanotrionu-1, 3, 4 otrzymuje sie z taka sama wydajnoscia 2'- (6'-karbometoksyheksylo)-4(R)-hydroksy-cyklopentano- dion-1, 3.Przyklad II. Sposób postepowania opisany w przykladzie I powtarza sie w fermentorze o pojemnosci 14 litrów. Do zaszczepienia 9 litrów pozywki znajdujacej sie w tanku fermentacyjnym o pojemnosci 14 litrów sluzy 1 litr 24 godzinnej hodowli Dipodascus uninucleatus w kolbie Fernbacha o pojemnosci 2,8 litra. Warunki pro¬ wadzenia fermentacji: temperatura 30°C, napowietrza¬ nie 5 litrów powietrza/min., mieszanie 300 obrotów na minute. Jezeli konieczna jest kontrola pienienia to sto¬ lo suje sie „antifoam" 130S. Po 24 godzinach inkubacji do¬ daje sie co 8 godzin w ciagu nastepnych 72 godzin 4 g sproszkowanego 2- (6'-karbometoksyheksylo)-cyklopentano- trionu-1, 3, 4.Podczas przemiany wartosc pH pozywki utrzymuje sie w zakresie 4,1—4,5 za pomoca IM roztworu KH2P04 a stezenie glukozy utrzymuje sie w zakresie 0,1—0,4% dodajac okresowo glukoze. Po uplywie 72 godzin od chwili dodania pierwszej porcji substratu komórki odsacza sie, a produkt 2- (6'-karbometoksyheksylo)-4 (R)-hydroksycy- klopentanodion-1, 3 izoluje sie w sposób podany w przy¬ kladzie I. Otrzymuje sie 25,0 g rekrystalizowanego pro¬ duktu o temperaturze topnienia 89,5—91 °C i (D25+19,l (CHC13). W przykladzie tym mozna stosowac jako sub- strat 2- (6'-karbometoksyheksylo)-3-metoksycyklopenten-2- dion-1, 4 i otrzymuje sie produkt z niezmieniona wydaj¬ noscia.Przyklad III. Powtarza sie postepowanie opisane w przykladzie II z tym, ze substrat rozpuszcza sie w dwu- metyloformamidzie (10 g w 20 ml dwumetyloformami- dzie) i dodaje w sposób ciagly do fermentatora z szyb¬ koscia 0,5 g/godzine. Roztwór zasilajacy doprowadza sie za pomoca teflonowego przewodu przymocowanego do pompy tlokowej. W celu unikniecia korodujacego wply¬ wu dwumetyloformamidu na przewody z tygonu lub gumy. Szybkosc przemiany prowadzonej z zastosowaniem ciaglego zasilania jest wyraznie wieksza niz przemiany prowadzonej w porównaniu z 36 gramami w ciagu 70 godzin. 40 45 50 PL

Claims (12)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób mikrobiologicznego wytwarzania podstawio¬ nego w pozycji 2 4 (R)-hydroksycyklopentadionu-l, 3 na drodze przemiany podstawionego w pozycji 2 cyklo- pentanotrionu-1, 3, 4 lub podstawionego w pozycji o 3-alkoksycyklopenteno-2-dionu-l, 4 w podstawiony w pozycji 2 4(R)-hydroksycyklopentanodion-l, 3 za po¬ moca mikroorganizmu z klasy workowców Ascomycetes, znamienny tym, ze w pozywce o poczatkowym ste¬ zeniu weglowodoru 2—6% i poczatkowej wartosci pH 5—6 inkubuje sie mikroorganizm i utrzymuje sie stezenie weglowodoru na poziomie 0,1—1% i wartosc pH w za¬ kresie 4—5 do czasu osiagniecia stezenia mikroorganizmu w pozywce 20—35%, a nastepnie do pozywki dodaje sie 0,4—1,0 grama substratu na godzine na 10 litrów pozywki, przy czym podczas dodawania substratu utrzymuje sie stezenie weglowodoru w pozywce w zakresie 0,1—1,0% i wartosc pH w pozywce w zakresie 4—5. Q0

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie zwiazek o wzorze 1 lub 2 w którym L oznacza grupe etylenowa lub winylenowa, M oznacza grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla, j i k oznaczaja licz¬ by calkowite 0—4. 65

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako92 530 substrat stosuje sie 2-(6'-karbometoksyheksylo)-cyklopen- tanotrion-1, 3, 4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 2-(6/-k-xbometoksyheksylo)-3-raet;o- ksycyklopenten-2-dion-l,

4.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sub¬ strat dodaje sie z szybkoscia 0,5 grama na godzine na 10 litrów.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako weglowodór stosuje sie glukoze o stezeniu 0,1%.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ste¬ zenie weglowodoru utrzymuje sie stosujac okresowe za¬ silanie. *

8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ste¬ zenie weglowodoru utrzymuje sie stosujac ciagle zasilanie. 10 8

9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sto¬ suje sie pozywke zawierajaca 3 g cytrynianu sodowego, 5 g bezwodnego dwuwodorofosforanu potasowego, 2 g siarczanu amonowego, 0,2 g siedmiowodzianu chlorku magnezowego, 0,1 g dwuwodzianu chlorku wapniowe¬ go, 5 g ekstraktu drozdzy, 5 g kwasnego hydrolizatu ka¬ zeiny, 40 g glukozy i 1 litr wody.

10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wartosc pH utrzymuje sie w zakresie 4,2—4,7.

11. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wartosc pH utrzymuje sie na stalym poziomie za pomo- 1 M roztworu KH2P04.

12. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako mikroorganizm stosuje sie Dipodascus uninucleatus 0)l^(CH2)rL-(CH2)rCO2M o mor 1 (U^(CH^)rL-(CH2)k-C02M Q(3) o w om Jtetff 2 0 (iaf(cH^)rL-(CH^-C02M ltf» 0 Wzór 3 C02CH5 C02CH$ C02CH} 0 OCH Wzór 6 Errata lam 3, wiersz 49 jest: dwuwodororotofosforan powinno byc: dwuwodoroortofosforan lam 4, wiersz 21 i 22 jest: Asciomycetes powinno byc: Ascomycetes lam 4, wiersz 23 i 24 oraz 25 jest: 2 cyklopenysyetrionu-1, 3, 4 lub podstawionego w pozycji 2 3-alkokinotklo- penten powinno byc: 2 cyklopentanotrionu-1, 3, 4 lub podstawionego w pozycji 2 3-alko- -ksycyklopenten lam 4, wiersz 42 i 43 jest: loseum, Fusarium decemcellulore, Alternaria tenuis Gliocradium powinno byc: roseum, Fusarium decemcellulare, Alternaria tenuis, Gliocladium LZG Zaikl. Nit 3 w Pab. izam. 832-77 ntikl. 1110+20 e(gz. Cena 10 zl PL