DE2454364A1

DE2454364A1 - Cobalaminderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE2454364A1
Application number: DE19742454364
Authority: DE
Inventors: Jean Boige
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1970-10-28
Filing date: 1974-11-15
Publication date: 1975-07-24
Also published as: DE2153873A1

Description

53, avenue Vercingetorix
Aulnay-sous-Bois/Frankreich

Unser Zeichen: B 1504

Cobalaminderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre

Verwendung als Arzneimittel, Zusatz zu Patent ;...(Aktenzeichen: P 21 53 873.8-44)

Die Erfindung betrifft neue Hydroxocobalaminderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Therapeutika.

In dem Hauptpatent sind Derivate von Hydroxocobalamin und Aminosäuren beschrieben, welche Komplexe bilden, in denen die Hydroxylgruppe des Hydroxocobalamins durch den Aminorest der Aminosäure blockiert oder ersetzt ist.

Die zur Herstellung dieser Komplexe verwendeten Amino- säuren bestehen gemäß dem Hauptpatent insbesondere aus Glykokoll, a-Alanin, ß-Alanin, Asparaginsäure und Glutaminsäure . .

Dr»Ha/Mk

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Die Komplexe gemäß dem Hauptpatent unterscheiden sich von einfachen Salzen aus Hydroxocobalamin und Aminosäure im wesentlichen durch die folgenden Punkte:

a) Die Entwicklung des pH-Werts, wie sie sich aus den Neutralisationskurven von die Komplexe enthaltenden wässrigen Lösungen ergibt, zeigt, daß das Hydroxocobalamin nicht als freie Base vorliegt.

Die wässrige Lösung jeder der neuen Verbindungen zeigt einen pH-Wert nahe 7, und wenn man bis zu einem pH-Wert von 9,5 alkalisch macht und anschliessend wieder bis zu .einem pH-Wert von 4 ansäuert, stellt man keinen Absatz fest, wie er sonst den einmal mit freiem Hydroxocobalamin und zum andern mit der freien Aminosäure beobachteten Pufferzonen entsprechen würde. Vielmehr stellt man fest, daß die Aminogruppe der Aminosäure durch die Hydroxylgruppe. des Hydroxocobalamins blockiert oder komplsx gebunden ist.

b) Läßt man die Komplexe aus Aminosäure und Hydroxocobalamin in neutralem oder schwach alkalischem Medium stehen, stellt man keine sofortige Hydrolyse fest, vielmehr variiert die Hydrolysegeschwindigkeit je nach der Art der Komplexe.

Die Tatsache, daß diese Hydrolyse nicht sofort eintritt, macht die Verwendung der in dem Hauptpatent beschriebenen Komplexe für therapeutische Zwecke interessant. Da nämlich Blut ein in natürlicher V/eise zu einem pH-Wert von 7,2 gepuffertes wässriges Medium darstellt, ermöglichen die in den Organismus parenteral eingeführten Komplexe einen vorteilhaften Verzögerungseffekt, indem das Hydroxocobalamin nur allmählich durch Hydrolyse freigesetzt wird.

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Die vorliegende Erfindung betrifft nun noch interessantere Komplexe aus Hydroxocobalamin und Aminosäuren.

-Gemäß der Erfindung kennzeichnen sich die Derivate aus Hydroxocobalamin und Aminosäure, die wie in dem Hauptpatent aus Komplexen bestehen, in denen die Hydroxylgruppe des Hydroxocobalamins durch die Aminofunktion einer Aminosäure blockiert oder ersetzt ist, dadurch, daß die Amino-? gruppe der Aminosäure von der Carboxylgruppe durch mehr als zwei Kohlenstoffatome getrennt ist.

Die erfindungsgemässen Derivate entsprechen der allgemeinen Formel X Co, NH-R-COOH, worin X Co dem Cobalamin entspricht und R eine Gruppe mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen bedeutet.

Gemäß dieser Formel ist die OH-Gruppe nicht durch die COOH-Gruppe versalzt, sondern durch die NH-Gruppe der Aminosäure substituiert worden. Diese Formel wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche belegt. .

Die Erfahrung hat gezeigt, daß solche Komplexe, die. auch "Aminosäure-Cobalichromkomplexe" genannt werden können, in neutralem und leicht alkalischem Mlilieu noch stabiler sind als die in dem Hauptpatent ausdrücklich beschriebenen Derivate. Diese neuen Komplexe besitzen außerdem eine geringe Hydrolysegeschwindigkeit in saurem Medium. Diese Eigenschaft ist deshalb bemerkenswert, weil sie die Verabreichung der die Komplexe enthaltenden Lösungen auf oralem Wege gestattet, ohne daß diese Komplexe während ihres Aufenthalts im Magen hydrolysiert werden.

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Gemäß einer vorteilhaften Ausführningsform der Erfindung befinden sich die Aminogruppe und die Carboxylgruppe der Aminosäure an entgegengesetzten Enden der Molekülkette der Aminosäure.

Die mit diesen Aminosäuren erhaltenen Komplexe können in Lösung mehrere Tage stabil bleiben.

Das trifft z.B. für Komplexe zu, die als Aminosäure die Amino-4-buttersäure oder die Aminocapronsäure enthalten.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung der Komplexe aus Hydroxocobalamin und den vorgenannten Aminosäuren, bei welchem in an sich bekannter Weise man eine Aminosäure in wässriger Lösung mit dem Hydroxocobalamin reagieren läßt, worauf man, durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels die Kristallisation bewirkt.

Dieses Verfahren kennzeichnet sich gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch, daß man einen Überschuß an Aminosäure verwendet und daß der pH-Wert des Reaktionsmediums auf einem Wert zwischen etwa 6,2 und 8,6 gehalten wird.

Infolge der Verwendung eines Überschusses an Aminosäure und der Aufrechterhaltung des pH-Werts auf einem Wert zwischen 6,2 und 8,6, d.h. nahe am isoelektrischen Punkt des Hydroxocobalamins, vermeidet man die Bildung von Hydroxocobalaminsalzen über die Säuregruppe der Aminosäuren.

Nachstehend werden die physikochemischen Eigenschaften der erfindungsgemässen Komplexe aus Hydroxocobalamin

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und Aminosäuren näher beschrieben. Zum Vergleich werden auch die entsprechenden Eigenschaften der Komplexe gemäß dem Hauptpatent angegeben.

1) Stabilität der Komplexe in wässriger Lösung

Dieser Versuch wurde so durchgeführt, daß man die Entwicklung des Absorptionsspektrum der Lösungen im Ultraviolett verfolgte. Das Absorptionsmaxiraum einer einen nicht·hydrolisierten Komplex enthaltenden Lösung liegt in der Regel bei 359 mμ . Wenn der Komplex vollständig hydrolisiert ist, liegt das Absorptionsmaximum bei 351 myu'und die Absorption beträgt 77% der für den nicht hydrolisierten Komplex beobachteten. Das Absorptionsmaximum bei 351 mu entspricht auch dem des Hydroxocobalamins im ionisierten Zustand.

Die nachstehende Tabelle gibt die für verschiedene, tausend Mikrogramm Komplex pro ecm enthaltende Lösungen mit einem pH-Wert 2 erhaltenen Ergebnisse wieder.

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verflosse ne Zeit bis zur Messung	Glykokoll*	A	Art der Aminosäure des Koir , [Asparagin· α-Alanin! ß-Alanin !säure*	A	L	A i	L	A	iplexes Amino-4- butters.	A	Aminoca pronsäure	A	1415 1410
O	L	1485	L"	1365	359	146c			L	1490	L	1460 !	1360 j
1 h	359		358				351	1323	358		359	i	1350
3 h		1525		1540	37,33	1357						1450
5 h	351		351		356	1340				1480 1430 1405	358 35750 355,53 3^,50	1460
24 h				„_„.	351 351	1418 1455	„.—~_.		357,5C	1500	351
36 h									^50 355,50		351
3 Tage									351
6 Tage				1540	351	1460	351	1320
nach voll ständiger Hydrolyse		1525
351	351

Die Buchstaben L und A bezeichnen in dieser Tabelle die Wellenlänge in Millimikron des Absorptionsmaximums bzw. die entsprechende Absorption. Die Sternchen bezeichnen die in dem Hauptpatent beschriebenen Komplexe.

Die Ergebnisse der Tabelle zeigen somit, daß für die Komplexe aus Hydroxocobalamin und Aminosäuren wie Glykokoll, a-Alanin und Asparaginsäure die Hydrolyse bei einem pH-Wert 2 sehr schnell verläuft. Dieses Ergebnis scheint dadurch bedingt zu sein, daß in diesen Aminosäuren die Aminogruppe sich zu der Carboxylgruppe in α-Stellung befindet.

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Für den Komplex aus Hydroxocobalamin und ß-Alanin ist die Hydrolyse erst nach 36 Stunden vollständig.

-Bei den erfindungsgemassen Komplexen ist die Hydrolyse erst nach drei Tagen vollständig; dieses Ergebnis ist offenbar dadurch bedingt, daß in der Amino-4-buttersäure und in der Aminocapronsäure die Aminogruppe von der Carboxylgruppe durch mehr als zwei Kohlenstoffatomen getrennt ist.

Außerdem befinden sich im Fall der Aminocapronsäure die -NH₂-Gruppe und -COOH-Gruppe an entgegengesetzten Enden des Moleküls. Diese Besonderheit scheint somit für die Stabilität der in Lösung befindlichen Komplexe ebenfalls günstig zu sein.

2) Verfolgung der pH-Wertkurven der Komplexe aus Hydroxocobalamin und Aminosäuren enthaltenden wässrigen Lösungen

Die in Fig. 1 bis 6 aufgetragenen pH-Wertkurven wurden mit 500 ecm 1000 Mikrogramm pro ecm von Komplexen aus Hydroxocobalamin und Aminosäuren enthaltenden Lösungen mit einem pH-Wert 7 erhalten.

Fig. 1 entspricht dem Komplex aus Glykokoll und Hydroxocobalamin; darin ist:

Kurve 1 die unmittelbar nach Herstellung der Lösung erhaltene pH-Wertkurve; die Hydrolyse des Komplexes hat noch nicht begonnen,

die Kurve 2 bzw. 3, die nach 24 Stunden bzw. 5 Tagen erhaltene Kurve; diese beiden Kurven zeigen,daß die Hydrolyse

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nach 24 Stunden praktisch vollständig ist.

Fig.2 betrifft den a-Alanin-Hydroxocobalaminkomplex, wobei die Kurven 4, 5 und 6 nacheinander einmal unmittelbar nach Herstellung der Lösung, dann nach 24 Stunden und dann nach 5 Tagen erhalten wurden.

Wie man sieht ist die Hydrolyse nach 24 Stunden (Kurve 5) praktisch vollständig.

Fig. 3 betrifft den Komplex aus ß-Alanin und Hydroxocobalamin, wobei die Kurven 7, 8 und 9 ebenfalls unmittelbar nach Herstellung der Lösung, nach 24 Stunden und nach 5 Tagen erhalten wurden; wie man sieht beträgt die Hydrolyse nach 24 Stunden (Kurve 8) erst etwa 30%.

Fig. 4 entspricht dem Komplex aus Amino-4-buttersäure-Hydroxocobalamin; die pH-Wertkurven 10,11 und 12 wurden unmittelbar nach der Herstellung, nach 24 Stunden und nach 3 Tagen aufgezeichnet und zeigen, daß die Hydrolyse nach 24 Stunden nur schwach ist (siehe Kurve 11).

In Fig. 5» welche den Komplex aus Aminocapronsäure und Hydroxocbalamin betrifft, zeigen die pH-Wertkurven 13, 14 und 15, die unter den gleichen Bedingungen wie die Kurven von Fig. 4 erhalten wurden, daß die Hydrolyse in beiden Fällen nahezu gleich verläuft.

In der auf den Komplex aus Asparaginsäure und Hydroxocobalamin bezogenen Figur 6 zeigen die unmittelbar nach der Herstellung der Lösung bzw. nach 1 Stunde bzw. nach 24 Stunden erstellten Kurven 16, 17 und 18, das Hydro-'lyse bereits nach 1 Stunde deutlich eingetreten ist und

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nach 24 Stunden vollständig ist.·

In allen Fällen stellt man das Fehlen von durch OH- bzw. NH-Gruppen des Hydroxocobalamins bzw. der Aminosäure bedingten Stufen in den pH-Wertkurven .fest. Daraus kann geschlossen werden, daß diese beiden Gruppen verschwunden oder komplex gebunden worden sind.

Die einzig mögliche Formel für die Komplexe ist somit die folgende: ·

X Co, NH - R - COOH

worin die OH-Gruppe des Hydroxocobalamins durch die NH-Gruppe ersetzt wurde.

3) Quantitative Bestimmung des Stickstoffs der freien Aminogruppe der Komplexe aus Hydroxocobalamin und Aminosäuren in Lösung _________________________

Man kann in Lösung die freie Aminogruppe der Aminosäure der Komplexe mit Formaldehyd quantitativ bestimmen. Wenn der Komplex vollständig hydrolysiert ist, ist die Aminogruppe ebenfalls völlig frei und die quantitative Bestimmung muß theoretisch 1,9% Aminostickstoff,' bezogen auf das Gewicht der wasserfreien komplexe ergeben. Unter Berücksichtigung des Kristallwassers der Komplexe müßte der gefundene Stickstoffgehalt theoretisch gleich 1,6 Gew.-?6 betragen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben:

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- ίο -

verflossene Zeit bis zur Messung

Art der Aminosäure des Komplexes

Glykokoll

a-Alanin

ß-Ala-

nin

Amino-4-butter
säure

Amino-

apronsäure

Asparaginsäure

1 h

24 h

3 Tage

nach vollständiger Hydrolyse

0,6

1,2

1,8

0,75

1,5

1,8

0,37

0,6

1,6

0,6

0,8

1,1
1,8

0,6

0,7

1,1 1,8

0,92 1,48

1,7

Diese Ergebnisse zeigen, daß man etwas höhere Gehalte als die für die totale Hydrolyse berechneten erhält. Dieser höhere Wert erklärt sich wahrscheinlich durch den Einfluß der in dem Hydroxocobalamin anwesenden Phosphatgruppe. Diese Phosphatgruppe kann auch die Tatsache erklären, daß man ohne Hydrolyse einen bestimmten Restwert des Stickstoffgehalts findet, der theoretisch Null sein sollte.

Diese Ergebnisse zeigen jedoch, daß ohne Hydrolyse die Aminogruppe der Aminosäure und die basische OH-Gruppe des Hydroxocobalamins nicht in Erscheinung treten.

Diese Resultate bestätigen andererseits die geringe Hydrolysegeschwindigkeit der erfindungsgemässen Komplexe (Komplexe aus Amino-4-buttersäure bzw. Aminocapronsäure mit Hydroxocobalamin).

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Zur Herstellung der erfindungsgemässen Komplexe geht man im wesentlichen wie im Hauptpatent beschrieben vor.

Nachstehend wird ein Beispiel für die Herstellung einer ■wässrigen, einen Komplex aus Amino-4-buttersäure und Hydroxocobalamin enthaltenden Lösung gegeben.

Man löst 10g Hydroxocobalamin in 1000 ecm Wasser, gibt einen Überschuß an Amino-4-buttersäure (etwa 1,5 g) zu und stellt mit einer wässrigen, 10 normalen Natriumhydroxidlösung den pH-Wert des Gemischs auf einen Wert zwischen 6,2 und 8,6 ein.

Die so erhaltene Lösung bleibt mehrere Tage stabil.

Man kann aus dieser Lösung den kristallinen Komplex aus Hydroxocobalamin und Amino-4-buttersäure abtrennen, wenn man beispielsweise 6 Volumina Aceton zugibt und die Kristallisation in der Kälte vor sich gehen läßt.

Dank der geringen Hydrolysegeschwindigkeit der erfindungsgemässen Komplexe in basischem, neutralem und insbesondere in saurem Milieu besitzen diese Komplexe ein ausgeprägtes therapeutisches Interesse. '

Hydroxocobalamin wird nämlich nur sehr langsam im Organismus freigesetzt, so daß seine Wirkung während langer Zeit erhalten bleibt.

Diese Wirkung ist praktisch für alle pathologischen Zustände günstig, gegen die Hydroxocobalamin verabreicht wird.

Außerdem ermöglicht die Tatsache, daß die Hydrolyse der

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erfindungsgemässen Komplexe in saurem Milieu gering ist, die orale Verabreichung des Medikaments. Die für die totale Hydrolyse der erfindungsgemässen Komplexe in saurem Milieu erforderliche Zeit übersteigt nämlich bei weitem die Aufenthaltsdauer des Medikaments im Magen.

Das erfindungsgemässe Medikament kann beispielsweise in Form von trinkbaren Ampullen verabreicht werden, die zwischen 5 und 25 mg der aktiven Substanz enthalten.

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Claims

Patentansprüche

1/ Cobalaminderivate nach Patent Nr. ... (amtl.Aktenzeichen P 21 53 873.8-44), in denen die Hydroxylgruppe des Hydroxocobalamins durch die Aminogruppe einer Aminosäure blockiert oder ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppe in der Aminosäure von der Carboxylgruppe der Säure durch mehr als zwei Kohlenstoffatome getrennt ist.
2. Derivate nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß · die Aminogruppe und die Carboxylgruppe der Aminosäure sich an entgegengesetzten Enden der Molekülkette der Aminosäure befinden.
3. Derivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure des Komplexes aus Amino-4-buttersäure oder aus Aminocapronsäure besteht.
4. Verfahren zur Herstellung der Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man eine Aminosäure in wässriger Lösung mit dem Hydroxocobalamin reagieren läßt und dann durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eine Kristallisation bewirkt, dadurch gekenn- . zeichnet, daß man die Aminosäure in einem Überschuß verwendet und daß man den pH-Wert des Reaktionsmilieus · auf einem Wert zwischen etwa 6,2 und 8,6 hält.
5. Medikament, bestehend aus einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.und üblichen Hilfsstoffen.

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