Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren atmungsfördernden Präparates für therapeutische Zwecke
Blut oder Serum (das heisst die von den Blutkörperchen befreite Blutflüssigkeit) sind schon sehr häufig zu therapeutischen Zwecken herangezogen worden. So wurden beispielsweise Blutübertragungen von Mensch zu Mensch vorgenommen oder es wurde Blut aus Blutkonserven bei schweren Erkrankungen an gewandt. Ferner hat man auch Patienten, selbst Blut entnommen, dieses Blut ausserhalb des Körpers, vorzugsweise mit ultraviolettem Licht, bestrahlt und dann reinjiziert.
Im Rahmen der sogenannten Reizkörpertherapie gelangte Tierblut zur äusserlichen und innerlichen Anwendung. Zu den speziellen Anwendungen' von Blut und seinen Bestandteilen gehören die Serumtherapie bei Infektionskrankheiten, die Verwendung einzelner Bluteiweissfraktionen, z. B. der Gammaglobuline oder des antihämophilen Globulins (AHG) bei Blutungs übeln, die Verwendung von Bogomoletzserum, sogenannter regenerierender Seren und dergleichen.
Blut oder Serum hat man auch bereits als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Hormonen verwendet, da diese in vielen Fällen in besonders grossen Mengen darin vorliegen und somit daraus leichter extrahiert und in reinerer Form gewonnen werden können als aus den Organen, in denen sie gebildet werden. So können beispielsweise gonadotrope Hormone aus dem Serum trächtiger Stuten gewonnen werden.
Es wurde nun versucht, weitere Stoffe mit hormonartigem Charakter im Blut aufzufinden und insbesondere Stoffe mit regenerierender Wirkung auf degenerative Prozesse nicht aus den Zellen oder Geweben, in denen sie gebildet werden, sondern aus dem Blut zu gewinnen, das diese Substanzen enthält und an den Ort ihrer Wirkung transportiert.
Es zeigte sich aber, dass es ausserordentlich schwierig ist, Stoffe mit regenerierender Wirkung auf degenerative bzw. chronisch entzündliche Prozesse im Blut nachzuweisen und daraus zu isolieren, da im Blut eine Vielzahl von Substanzen mit verschieden artigsten Wirkungen, die sich gegenseitig aufheben oder überdecken, enthalten ist.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel lung eines injizierbaren atmungsfördernden Präparates, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man tierisches Blut oder Blutplasma oder Blutzellen durch enzymatischen Eiweissabbau undfoder durch Behandlung mit einem niedermolekularen aliphatischen geradkettigen oder verzweigten Alkohol oder mit Säuren enteiweisst, das erhaltene Produkt, gegebenenfalls nach Durchführung einer Dialyse, schonend auf eine Konzentration von 10 bis 60 mg Trockensubstanz/ml einengt und dieses Konzentrat unter sterilen Bedingungen filtriert.
Als besonders geeignetes Ausgangsmaterial hat sich das Blut von jungen Schlachttieren erwiesen.
Es ist nicht erforderlich, das Vollblut dem erfin dungsgemässen Verfahren zu unterwerfen, man kann auch Blutzellen und Plasma einzeln verarbeiten. Es sei erwähnt, dass die Blutzellen (vorwiegend Ery- thorcyten) bekanntlich ein ausserordentlich billiges Ausgangsmaterial darstellen, da hierfür in den Schlachthöfen keine Verwendung besteht. Der atmungsfördernde Wirkstoff ist in Blutzellen und Plasma in etwa gleicher Konzentration enthalten. Man kann selbstverständlich auch die bei der getrennten Aufarbeitung dieser beiden Blutbestandteile erhalt tenen Produkte anschliessend vereinigen.
Die Trennung der Blutzellen vom Plasma kann in bekannter Weise erfolgen, z. B. indem man das Voll blut einer Vorbehandlung unterwirft, ehe es enteiweisst wird. So kann man beispielsweise das Blut mit Wasser hämolysieren oder mit Aceton behandeln und den dabei erhaltenen Niederschlag (Acetontrokkenblut) allein verwenden. Man kann es ferner sprüh trocknen oder durch Rühren defibrinieren.
Bei der Herstellung von Acetontrockenblut erhält man eine den Hauptanteil der Blutsalze enthaltende Acetonlösung und einen Niederschlag, der den Hauptanteil der Aktivität aufweist. Die peptische oder tryptische Verdauung des Blutes wird in bekannter Weise durch Zusatz von Pepsin bei einem pH Wert von etwa 2 bis 3 bzw. durch Zugabe von Trypsin bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 9 durchgeführt.
Die Enteiweissung mit den genannten Alkoholen oder mit Säuren stellt eine chemische Umwandlung dar, die im engen Zusammenhang mit der Denaturierung von Protein entsteht. Da dabei auch die Wirkstoffe, die man in konzentrierter Form zu gewinnen wünscht, zerstört oder in dem Eiweissniederschlag eingeschlossen werden könnten, müssen diese geschont werden und man arbeitet daher zweckmässig in grosser Verdünnung.
Um eine möglichst schonende und doch vollständige Enteiweissung zu erreichen, hat sich der vorhergehende enzymatische Abbau der Blutproteine z. B. mit Pesin oder Trypsin bewährt. Die anschliessende Enteiweissung des schon partiell enzymatisch abgebauten Produktes kann dann nicht mehr zu einer Schädigung der Wirkstoffe führen.
Zur Dialyse kann man jedes der bekannten und üblichen Dialysiermaterialien verwenden. Als besonders geeignet haben sich Cellophanschläuche erwiesen. Als Dialysiermedien dienen vorzugsweise Wasser und verdünnte Alkohole.
Für die Enteiweissung durch Fällung mit Alkohol len kommen z. B. Alkohole mit 2 bis 4 C-Atomen in Betracht. Zur Säurefällung verwendet man vorzugsweise Perchlorsäure, da diese anschliessend leicht mit alkoholischem Kaliumhydroxyd als Kaliumperchlorat abgeschieden und entfernt werden kann. Bei Verwendung von Trichloressigsäure als Fällungsmittel erfolgt die anschliessende Entfernung durch Ausäthern, wobei jedoch auch ein Teil des gesuchten Wirkstoffs entfernt wird, weshalb diese Säure für die Zwecke der Erfindung weniger gut geeignet ist.
Hat man Dialyse verwendet, dann ist es anschlie ssend nur erforderlich, die erhaltenen Dialysate schonend, z. B. im Vakuum, bei etwa 300 nicht übersteigenden Temperaturen einzuengen. Auch bei einer Enteiweissung durch fraktionierte Fällung mit Alkoholen wird die erhaltene Lösung nach dem Filtrieren lediglich im Vakuum bei etwa 22 bis 250 bis zu einem alkoholfreien Konzentrat eingeengt.
Im allgemeinen hat es sich als ausreichend erwiesen, wenn der nach der vollständigen Enteiweissung erhaltene und von den zur Enteiweissung verwendeten Mitteln befreite Rückstand auf eine Konzentration von 30 bis 60 mg Trockensubstanz/ml gebracht wird.
Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Endprodukte sind zwar beständig und können für eine ziemlich unbegrenzte Zeit gelagert werden, doch kann man ihnen auch zusätzlich ein Konservierungsmittel zufügen. Als Konservierungsmittel kommen vorzugsweise Phenol, Kresol und dergleichen in Betracht.
Die in den Präparaten enthaltenen atmungsfördernden Wirkstoffe sind niedermolekular. Bei den mit ihnen erzielten, weiter unten beschriebenen Wirkungen kann es sich demnach keinesfalls um modifizierte Serumwirkungen oder um unspezifische Eiweisswirkungen handeln. Die neuen Wirkstoffe unterscheiden sich von den bekannten im Blut transportierten und aus diesem gewonnenen Wirkstoffen grund sätzlich: Bei Testen in der Warburg-Apparatur bewirken die neuen atmungsfördernden Wirkstoffe bei Gewebshomogenaten eine nicht ausschliesslich subc stratbedingte Atmungssteigerung, die mit keiner der bisher aus Blut isolierten Substanzen auch nur entfernt erreicht werden kann.
Die beigefügte Zeichnung gibt die Wirkung eines erfindungsgemäss erhältlichen Präparats auf die Atmung von Gesamtleberhomogenat wieder. Die Messung erfolgte in einer Warburg-Apparatur bei 37O. Der Sauerstoffverbrauch wurde in seinem zeitlichen Verlauf manometrisch verfolgt. Es wurde Rat tenlieberhomogenat 1 : 4 mit Sörensenpuffer von pH 7,4 hergestellt. Als Zusatz wurden 0,2 ml eines erfindungsgemäss hergestellten Wirkstoffs (mit Sörensenpuffer auf pH 7,4 eingestellt) verwendet.
Temperierzeit 10 Min. Schüttelfrequenz = 100/Min.
In dieser Zeichnung bedeutet die Ordinate den Sauerstoffverbrauch in mm3 0 und die Abszisse die Testzeit in Minuten. Die Kurve x-x-x- wurde mit Rattenieberhomogenat allein und die Kurve o-o-o- mit Rattenleberhomogenat + 0,2 ml des erfindungsgemässen Wirkstoffs erhalten.
Wie aus dler Zeichnung ersichtlich, wurde nach 50 Min. eine Atmungssteigerung auf etwa den vierfachen Wert erzielt.
Die Ergebnisse lassen sich mit der üblichen biologischen Fehlerbreite von + 10 0/o reproduzieren.
Bisher wurde die biologische Oxydation von Adrenalin bestimmten Fermenten (z. B. Aminooxydasen, Polyphenoloxydasen) zugeschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass das Adrenalin ohne Mitwirkung eines Fermentes von den erfindungsgemäss erhaltenen niedermolekularen Wirkstoffen katalytisch oxydiert wird. Diese Eigenschaft kann zur Testung der Wirkstoffe ebenfalls herangezogen werden.
Die Messung erfolgt nach der schon oben beschriebenen manometrischen Technik nach Warburg, in Schüttelgefässen mit 0,4 ml normaler NaOH Lösung im Einsatz, 0,2 bis 0,4 ml des erfindungsgemässen Wirkstoffs und 0,6 ml einer 200 mgo/oigen Adrenalinbitartratlösung im Reaktionsraum bei 386 und einer Schüttelfrequenz von 80 bis 100/Min. Nach Durchströmen des Manometersystems mit Sauerstoff für 10 Min. und einer anschliessenden Temperatur ausgleichsperiode von 10 Min. wird für 2 Stunden der Sauerstoffverbrauch alle 10 bis 20 Minuten abgelesen:
Sauerstoffverbrauch in mm3 nach
1 Std. 2 Std.
Wirkstoff allein 7,1 9,8 Adrenalinlösung allein 1,4 3,9 Adrenalinlösung + Wirkstoff 134,2 172,8
Der Sauerstoffverbrauch ist proportional der Aktivität der erfindungsgemässen Wirkstoffe.
Eine Vorbehandlung des Blutes nach einer der Methoden a) bis c) hat sich als zweckmässig erwiesen. a) 2 Liter Blut von jungen Kälbern werden mit 6 Liter Aceton unter Rühren versetzt. Der entstandene Niederschlag wird von der klaren Acetonlösung dekantiert und nochmals mit 2 Liter Aceton verrührt.
Die Operation wird dann nochmals mit 2 Liter einer Aceton-Äther-Mischung 1:1 wiederholt, der Niederschlag scharf abzentrifugiert und in der Luft getrocknet. Man erhält so etwa 355 g eines Aceton-Trockenblutes, das man bei trockener und kühler Aufbewahrung ohne Aktivitätsverlust mehrere Monate lagern kann. b) Im Sprühturm schonend getrocknetes Kälber- blut lässt sich nach Zugabe von 5 Teilen destilliertem Wasser in gleicher Weise aufarbeiten wie Aceton Trockenblut nach a). c) 1 Liter frisch nach der Schlachtung entnomme- nes Kälberblut wird mit 1 Liter destilliertem Wasser versetzt, wobei Hämolyse eintritt. Die Lösung wird durch Grobfiltration von Fibrinresten befreit.
Beispiel 1
2 Liter des nach c) hämolysierten frischen Kälberbluts werden auf pH 8 eingestellt und mit 0,2 g hochgereinigtem Trypsin 24 Stunden bei 37O partiell verdaut. Nach Einstellung auf pH 7 wird, wie in Beispiel 1, eine quantitative Acetonfällung mit 6 Liter Aceton durchgeführt. Der Niederschlag wird nochmals mit 2 Liter Aceton, dann. mit 2 Liter Aceton Äther 1:1 verrührt, scharf abzentrifugiert und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 300-320 g Trockenprodukt, welches mit 4 bis 5 Teilen destilliertem Wasser verrührt und die so erhaltene Suspension gegen die gleiche Menge destillierten Wassers unter Verwendung eines Cellophanschlauches bei etwa 20 dialysiert wird. Die Dialyse wird so lange wiederholt, bis keine nennenswerten Mengen Stickstoff mehr in das Aussendialysat wandern.
Die vereinigten Aussendialysate werden im Vakuum bei einer Temperatur von 22 bis 250 auf 200 ml eingeengt. Das Trockengewicht dieser Lösung beträgt etwa 36 mglml.
Die Lösung ist nach Sterilfiltration und Zugabe eines Konservierungsmittels, z. B. Phenol oder Kresol, für die therapeutische Applikation geeignet. Sie enthält neben einem hohen Anteil an atmungsförderndem Wirkstoff noch die Abbauprodukte der Nucleinsäuren, Aminosäuren und Oligopeptide, die nach be kannten papierchromatographischen bzw. papierelektrophoretischen Methoden charakterisiert werden können.
Beispiel 2 Zu 500 mi frischem, durch Rühren defribrinier- tem Kälberblut werden bei + 20 innerhalb 1 Stunde langsam unter Rühren insgesamt 1000 ni 96'/o iger Alkohol zugesetzt. Das Rühren wird etwa 5 Stunden fortgesetzt und anschliessend wird durch Zentrifugie ren die alkoholische Lösung vom Rückstand getrennt.
Die alkoholische Lösung wird filtriert und im Vakuum bei einer maximalen Temperatur von 220 auf 100 ml alkoholfreies Konzentrat eingeengt. Der pH Wert wird auf 7 eingestellt. Dann wird in der Kälte die Lösung langsam unter Rühren durch Zusatz von Alkohol auf eine Konzentration von 80 Gew. 9/o Alkohol gebracht (hierfür sind etwa 400 ml Alkohol erforderlich) und 24 Stunden bei 00 stehengelassen.
Der dabei ausgeschiedene Eiweissniederschlag enthält praktisch keine atmungsfördernden Wirkstoffe und kann verworfen werden. Die alkoholische Lösung wird wieder auf 100 ml im Vakuum bis zur Alkoholffeiheit eingeengt und steril filtriert. Diese Lösung enthält 15 mg Trockensubstanzlral und besitzt eine Oefrierpunktserniedrigung von 1,18". Sie ist direkt für therapeutische Zwecke geeignet.
Beispiel 3
200 ml frisches, defibriniertes Kälberblut werden durch Zugabe von 200 mi destilliertem Wasser hämolysiert und anschliessend in der Kälte mit etwa 18 ml 600/obiger Perchlorsäure unter Rühren tropfenweise versetzt. Die Enteiweissung des Blutes ist vollständig, wenn die Perchlorsäure-Konzentration 0,4 bis 0,6n ist. Anschliessend wird noch 1 Stunde e in der Kälte gerührt, der entstandene Eiweissniederschlag abzentrifugiert und mit 0,4n Perchlorsäure gewaschen und die vereinigten Lösungen werden klar filtriert.
Die Lösung wird in der Kälte mit etwa 40 ml 5n KOH bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 7,2 bis 7,3 versetzt und durch Zugabe von etwa 50 absolutem Alkohol wird die Fällung des Kaliumperchlorats vervollständigt. Man lässt 24 Stunden bei 0O stehen, zentrifugiert oder filtriert die Lösung klar und dampft im Vakuum den Alkohol ab. Man erhält 175 ml der eiweissfreien Wirkstofflösung mit einem Trockengewicht von 17,4 mg/ml und einer Gefrier punkts, erniedrigung von 1,60.
Beispiel 4
Das durch Zentrifugieren gewonnene Plasma oder das Erythrocyten-Sediment wird nach der in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Arbeitsweise, zweckmässig nach Hämolyse, aufgearbeitet. Man erhält mit beiden Ausgangsmaterialien atmungsfördernde Produkte. Die beste Wirkung wird jedoch erreicht, wenn diese Produkte wieder vereinigt werden. Die nach der Arbeitsweise der Beispiele 1 bis 4 hergestellte Wirk stofflösung kann auf pH 5,5 eingestellt und mit nw Butanol wiederholt extrahiert werden, z. B. 100 ml Extrakt mit 8 mal 20 ml wassergesättigtem Butanol.
Der wässrige und der Butanol-Extrakt werden dann im Vakuum bei einer Temperatur von nicht über 200 zur Trockne gebracht und mit je 50 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Nach diesem Verfahren gehen etwa 15 bis 20 O/o der Trockensubstanz aus der wäss rigen Phase in den ButanolcExtrakt. Im m Warburg- Test sind beide Fraktionen wirksam.