PL91090B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 4-hy¬ droksycyklopentanodionów-l, 3 podstawionych w pozycji 2, które sa pólproduktami w syntezie naturalnych prosta- glandyn i ich analogów, a zwlaszcza sposobu wytwarzania 4-hydroksycyklopentanodionów-l, 3 podstawionych w pozycji 2 o wzorze 1, w którym R oznacza grupe metylo¬ wa lub etylowa. Sposobem wedlug wynaJazku otrzymuje sie zwiazki optycznie czynne.Prostoglandyny sa cyklicznymi, tlenowymi kwasami tluszczowymi o 20 atomach wegla, zawierajacymi w swojej strukturze szkielet kwasu prostanowego. Prostaglandyny i ichanalogi staly sieprzedmiotem duzego zainteresowania ze wzgledu na szerokie dzialanie fizjologiczne na uklad: sercowo-naczyniowy, oddechowy, wydzielania wewnetrz- nego, hemostatyczny, nerwowy, reprodukcyjny, nerkowy i zoladkowo-jelitowy u ssaków, w tym takze i u ludzi.Ilosc naturalnych prostoglandyn jest bardzo ograniczo¬ na, a sposób ich wytwarzania wymaga wielu dlugich i zmudnych zabiegów i pozwala na uzyskiwanie jedynie bardzo malych ilosciach produktu. Dalsza niedogodnoscia stosowanych obecnie metod otrzymywania prostaglandyn i ich analogów jest koniecznosc dokonywania rozdzialu w celu otrzymywania pozadanych, optycznie czynnych zwiazków.Znany sposób redukcji grupy ketonowej w pozycji 4, zwiazku o wzorze 1 polega na uwodornieniu w obecnosci palladu osadzonego na weglu, otrzymany produkt jest racematem.Celem sposobu wedlug wynalazku jest sposób wytwa¬ rzania waznych pólproduktów do syntery prostaglandyn i ich analogów, posiadajacych pozadana czynnosc opty¬ czna.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 4-hy¬ droksycyklopentanodionów-l,3 podstawionych w pozycji 2 o wzorze 1, w którym R oznacza grupe metylowa lub etylowa, polegajacy na tym, ze zwiazek o wzorze 2, w któ¬ rym R ma wyzej podane znaczenie, poddaje sie dzialaniu fermentujacego drobnoustroju Dipodascus uninucleatus, a nastepnie otrzymany produkt wydziela sie z mieszaniny reakcyjnej.Moze sie zdarzyc, ze fermentujacy drobnoustrój wytwa¬ rza aktywna esteraze, która powoduje czesciowa hydrolize grupy estrowej. W takim przypadku dzialanie esterazy mozna zahamowac przez dodaniedo pozywkifermentacyj¬ nej, niewielkiej ilosci alkoholu allilowego. W przeciwiens¬ twie do uwodorniania w obecnosci palladu osadzonego na weglu, sposób wedlug wynalazku pozwala uzyskac epimer 4(H) na drodze stereospecyficznego dzialania drobnous¬ troju w procesie fermentacji. Sposób ustalenia konfigura¬ cji przyjeto za Cahnem, Ingoldem i Prelogiem. Konfigura¬ cja ta jestpotrzebna dla konwersji w naturalneprostaglan¬ dyny. Przykladowa konwersja, w wyniku której uzyskuje sie prostaglandyne PGEi jest przedstawiona na schemacie 1.Na schemacie 1 przedstawiono konwersje zwiazku o wzorze 3 do zwiazku o wzorze 4 prowadzona sposobem wedlug wynalazku. Zwiazek owzorze 4mozna przeprowa¬ dzic w zwiazek o wzorze 3 w nastepujacy sposób: Do ochlodzonego do temperatury-11°C roztworu 102,4 mg (0,4 mola) estru metylowego hydroksydionu znad wo- 91 09091 090 przeprowadza Do ochlodzo] dorotlenku wapnia trójetyloaminy w 8 ml suchego cztero- wodorofuranu dodaje sie w atmosferze azotu mieszajac, w ciagu 5 minut 0,046 ml (0,4 mola) chlorku benzoilu.Otrzymany roztwór miesza sie w ciagu 35 minut w tempe¬ raturze -10°C. Nastepnie dodaje sie 4 mlmetanolu,miesza- 5 nine ogrzewa sie do temperatury pokojowej, wlewa do 60 ml wody i ekstrahuje czterokrotnie octanem etyluporcjami po 50 ml. Polaczone ekstrakty octanowe przemywa sie kolejno 10 ml 0,1-n kwasu solnego 10 ml wody, 10 ml nasyconego roztworu wodoroweglanu sodu, 10 ml nasyco- 10 nego roztworu chlorku sodu, suszynad siarczanemmagne¬ zu, anastepnie odparowuje sie rozpuszczalnikiem, uzysku¬ jac zwiazek o wzorze 5.KonwersjeJ£\Hazku o wzorze 5 w zwiazek o wzorze 6 e bez trudu w nastepujacy sposób: igo do temperatury -78°C, umieszczonego tu roztworu 50 mg (0,147 mola) zwiazku 1 suchego czterowodorofuranu dodaje sie mieszajac 1,5 molarny toluenowy roztwór dwuwodoro- bis(2-metoksyetoksy)-glinianu sodu o wzorze Na[AlH2(0- CH2CH20CH3)2_] w czterech równych proporcjach po 0,38 ml. w ciagu 15 minut. Otrzymany roztwór miesza sie w temperaturze -78°C w ciagu dalszych 30 minut. Naste¬ pnie dodaje sie 2 ml lodowatego kwasu octowego, ogrzewa mieszanine do temperatury pokojowej i wlewa do 40 ml wody, a otrzymanyroztwór ekstrahuje sie nastepnie 4x30 ml octanu etylu. Polaczone ekstrakty octanowe przemywa sie kolejno 10 ml nasyconego roztworu wodoroweglanu sodu i 10 ml nasyconego roztworu chlorku sodu, suszynad siarczanem magnezu i odparowuje octan etylu. Uzyskana pozostalosc w postaci oleju,rozpuszcza sie w 10 mlmiesza¬ niny kwas octowy-woda (75 : 25) i miesza w temperaturze pokojowej w ciagu 24 godzin. Nastepnie odparowuje sie kwas octowy i wode pod zmniejszonym cisnieniem. Uzy¬ skany oleisty produktrozpuszcza siew 10 ml octanu etylu, przemywa kolejno nasyconym roztworem wodoroweglanu sodu i nasyconym roztworem chlorku sodu, suszy nad siarczanem magnezu i nastepnie odparowuje rozpuszczal¬ nik uzyskujac zwiazek o wzorze 6.Konwersje zwiazku o wzorze 6 w zwiazek o wzorze 7 mozna przeprowadzic w sposób podany przez J. Siha i wspólpracowników w J.Am.Soc. 94,3643(1972). Uzyskuje sie jeden sterospecyficzny epimer 2/6-karbometoksyhe- ksylo(-4)R(-hydroksycyklopentanodion-l,3, który podda¬ je sie latwo konwersji w prostaglandyne z zachowaniem pozadanej konfiguracji.W nastepujacych przykladach stereochemie grupy hydro¬ ksylowej w pozycji 4 ustalono na podstawie badania di¬ chroizmu kolowego. Epimer R wykazuje ujemny efekt Cottona przy dlugosci fali 281 m\i[Q] x 10"3 -85°) i dodatni efekt Cottona przy dlugosci fali 262 m ji([Q] x 10-3 + 87°), charakterystycznej dla tego typuukladów.Konfiguracje te potwierdzono ponadto przez porównanie prostagladyny Ei(PGEi) z prostaglandyna PGEi, uzyskana sposobem opisanym powyzej z 2-/6-karbometoksyheksylo/-4/R/- hydroksycyklopentanodionu-1,3.Stwierdzono, ze istnieja róznice w skutecznosci dziala¬ nia pomiedzy poszczególnymi rzedami, rodzajami i gatun¬ kami drobnoustrojów z klasy Ascomycetes, w procesie redukowania funkcji karbonylowej w pozycji 4, opisanych 60 poprzednio zwiazków. Wzgledna skutecznosc poszczegól¬ nych drobnoustrojów w procesie redukcji mozna latwo zbadac stosujac opisany ponizej test biologiczny.Drobnoustrój zaszczepia sie na skosach z agaru Sabou- rauda lub innej odpowiedniej pozywceagaroweji inkubuje es 40 45 50 55 w temperaturze 25°C,w ciagujednego tygodnia. Doskosów dodaje sie 15 ml jalowej, destylowanej wody i zdrapuje z agaru zarodniki oraz hodowle wegetywna za pomoca jalowej igly. Zawiesine przenosi sie do kolby zawierajacej 50 ml pozywki sojowo-dekstrynowej, opisanej w dalszej czesci opisu i umieszcza kolbe w inkubatorze, w tempera¬ turze 25°C na wytrzasarce obrotowej o 210 obrotach na minute, na okres 24 godzin. Po zakonczeniutego pierwsze¬ go stadium posiewowego pobiera sie po 5 ml hodowli podpowierzchniowej i dodaje do trzech par kolb zawiera¬ jacych trzy rózne pozywki sojowo-dekstrozowa, cerelozo- wa z Edamina oraz dekstrynowa z wyciagiem kukurydzia¬ nym. Sklady powyzszych pozywek podane sa w dalszej czesci opisu. Kolby inkubujesie na wytrzasawce(w tempe¬ raturze 25°C, w ciagu 24-28 godzin. Do jednej z kolb z kazdej pary dodaje siepo okolo 25 mg cyklopentanotrio- nu-1,3 podstawionego w pozycji 2 w 0,2 ml dwumetylofor- mamidu. Do drugiej kolby z kazdej parydodaje sie po 0,25 ml dwumetyloformamidu, sa to kolby kontrolne. Wszyst¬ kie kolby wstrzasa sie w tych samych warunkach w ciagu 24 godzin, a nastepnie sporzadza opis charakterystyki wzrostu i zapisuje siewartosc pH. Zawartosc kazdej z kolb ekstrahuje sie jednokrotnie octanem etylu w objetosci równej objetosci brzeczki, a nastepnie odparowuje sie rozpuszczalnik ogrzewajac na lazni wodnej w temperatu¬ rze okolo 60°C.Kazda z porcji rozpuszcza sie w 1 ml acetonu i poddaje chromatografii cienkowarstwowej. Wszystkie próbki chromatografuje sie na plytkach pokrytych zelem krze¬ mionkowym G, stosujac do rozwijania odpowiedni uklad, korzystnie mieszanine octanu etylu, kwasu octowego, izo- oktanu i wody (110 : 20 : 50 : 100). Plytki po wywolaniu obserwuje sie w swietle nadfioletowym. Badane zwiazki posiadaja nastepujace wartosci Rf: zwiazek o wzorze 3 - 0,48 zwiazek o wzorze 8-0,57 zwiazek o wzorze 9 - 0,18 Do testu oraz do opisanej ponizej fermentacji, stosuje sie pozywki o nastepujacym skladzie: Sojowo-dekstrozowa maka sojowa - 5 g dekstroza - 20 g chlorek sodowy - 5 g fosforandwupotasowy- 5g drozdze - 5 g woda - 1 litr wartoscpHskorygowanado- 7,0.Pozywke sterylizuje sie w autoklawie w ciagu 15 minut, pod cisnieniem okolo 1,1 kg/cm2.Cerelozowa z Edamina cereloza (surowa dekstroza)- 50 g Edamina (enzymatyczny hydrolizat proteiny z mleka, produkowanej przez Sheffield FarmsCo) - 20 g wyciag namokowykukurydzy - 5 ml woda - 1 litr wartosc pH skorygowanado - 7,0.Dekstrynowa z wyciagiem kukurydzy dekstryna - 10 g wyciag namokowy kukurydzy- 80 g fosforan jednopotasowy -Ig chloreksodowy - 5 g woda - 1 litr wartosc pH skorygowana do - 7,0.91 090 Pozywke sterylizuje siew autoklawie, w ciagu 30 minut, pod cisnieniem okolo 1,1 kg/cmi Opisane powyzej postepowanie podczas testu, stosowa¬ ne pozywki oraz przykladyprowadzenia fermentacji sluza jedynie do zilustrowania wynalazku imogaulegacrozmai¬ tym zmianom. Stad tez mozna stosowac inne, rózne od wymienionych w opisie, drobnoustroje zdolne do reduko¬ wania grupy karbonylowej oraz inne zródla azotu iwegla, np. make kukurydziana, make owsiana, wyciag miesny, hydrolizaty bialkowe, a takze sacharoze, glukoze, maltaze, skrobie i melase zamiast dekstryny. Warunki w jakich prowadzi sie fermentacje moga takze ulegac zmianie, np. czas dodawania substratu do pozywki, poczatkowa war¬ tosc pH, która moze siezmieniac w zakresie od 5,0-7,5 oraz ilosc substratu i szybkosc mieszania.Produkty wytwarzane wedlug podanych ponizej przy¬ kladów identyfikowano stosujac badania widm w nadfio¬ lecie i podczerwieni, magnetycznego rezonansu jadrowego i chromatografie cienkowarstwowa.Przyklad I. 2-/6-karbometoksyheksylo/4-/R/-hy- droksycyklopentanodion-1,3, o wzorze 4 wytwarza sie we¬ dlug schematu 2.A. Fermentacja. Wzrost powierzchniowy z tygodniowej hodowli na skosach agarowych drobnoustroju Dipodascus uninucleatus, który mozna otrzymac z Northern Regional Research Laboratory Peoria Illinois, zawiesza sie w 5 ml 0,85% roztworu chlorku sodowego. Porcjepo 2ml zawiesi¬ ny stosuje sie do zaszczepienia 50 ml pozywki sojowo-de- kstrozowej umieszczonej w kolbach Erlenmeyera o obje¬ tosci 250 ml (stadium F-l). Kolby inkubuje sie w ciagu 24 godzin, w temperaturze 25°C, na wytrzasarce obrotowej przy 250 obrotach na minute i skoku okolo 50 mm, a naste¬ pnie po 10% zawartosci kolb przenosi sie do czterechkolb Erlenmayera o objetosci 2 1, zawierajacych po 500 ml pozywki sojowo-dekstrozowej (stadium F-2). Po 24 godzi¬ nach inkubacji na wytrzasarce obrotowej do kazdej kolby dodaje sie po 250 mg 2-(6-karbometoksyheksylo)cyklo- pentanotrionu-1,3,4 (wzór 3) (J. Katsube, M. Matsui, J. Agr.Biol. Chem. 33,1078 (1969)), rozpuszczonego w 2 ml dwu- metyloformamidu. Kolby w stadium F-2 inkubuje sie w ciagu dodatkowych 24 godzin w warunkach takich samych jak w stadium F-l.B. Izolacja. Po uplywie 24 godzin od chwili dodania 2-karbometoksyheksylocyklopentanotrionu-l,4,3 (wzór 3) usuwa sie komórki metoda odwirowania. Wartosc pH supernatantu doprowadza sie za pomoca 6-n kwasu solne¬ go do 2,0 i ekstrahuje wyczerpujaco trzemaporcjami po 1,5 litra octanu etylu. Ekstrakt octowy suszy sie nad siarcza¬ nem sodu i odparowuje do uzyskania oleistej pozostalosci.Pozostalosc rozpuszcza sie w 5 ml mieszaniny benzen-oc- tan etylu (1:1) i wprowadza na kolumnechromatograficz¬ na owymiarach 2,5 x 30 cmwypelniona mieszanine kwasu krzemowego i celitu w stosunku 85 :15. Zwiazekeluuje sie zbierajac frakcje po 7 ml. Jako eluent stosuje sie mieszani¬ ne w komorze mieszania 500 ml mieszaniny octan etylu - benzen w stosunku 1 : 1, a w zbiorniku 500 ml octanu etylu. Frakcje 25-104 zawierajace pozadany produktlaczy sie i odparowuje do sucha uzyskujac 1,2 g krystalicznej pozostalosci. Po rekrystalizacji z mieszaniny octan etylu- eter naftowy, uzyskuje sie 750 mg 2-karbometoksyheksy- lo-4/R/-hydroksycyloklopentanodionu-l,3 (wzór 4) o tem¬ peraturze topnienia 90-92°C; skrecalnosci wlasciwej [a]"o = + 19,93°; (ci = l,02,CHCl3);X'lkmaxprzydlugoscifali272 6 m/n (n =23500) dichroizm kolowy [6 z 10^ = -85° przy dlugosci fali = 281 m/ui [0] X 10"3 = +87°przydlugosci fali 262 m/u.Przyklad II. 2-(6,-karboetoksyheksylo)-4/R/-hydro- ksycyklopentanodion-1,3 (wzór 9) wytwarza sie wedlug schematu.A. Fermentacja. Wzrost powierzchniowy z tygodniowej hodowli Schizosccharomyces pombe CBS 352 na skosach agarowych zawiesza sie w 5 ml 0,5% roztworu chlorku sodowego. Porcje po 2 ml zawiesiny stosuje sie do zaszcze¬ pienia 50 ml pozywki sojowo-dekstrozowej umieszczonej w kolbie Erlenmeyera o objetosci 250 ml (stadium F-l).Kolby inkubujesiew ciagu 24 godzin w temperaturze 25°C, nawytrzasarceobrotowej o 250 obrotachna minuteiskoku okolo 50 mm, a nastepnie 10% zawartosci przenosi sie do kolby Erlenmeyera o objetosci 2 litrów, zawierajacej 500 ml pozywki sojowo-dekstrozowej (stadium F-2). Po 24 godzinach inkubowania na wytrzasarce obrotowej dodaje sie 250 mg2-(6,-karboetoksyheksylo)cyklopentanotrionu- 1,3,4 o wzorze 8 (J. Katsube, M. Matsui J. Agr.Biol. Chem. 33, 1078, 1969) rozpuszczonego w 2 ml dwumetyloforma- midu. Kolbe w stadium F-2 inkubuje sie w ciagu dalszych 24 godzinw warunkach takich samych jak w stadium F-1.B. Izolacja. Po uplywie 24 godzin od chwili dodania trionu (wzór 8) usuwa sie komórki drozdzowe na drodze odwirowania. Wartosc pH supernatantu doprowadza sie za pomoca 6-n kwasu solnego do 2 i ekstrahuje wyczerpu¬ jaco 3 razy po 500 ml octanu etylu. Ekstrakt octanowy suszy sie nad siarczanem sodu i odparowuje rozpuszczal- nik, az do uzyskania oleistej pozostalosci. Pozostalosc rozpuszcza sie w 2 ml mieszaniny benzen-octan etylu w stosunku 1:1 i wprowadza naszczytkolumnychromato¬ graficznej o wymiarach 2,5 x 25 cm wypelnionej mieszani¬ na kwasu krzemowego i celitu wstosunku 85 :15. Zwiazek eluuje sie zbierajac frakcje po 7 ml. Jako eluentstosuje sie mieszanine octanu etylu i benzenu w gradiencie stezen, umieszczajac w komorze mieszania 300 ml mieszaniny octanu etylu i benzenu (1:1), a w zbiorniku 300 ml octanu etylu. Frakcje 19-31 laczy sie i zateza uzyskujac 39 mg 40 zwiazku o wzorze 9. Temperaturatopnienia 83-85°C; skre- calnosc wlasciwa 25 [a]MD + 14° (c = 0,47, CHC13); ^mw przy dlugosci fali 272 m/|i (e = 20000).Sposobem wedlug wynalazku uzyskuje sie pozadane, optycznie czynne, podstawione wpozycji2,4-hydroksycy- 45 klopentanodiony-1,3 z wysoka wydajnoscia, wynoszacana ogól 70-80% konwersji. Jest oczywiste, ze zmiany we wzajemnych proporcjach i ilosciach reagentów moga wy¬ wierac korzystny lub niekorzystny wplyw na wydajnosc pozadanegoproduktu ijestzrozumiale, zeproporcje i ilosci 50 reagentów podane w przedstawionych przykladach nie sa wielkosciami niezbednymi dla uzyskania pozadanych zwiazków. 55 PL

Claims (2)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania 4-hydroksycyklopentanodionów- 1, 3, podstawionych w pozycji 2 o wzorze 1, w którym R oznacza grupe metylowa lubetylowa,znamiennytym,ze 60 zwiazek wyjsciowy o wzorze 2, w którym R ma wyzej podane znaczenie poddaje sie dzialaniu fermentujacego drobnoustroju Dipodascus uninucleatus i z mieszaniny reakcyjnej wydziela sie otrzymany produkt.91 090 o HO O CO,R lVzdrt O II er o o CO,R iTizór 291090 Wzor 3 C02CH3 C0XH 2un3 Wzór 4 O-CO-0 C02CH3 C02CH3 C02CH3 HO Wzor 7 Schemat 191 090 Wzor 3 C02CH3 C02CH3 Wzor 4 Schemat

2. HO 0 /C02C2H5 C02C2H5 wzor g Schemat 3 Sklad wykonano w DSP, zam. 2245/ZC Druk w UPPRL, naklad 125 + 20 egz. Cena zl 10,- PL