DE2325196A1

DE2325196A1 - Verfahren zur herstellung eines standardisierbaren eiweissfreien extraktes aus haemolysiertem blut

Info

Publication number: DE2325196A1
Application number: DE2325196A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Julius Emil Boettger; Randolph Dr Riemschneider
Original assignee: BOETTGER KG PHARMAZEUTISCHE UN; BOETTGER KG PHARMAZEUTISCHE und KOSMETISCHE PRAEPARATE 1000 BERLIN
Current assignee: Boettger Pharmazeutische und Kosmetische Prae GmbH
Priority date: 1973-05-18
Filing date: 1973-05-18
Publication date: 1974-11-28
Also published as: JPS5416564B2; JPS506706A; DE2325196C2

Description

Verfahren zur Herstellung eines standardisierbaren eiweiß freien Extraktes aus hämolysiertem Blut Blut Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines standardisierbaren eiveißfreien ÆxtraRtes aus hämolysiertem Blut oder entsprechend behandelten Mark oder Organteilen von Säugetieren.
Es ist seit langem bekannt, dass derartige Extrakte eine die Zellatmung und die Aktivität des RES-Systems fördernde Wirkung haben.
Aus der DT-PS i 076 888 ist es bekannt, zur Enteiweißung ausschließlich Reagenzien zu verwenden, die nach der Behandlung wieder abgeschieden und entfernt werden müssen, da sie andernfalls eine nicht unerhebliche Hinderung der biologischen Aktivität des Extraktes bewirken wurden.
Die DT-OS 1 617 355 beschreibt dagegen eine physikalische Extraktionsmethode, die jedoch verhältnismäßig aufwendig ist und ebenso wie die Verwendung chemischer Nittel eine weit gehende Denaturierung des Zellinhaltes zur Folge hat.
Die vorliegende Erfindung vermeidet die Nachteile der bisher bekannten chemischen Methoden und die Anwendung physikalischer Methoden wie Elektrophorese, Ultraschallbehandlung, Dialyse, oder Elektrolyse, indem erfindungsgemäß das Hämolysat zunachst durch Zugabe einer Lösung von im Organismus vorhandenen Säuren bzw. deren Salze auf einen schwach sauren pH-Wert gebracht wird und anschließend durch Erhitzen im Wasserbad unter Rühren und anschließendem Filtrieren bzw. Zentrifugieren von Eiweißkörpern und Enzymen befreit und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft wird.
Da als Fällungsmittel ausschließlich Säuren herangezogen werden, die im Blut enthalten sind und auch in höherer Eonzentration keine Nebenwirkungen und Nachteile hinsichtlich der angestrebten Eigenschaften und Kennzahlen der Blutextrakte haben, entfällt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die spätere Entfernung der Fällungsmittel aus dem Extrakt. Die verwendeten Säuren verbleiben also im Extrakt und dienen später gleichzeitig der Pufferung.
Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen und der Beschreibung enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren geht von ungeruhrtem Blut frisch geschlachteter Rinder, Kälter, Schweine, Ferkel oder Pferde aus. Das Blut wird nach Entnahme sofort in Gegenwart von Konservierungsmitteln in der Kälte bei lemperaturen unter -eOc hämolysiert, wobei Einwirkungszeiten von wenigen Tagen bis zu 6 Monaten in Betracht kommen. Nach dem Auftauen wird das hämolysierte Blut mit Milchsäure und/oder Askorbinsäure auf PH 6 gebracht und zur Entfernung von Eiweiß stoffen und Enzymen kurze Zeit,, z. B. 15 Minuten auf 700 - 900C erhitzt.
Der über Kieselgel filtrierte und/oder zentrifugierte eiweißfreie Extrakt wird im Vakuum bei pH 6 zur Trockne eingeengt und zur Weiterverwendung in einer Pufferlösung von pH 6,6 -6,8 gelöst und steril filtriert. Die Menge der Pufferlösung wird so bemessen, dass der Bxtrak folgende Kennzahlen zeigt: pH 6.6 - 6.8 Trockenrückstand 40 mg/ml Stickstoff 1,2 mg/ml UV-Spektrum (Verdffinnung marx, 250 mp 1 : 100) Schulter bei 295-300 mpa Atmungssteigerungsfaktor 1, 8 - 2,5 Pyrogentest pyrogenfrei Sterilität keimfrei Aminosäuren Dünnschichtchromatogramm, praktisch immer gleich Die Praparate können in fester Form oder auch in Pufferlösungen aufbewahr werden. Sie sind injizierbar oder auch zur äußerlichen Anwendung geeignet.
Beispiel 1: 20 1 frisches ungerührtes Rinderblut werden auf dem Schlachthof mit 80 1 bidestilliertem Wasser, das 50 g Nipacombin B oder Nipagin M enthält (100 1 bei 0,05 X Konservierungsmittel), vermischt und in der Kälte in 10 l-Portionen aufbewahrt (minus 10-20°C), Das Hämolysat wird 5 - 10 Tage stehengelassen, bei Raumtemperatur aufgetaut und dann im Kolben unter Rührern durch Zusatz von lO%iger Milchsäure und/oder Askorbinsäure auf pH 6 gebracht und im schwach siedenden Wasserbad unter Rühren in einer Zeit von 5 - 30 Minuten auf 800C erhitzt. Nach sofortigem Abnutscheh über Kieselgel S (oder durch Zentrifugieren) werden 7 kg Filtrat (Zentrifugat) erhalten. Die klare Lösung wird im Rotationsvakuumverdampfer bei PH 6.0 zur Trockne eingeengt. Durch Auflösung in der geeigneten Menge Puffer von pH 6.6 - 6.8 wird ein Extrakt erhalten, der folgende Kennzahlen zeigt: pH 6.8 Trockenrückstand >40-mg/ml Stickstoff > 1,2 mg/ml UV-Spektrum (Verdünnung 250 mp i 1 : 100) Schulter bei 295 - 300 mr Atmungssteigerung ) 2,0 Pyrogentest pyrogenfrei Sterilität keimfrei RES-System aktiviert Beispiel 2: 500 1 pyrogenfreies Blut-Hämolysat (Schweine- u. Kälberblut) werden unter Rühren mit einem Gemisch aus Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure und/oder Askorbinsäure und/oder Glucur3nsäure im Verhältnis 1:3:o,5:2:o,1 auf pH 5,8 - 6,2 gebracht und in schwach siedendem Wasserbad auf 75° erhitzt. Die Aufarbeitung erfolgt wie beim Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines kontinuierlich arbeitenden Vakuumrotationsverdampfers.
Auch hier muß wie in Beispiel 1 auf pyrogenfreies Arbeiten geachtet werden. Anstatt einer Trockne wird sofort eine Lösung hergestellt, die die nachstehenden Kennzahlen aufweist: pH 6,6 - 7,0 Trockenrückstand 842 mg/ml Stickstoff 81,22 mg/ml UV-Spektrum (Verdünnung 250 mt 1 : 100) Schulter bei 295 - 300 Atmungssteigerung 22,2 (Faktor) Pyrogentest pyrogenfrei (Kaninchentest) Sterilität keimfrei Aminosäuren gemäß Standardchromatogramm RES-System aktiviert Das Konservierungsmittel Nipagin M wurde bereits vor der Hämolyse hinzugefügt. Die Gefäße, in denen die Hämolyse durchgeführt wurde, sind zur Pyrogenfreimachung auf 20° erhitzt worden. Zum Verdünnen wurde doppelt destilliertes pyrogenfreies steriles Wasser verwendet. Entsprechende Vorsichtsmaßnahmen werden auch während des weiteren Arbeitsganges - ebenso wie auch in Beispiel 1 - eingehalten.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines standardisierbaren eiveißfreien Extraktes aus hämolysiertem Blut oder entsprechend behandelten Mark oder Organteilen von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämolysat zunächst durch Zugabe einer Lösung von im Organismus vorhandenen Säuren bzw. deren Salze auf einen schwach sauren P-Wert gebracht wird und anschließend durch Erhitzen im Wasserbad unter Rühren und amschließendem Filtrieren bzw. Zentrifugieren von Eiweßkörpern und Enzymen befreit und unter vermindertem Druck zur Trockne zur Trockne eingedampft wird.

2. Verfahren nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, dass als Füllungsmittel Milchsäure, Askorbinsäure oder Essigsäure verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Enteiweißung 5 - 30 Minuten auf eine Temperatur von 50 - 95 0C erhitzt wird.